CC BY
32
УДК 577.152.9:577.154
Л. М. Султанова (ст. преп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), А. А. Шараева (асп.), Т. Н. Михайлова (студ.), В. В. Федорова (асп.)
Исследование влияния глицерина на гидролиз и ферментацию луговых трав целлюлитическими актиномицетами
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail:_bio@rusoil.net
L. M. Sultanova, V. V. Zorin, N. I. Petukhova, A. A. Sharaeva, T. N. Mikhailova, V. V. Fedorova
Research of influence of glycerol on hydrolysis and fermentation of meadow grass by cellulolytic actinomycetes
Ufa State Petrolium Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
Показано, что предобработка биомассы луговых трав водно-солевыми растворами, содержащими 2—20 % глицерина (температура — 121 °С, давление — 98 кПА, время — 1 ч) и последующая промывка лигноцеллюлозного субстрата водой приводит к существенному стимулированию роста микроорганизмов, увеличению выхода редуцирующих веществ и возрастанию КМЦ-целлюлазной активности внеклеточных ферментов в процессе культивирования целлю-литических актиномицетов.
Ключевые слова: глицерин; лигноцеллюлоза; микроорганизмы; целлюлаза.
It has been shown that pre-treatment of meadow grass with saline water solutions containing 2— 20 % of glycerol (temperature — 120 oC, pressure — 98 kPa, time — 1 hour) and further washing of lignocelluloses substrate by water lead to significant increase of microorganisms growth, yield of reducing substances and KMC-cellulase activity of extracellular enzymes during the period of cellulolytic actinomycetes cultivation.
Key words: lignocelluloses; cellulase; glycerol; microorganisms.
Отходы лесной и сельскохозяйственной лигноцеллюлозы являются перспективным сырьем для получения альтернативных топлив и химикалий с помощью микроорганизмов 1'2. Одним из экономически целесообразных подходов к использованию лигноцеллюлозы в микробиологических процессах является одновременное осуществление гидролиза целлюлозы, входящей в состав лигноцеллюлозных отходов, и ферментации образующихся моносахаридов микроорганизмами 3. Однако широкое использование растительных отходов на практике зачастую ограничивается стадией гидролиза целлюлозы, поскольку лигнин и ге-мицеллюлоза, входящие в состав лигноцеллю-лозы, оказывают ингибирующее действие на активность целлюлаз микроорганизмов, действуя как физический барьер 4 или взаимодействуя с активными центрами ферментов 2.
Предварительная обработка субстрата горячей водой, водными растворами кислот, щелочей, органических растворителей или ПАВ
Дата поступления 05.10.11
позволяют удалять из сырья токсичные примеси, ингибирующие рост микроорганизмов 5-9. В этом аспекте наиболее интересны процессы ор-ганосольватации лигноцеллюлозы, основанные на применении водных растворов недорогого, нетоксичного, невзрывоопасного соединения, такого как глицерин, с помощью которого из субстрата можно удалять лигнин 8'9.
В настоящей работе исследована возможность применения глицерина для органосоль-ватолиза биомассы луговых трав с целью интенсификации процессов гидролиза субстрата и синтеза целлюлаз микроорганизмами. В качестве тест-культур были использованы цел-люлитические актиномицеты (культуры К-2 и К-7), выделенные из почвенных образцов на среде Гетчинсона с фильтровальной бумагой 10. Ранее, при культивировании этих микроорганизмов на среде Чапека с луговыми травами, без предварительной обработки субстрата глицерином, было выявлено, что в 8-ми суточных культурах накапливается мало редуцирующих
веществ (РВ): 20 и 32 мг/л для К-2 и К-7, со-10
ответственно .
Предобработка биомассы луговых трав 2—20%-ми водно-солевыми растворами глицерина (температура — 121 0С, давление — 98 кПА, время — 1 ч) и последующая промывка лигноцеллюлозного субстрата водой приводит к существенному увеличению выхода РВ в процессе культивирования целлюлитических актиномицетов (рис. 1). Наибольший эффект (почти в 10 раз больше РВ по сравнению с контролем) дает предобработка субстрата 20%-м раствором глицерина при использовании культуры К-7. В то же время простое добавление в среду глицерина перед ее стерилизацией (без последующей промывки субстрата) лишь незначительно увеличивает выход РВ в области концентрации 2—5 % по сравнению с контролем, а при более высоких концентрациях глицерина уровень продуктов гидролиза целлюлозы снижается.
ния процесса гидролиза карбоксиметилцеллю-лозы (КМЦ) с помощью препаратов 8-ми суточной культуральной жидкости микроорганизмов. Обнаружено, что КМЦ-целлюлазная активность внеклеточных ферментов обоих микроорганизмов резко увеличивается в результате предобработки биомассы луговых трав в присутствии 2—5 % растворов глицерина (рис. 2Б).
Примечательно, что в случае культуры К-2 применение более высококонцентрированных растворов глицерина приводит к снижению целлюлазной активности культуры (рис. 2Б) и некоторому замедлению ее роста (рис. 2А). В тоже время, в случае культуры К-7 КМЦ-целлюлазная активность продолжает увеличиваться даже при использовании 10 и 20%-х растворов глицерина для предобработки, достигая значений, в 9—10 раз превышающих активность в контрольном варианте (рис. 2Б).
