CC BY
55
УДК 579.66:547.94
Л. М. Султанова (к.х.н., ст. преп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф. ), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), А. А. Шараева (асп.), С. С. Лиханова (студ.).
Исследование влияния предобработки субстрата глицерином на гидролиз и ферментацию лигноцеллюлозных отходов с помощью Streptomyces sp. К-7
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
L. M. Sultanova, V. V. Zorin, N. I. Petukhova, A. A. Sharaeva, S. S. Likhanova
Research of influence of substrate pretreatment by glycerol on the hydrolysis and digestion of lignocellulotic waste
by Streptomyces sp. К-7
Ufa State Petrolium Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (347)2431935, e-mail: bio@rusoil.net
Показано, что предобработка биомассы лигноцеллюлозных отходов (соломы, валежника, опилок, хвои) водно-солевыми растворами, содержащими 5—20 % глицерина (температура — 121 оС, давление — 98 кПа, время — 1 ч) и последующая промывка растительных субстратов водой приводит к существенному стимулированию роста целлюлолитической культуры Б^ер^шусев вр. К-7 при температуре 30 оС, увеличению выхода редуцирующих веществ и КМЦ-целлюлазной активности культуральной жидкости.
Ключевые слова: глицерин; лигноцеллюлоза; микроорганизмы; целлюлаза.
It has been shown, that pretreatment of lignocellulotic waste biomass (straw, tree fall, sawdust, needles) by saline water solutions containing 5-20 % of glycerol (temperature - 121 oC, pressure — 98 kPa, time — 1 hour) followed by water washing of plant material leads to the significant stimulation of cellulolytic culture Streptomyces sp. K-7 growth at 30 oC and increase of both reducing saccharides yield and carboxymethylcellulose-cellulase activity of culture broth.
Key words: cellulose; glycerol; lignocellulose; microorganisms.
Высококипящие водорастворимые органические соединения, такие как глицерин, перспективны для делигнификации лигноцеллюлозных отходов лесного и сельского хозяйства, используемых в различных биотехнологических процессах (получение биотоплив второго поколения, ферментов и других биологически активных веществ) 1'2. Удаление лигнина снижает токсичность субстратов для микроорганизмов 3 и делает возможной одновременную реализацию процессов ферментативного гидролиза растительной целлюлозы и биосинтеза целевого продукта 4.
Ранее нами было показано, что предобработка биомассы луговых трав с помощью 2 — 20 % водно-солевых растворов глицерина позволяют интенсифицировать рост и значительно увеличивают целлюлазную активность двух
Дата поступления 03.09.12
актиномицетных культур (К-2 и К-7), выделенных из почвы на среде Гетчинсона с фильтровальной бумагой в качестве единственного источника углерода 5.
В настоящей работе проведено исследование влияния подобной предобработки субстрата на гидролиз и ферментацию других видов лигноцеллюлозных отходов (соломы, валежника, опилок, хвои) с помощью наиболее активной культуры К-7, которая, по описанию морфологических и физиолого-биохимических свойств 6, оказалась близка к представителям рода БЬтерЬошусе$.
Предобработку биомассы растительных субстратов осуществляли 5, 10 и 20 %-ми водно-солевыми растворами глицерина в процессе стерилизации среды автоклавированием в течение 1 ч. После удаления жидкой фазы субстрат промывали стерильной водой и помеща-
ли в питательную среду для культивирования БЬтерЬотусе$ $р. К-7. В качестве контроля использовали растительные субстраты, не подвергнутые обработке глицерином.
В процессе глубинного культивирования на модифицированной среде Чапека при 30 оС было обнаружено, что предварительная обработка субстратов глицерином стимулировала рост исследуемых бактерий. Выход биомассы через 8 сут культивирования на среде с пре-добработанной лигноцеллюлозой был в 6— 8 раз выше, чем на среде без обработки субстратов глицерином (рис. 1).
1 / _ / / 1 1
/ / / =1 4
□ контроль (без обработки)
■ 5 % глицерина
■ 10 % глицерина
■ 20 % глицерина
Исследование процесса гидролиза карбок-симетилцеллюлозы (КМЦ) с помощью восьми-суточных препаратов культуральной жидкости показало, что ее КМЦ-целлюлазная активность резко увеличивается (в 13—24 раза) при росте на предобработанном субстрате по сравнению с активностью культуральной жидкости в случае роста микроорганизмов на непредоб-работанном субстрате.
