CC BY
52
УДК 579.66:547.94
Л. М. Султанова (к.х.н., ст. преп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф. ), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), А. А. Шараева (асп.), С. С. Лиханова (студ.).
Исследование влияния предобработки субстрата глицерином на гидролиз и ферментацию лигноцеллюлозных отходов с помощью Streptomyces sp. К-7
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
L. M. Sultanova, V. V. Zorin, N. I. Petukhova, A. A. Sharaeva, S. S. Likhanova
Research of influence of substrate pretreatment by glycerol on the hydrolysis and digestion of lignocellulotic waste
by Streptomyces sp. К-7
Ufa State Petrolium Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (347)2431935, e-mail: [email protected]
Показано, что предобработка биомассы лигноцеллюлозных отходов (соломы, валежника, опилок, хвои) водно-солевыми растворами, содержащими 5—20 % глицерина (температура — 121 оС, давление — 98 кПа, время — 1 ч) и последующая промывка растительных субстратов водой приводит к существенному стимулированию роста целлюлолитической культуры Б^ер^шусев вр. К-7 при температуре 30 оС, увеличению выхода редуцирующих веществ и КМЦ-целлюлазной активности культуральной жидкости.
Ключевые слова: глицерин; лигноцеллюлоза; микроорганизмы; целлюлаза.
It has been shown, that pretreatment of lignocellulotic waste biomass (straw, tree fall, sawdust, needles) by saline water solutions containing 5-20 % of glycerol (temperature - 121 oC, pressure — 98 kPa, time — 1 hour) followed by water washing of plant material leads to the significant stimulation of cellulolytic culture Streptomyces sp. K-7 growth at 30 oC and increase of both reducing saccharides yield and carboxymethylcellulose-cellulase activity of culture broth.
Key words: cellulose; glycerol; lignocellulose; microorganisms.
Высококипящие водорастворимые органические соединения, такие как глицерин, перспективны для делигнификации лигноцеллюлозных отходов лесного и сельского хозяйства, используемых в различных биотехнологических процессах (получение биотоплив второго поколения, ферментов и других биологически активных веществ) 1'2. Удаление лигнина снижает токсичность субстратов для микроорганизмов 3 и делает возможной одновременную реализацию процессов ферментативного гидролиза растительной целлюлозы и биосинтеза целевого продукта 4.
Ранее нами было показано, что предобработка биомассы луговых трав с помощью 2 — 20 % водно-солевых растворов глицерина позволяют интенсифицировать рост и значительно увеличивают целлюлазную активность двух
Дата поступления 03.09.12
актиномицетных культур (К-2 и К-7), выделенных из почвы на среде Гетчинсона с фильтровальной бумагой в качестве единственного источника углерода 5.
В настоящей работе проведено исследование влияния подобной предобработки субстрата на гидролиз и ферментацию других видов лигноцеллюлозных отходов (соломы, валежника, опилок, хвои) с помощью наиболее активной культуры К-7, которая, по описанию морфологических и физиолого-биохимических свойств 6, оказалась близка к представителям рода БЬтерЬошусе$.
Предобработку биомассы растительных субстратов осуществляли 5, 10 и 20 %-ми водно-солевыми растворами глицерина в процессе стерилизации среды автоклавированием в течение 1 ч. После удаления жидкой фазы субстрат промывали стерильной водой и помеща-
ли в питательную среду для культивирования БЬтерЬотусе$ $р. К-7. В качестве контроля использовали растительные субстраты, не подвергнутые обработке глицерином.
В процессе глубинного культивирования на модифицированной среде Чапека при 30 оС было обнаружено, что предварительная обработка субстратов глицерином стимулировала рост исследуемых бактерий. Выход биомассы через 8 сут культивирования на среде с пре-добработанной лигноцеллюлозой был в 6— 8 раз выше, чем на среде без обработки субстратов глицерином (рис. 1).
1 / _ / / 1 1
/ / / =1 4
□ контроль (без обработки)
■ 5 % глицерина
■ 10 % глицерина
■ 20 % глицерина
Исследование процесса гидролиза карбок-симетилцеллюлозы (КМЦ) с помощью восьми-суточных препаратов культуральной жидкости показало, что ее КМЦ-целлюлазная активность резко увеличивается (в 13—24 раза) при росте на предобработанном субстрате по сравнению с активностью культуральной жидкости в случае роста микроорганизмов на непредоб-работанном субстрате.