5 10
Глицерин, %
К-7 (без промывки) ■ К-7 (с промывкой) □ К-2 (без промывки) К-2 (с промывкой)
Рис. 1. Уровень редуцирующих веществ в 8-ми суточных культуральных жидкостях при культивировании микроорганизмов на среде Чапека с луговой травой, подвергнутой обработке растворами глицерина
Обнаружено, что в вариантах с предобработкой и промывкой субстрата более активно, чем в контроле, происходит рост микроорганизмов, о чем свидетельствуют более высокие значения оптической плотности (ОД520) 8-ми суточных культуральных жидкостей (рис. 2А). Это указывает на то, что более высокий выход РВ обусловлен не столько снижением скорости их утилизации микроорганизмами, сколько увеличением скорости гидролиза субстрата. В пользу такого предположения свидетельствуют также результаты исследова-
12 3 4 5 Варианты
к н
лй 1:1
^ я
2 Е-1
Н О
В о
В к
|=г я
„ я
У
Рис. 2. Оптическая плотность (А) и КМЦ-целлю-лазная активность (Б) 8-ми суточных культур микроорганизмов при культивировании на среде Чапека с луговой травой: 1 — контроль (без обработки); 2 — 2% глицерина; 3 — 5% глицерина; 4 — 10% глицерина; 5 — 20% глицерина.
Таким образом, полученные результаты показывают, что глицерин, являющийся отходом производства биодизеля, может быть успешно использован для интенсификации микробиологических процессов, основанных на биоконверсии биомассы луговых трав, однако концентрация глицерина в растворе, оптимальная для предобработки субстрата, зависит от свойств используемого микроорганизма.
Экспериментальная часть
Культуры микроорганизмов выращивали на модифицированной среде Чапека 11, содержащей 1% биомассы луговых трав в качестве ростового субстрата. Для предобработки лиг-ноцеллюлозного субстрата в среду вносили глицерин (2—20 %) и автоклавировали при температуре 121 0С в течение 1 ч. По окончании процесса осуществляли 3-х кратную промывку субстрата стерильной водой, после чего помещали его в стерильную среду с инокуля-том и инкубировали при температуре 30 оС в течение 10 сут. В контрольных экспериментах осуществляли культивирование микроорганизмов в среде, содержащей необработанную глицерином биомассу луговых трав, а также обработанную, но не отмытую от глицерина биомассу.
Рост микроорганизмов контролировали нефелометрически при длине волны 520 нм. Концентрацию редуцирующих сахаров в куль-туральной жидкости определили по методу Шомодьи—Нельсона 12. КМЦ-целлюлазную активность микроорганизмов определяли при температуре 30 оС по скорости образования РВ в реакционной смеси, содержащей 10 мл 1%-го раствора КМЦ в 0.2 М ацетатном буфере рН 5 и 10 мл культуральной жидкости 12. За
единицу условной целлюлазной активности исследуемых микроорганизмов принимали количество фермента, образующее 1 мг глюкозы в инкубационной смеси за 30 ч. Белок в реакционной смеси оценивали методом Лоури 13.
Литература
1. FitzPatrick M., Champagne P., Cunningham M. F., Whitney R. A. // Bioresource Technol.- 2010.-V.101.- P. 8915
2. Alvira P., Tomas-Pejo E., Ballesteros M., Negro M.J. // Bioresource Technol.- 2010.-V.101.- P. 4851.
3. Chen H., Jin S. // Enzyme Microbial. Technology.- 2006.- V.39.- P.1430.
4. Ch-Chang V.S., Holtzapple M. // Appl. Bio-chem. Biotechnol.- 2000.- V.84-86.- P.5.
5. Pedersen M., Meyer A. S. // New Biotechnol.-2010.- V.27, №6.- P.739.
6. Zeitoun R., Pontalier P. Y., Marechal P., Rigal L. // Bioresource Technol.- 2010.- V.101.-P. 9348.
7. Itoh H., Wada M., Honda Y., Kuwahara M., Watanabe T. // J. Biotechnol.- 2003.- V.103.-P.273.
8. Liu J., Takada R., Karita S., Watanabe T., Honda Y., Watanabe T. // Bioresource Technol.-2010.- V.101.- P.9355.
9. Sun F., Chen H. // Bioresource Technol.-2008.- V.99.- P.5474.
10. Султанова Л. M., Петухова Н. И., Зорин В. В., Хусаинова Э. Ф. // Баш. хим. ж.- 2010.-Т.17, №5.- С.60.
11. Руководство к практическим занятиям по микробиологии /под ред. Н.С. Егорова.- M: Изд-во МГУ.- 1983.- 215 с.
12. Хазиев Ф. Х. Методы почвенной энзимоло-гии.— М.: Наука, 1190.- 189с.
13. Практикум по биохимии /под ред. С. Е. Северина, Г. А. Соловьевой.- М: Изд-во МГУ.-1989.- 509 с.