3000 2500 2000 1500 1000 500 0
□ контроль (без обработки)
■ 5 % глицерина
■ 10 % глицерина
■ 20 % глицерина
солома опилки валежник хвоя
солома опилки валежник
Рис. 3. КМЦ-целлюлазная активность препаратов 8 суточной культуральной жидкости при росте Streptomyces sp. К-7 на лигноцеллюлозных субстратах
Рис. 1. Выход биомассы (в оптических единицах) культуры Streptomyces sp. К-7 при выращивании на лигноцеллюлозных субстратах в течение 8 сут
В результате исследования содержания редуцирующих веществ (РВ) в препаратах 8 суточной культуральной жидкости было обнаружено, что в контрольных вариантах (без предобработки субстратов глицерином) их уровень не превышает 54—74 мг/л (рис. 2). В тоже время при использовании в качестве субстрата для культивирования бактерий лигно-целлюлозных отходов, предварительно обработанных водными растворами глицерина, уровень РВ в среде существенно возрастает (в 8-11 раз).
700
600
500
та 400 я
т" 300 200 100 0
□ контроль(без обработки)
■ 5 % глицерина
■ 10 % глицерина
■ 20 % глицерина
солома опилки валежник хвоя
Рис. 2. Уровень РВ в 8 суточных культуральных жидкостях при росте Streptomyces sp. К-7 на лигноцеллюлозных субстратах
Наибольший эффект был достигнут при использовании в качестве субстрата соломы. Таким образом, предложенный способ использования глицерина для предобработки сырья при гетерофазной ферментации целлюлозосо-держащих твердых отходов позволяет интенсифицировать процессы гидролиза растительной целлюлозы и роста биомассы.
Экспериментальная часть
Культуры микроорганизмов выращивали на модифицированной среде Чапека 7, содержащей 1% биомассы луговых трав в качестве ростового субстрата. Для предобработки лиг-ноцеллюлозного субстрата в среду вносили глицерин (2-20 %) и автоклавировали при температуре 121 оС в течение 1 часа. По окончании процесса осуществляли 3-х кратную промывку субстрата стерильной водой 8, после чего помещали его в стерильную среду с инокулятом и инкубировали при температуре 30 оС в течение 10 сут. В контрольных экспериментах осуществляли культивирование микроорганизмов в среде, содержащей необработанную глицерином биомассу луговых трав, а также обработанную, но не отмытую от глицерина биомассу.
Рост микроорганизмов контролировали нефелометрически при длине волны 520 нм. Концентрацию редуцирующих Сахаров в куль-туральной жидкости определяли по методу Шомодьи-Нельсона 9. КМЦ-целлюлазную активность микроорганизмов определяли при температуре 30 оС по скорости образования РВ в реакционной смеси, содержащей 10 мл 1%-го раствора КМЦ в 0.2 М ацетатном буфере рН 5 и 10 мл культуральной жидкости. За единицу условной целлюлазной активности исследуемых микроорганизмов принимали количество фермента, образующее 1 мг глюкозы в инкубационной смеси за 30 ч 9. Белок в реакционной смеси оценивали методом Лоури 10.
Литература
1. FitzPatrick M., Champagne P., Cunningham M. F., Whitney R. A. // Bioresource Technol.— 2010.— V.101.- P.8915.
2. Alvira P., Tomas-Pejo E., Ballesteros M.,
Negro M. J. // Bioresource Technol.— 2010.— V.101.- P.4851.
3. Chen H., Jin S. // Enzyme Microbial. Technology.- 2006.- V.39.- P.1430.
4. Ch-Chang, V.S., Holtzapple, M. // Appl. Biochem. Biotechnol.- 2000.- V.84.- P.5.
5. Султанова Л. М., Зорин В. В., Петухова Н. И., Шараева А. А., Михайлова Т. Н., Федорова В. В. // Баш. хим. ж.- 2011.- Т.18, №4.- С.52.
6. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / L. R. Boone, R.W. Casten-holz.- N.Y.,Heidelberg. Berlin: Springer-Veriag, 2001.- Vol.
7. Руководство к практическим занятиям по микробиологии /под ред. Н. С. Егорова.- М: Изд-во МГУ.- 1983.- 215 с.
8. Chandra R. P., Bura R. Substrat Pretreatment: The Key to Effective Enzymatic Hydrolysis of Lignocellulosics.- Vancouver, Canada.- 2007.-P.90.
9. Методы почвенной энзимологии/Ф.Х. Хази-ев.- М.:Наука, 1990.- 189с.
10. Практикум по биохимии /под ред. С. Е. Северина, Г. А. Соловьевой М: Изд-во МГУ.-1989.- 509 с.