3000 2500 2000 1500 1000 500 0
□ контроль (без обработки)
■ 5 % глицерина
■ 10 % глицерина
■ 20 % глицерина
солома опилки валежник хвоя
солома опилки валежник
Рис. 3. КМЦ-целлюлазная активность препаратов 8 суточной культуральной жидкости при росте Streptomyces sp. К-7 на лигноцеллюлозных субстратах
Рис. 1. Выход биомассы (в оптических единицах) культуры Streptomyces sp. К-7 при выращивании на лигноцеллюлозных субстратах в течение 8 сут
В результате исследования содержания редуцирующих веществ (РВ) в препаратах 8 суточной культуральной жидкости было обнаружено, что в контрольных вариантах (без предобработки субстратов глицерином) их уровень не превышает 54—74 мг/л (рис. 2). В тоже время при использовании в качестве субстрата для культивирования бактерий лигно-целлюлозных отходов, предварительно обработанных водными растворами глицерина, уровень РВ в среде существенно возрастает (в 8-11 раз).
700
600
500
та 400 я
т" 300 200 100 0
□ контроль(без обработки)
■ 5 % глицерина
■ 10 % глицерина
■ 20 % глицерина
солома опилки валежник хвоя
Рис. 2. Уровень РВ в 8 суточных культуральных жидкостях при росте Streptomyces sp. К-7 на лигноцеллюлозных субстратах
Наибольший эффект был достигнут при использовании в качестве субстрата соломы. Таким образом, предложенный способ использования глицерина для предобработки сырья при гетерофазной ферментации целлюлозосо-держащих твердых отходов позволяет интенсифицировать процессы гидролиза растительной целлюлозы и роста биомассы.
Экспериментальная часть
Культуры микроорганизмов выращивали на модифицированной среде Чапека 7, содержащей 1% биомассы луговых трав в качестве ростового субстрата. Для предобработки лиг-ноцеллюлозного субстрата в среду вносили глицерин (2-20 %) и автоклавировали при температуре 121 оС в течение 1 часа. По окончании процесса осуществляли 3-х кратную промывку субстрата стерильной водой 8, после чего помещали его в стерильную среду с инокулятом и инкубировали при температуре 30 оС в течение 10 сут. В контрольных экспериментах осуществляли культивирование микроорганизмов в среде, содержащей необработанную глицерином биомассу луговых трав, а также обработанную, но не отмытую от глицерина биомассу.
Рост микроорганизмов контролировали нефелометрически при длине волны 520 нм. Концентрацию редуцирующих Сахаров в куль-туральной жидкости определяли по методу Шомодьи-Нельсона 9. КМЦ-целлюлазную активность микроорганизмов определяли при температуре 30 оС по скорости образования РВ в реакционной смеси, содержащей 10 мл 1%-го раствора КМЦ в 0.2 М ацетатном буфере рН 5 и 10 мл культуральной жидкости. За единицу условной целлюлазной активности исследуемых микроорганизмов принимали количество фермента, образующее 1 мг глюкозы в инкубационной смеси за 30 ч 9. Белок в реакционной смеси оценивали методом Лоури 10.
Литература
1. FitzPatrick M., Champagne P., Cunningham M. F., Whitney R. A. // Bioresource Technol.— 2010.— V.101.- P.8915.
2. Alvira P., Tomas-Pejo E., Ballesteros M.,
Negro M. J. // Bioresource Technol.— 2010.— V.101.- P.4851.
3. Chen H., Jin S. // Enzyme Microbial. Technology.- 2006.- V.39.- P.1430.
4. Ch-Chang, V.S., Holtzapple, M. // Appl. Biochem. Biotechnol.- 2000.- V.84.- P.5.
5. Султанова Л. М., Зорин В. В., Петухова Н. И., Шараева А. А., Михайлова Т. Н., Федорова В. В. // Баш. хим. ж.- 2011.- Т.18, №4.- С.52.
6. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / L. R. Boone, R.W. Casten-holz.- N.Y.,Heidelberg. Berlin: Springer-Veriag, 2001.- Vol.
7. Руководство к практическим занятиям по микробиологии /под ред. Н. С. Егорова.- М: Изд-во МГУ.- 1983.- 215 с.
8. Chandra R. P., Bura R. Substrat Pretreatment: The Key to Effective Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosics.- Vancouver, Canada.- 2007.-P.90.
9. Методы почвенной энзимологии/Ф.Х. Хази-ев.- М.:Наука, 1990.- 189с.
10. Практикум по биохимии /под ред. С. Е. Северина, Г. А. Соловьевой М: Изд-во МГУ.-1989.- 509 с.
