CC BY
149
УДК 579.66:547.94
Л. М. Султанова (ст. преп.), Э. Ф. Хусаинова (студ.), Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), В. В.Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование биоконверсии древесных отходов и луговых трав в биотопливо
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, е-mail: bio@rusoil.net
L. M. Sultanova, E. F. Husainova, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Bioconversion of wood waste and grass into biofuel
Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; р^ (347) 2431935, е-mail: bio1@rusoil.net
Исследованы актиномицеты и грибы — деструкторы природных полимеров, обладающие целлюлазной активностью, выделенные путем скриннинга из почвенных образцов. Культуры были использованы для усиления конверсии целлюлозосодержащих субстратов, используемых в ацетоно-бутиловом брожении при синтезе биотоплива в А.В.Е. процессе анаэробными бактериями рода Clostridium. Субстратом служили возобновляемые непищевые источники сырья: опилки, валежник и луговые травы. Показано, что при осуществлении биокатализируе-мого предварительного гидролиза сырья выход продуктов ацетоно-бутилового брожения смещается в сторону образования биоэтанола.
Ключевые слова: брожение; бутанол; клост-ридии; растительное сырье.
Actinomycetes and fungi — degraders of natural polymers with cellulase activity, isolated by screening from soil samples — were studied. Cultures were used for enhance the conversion of cellulose-containing substrates used in acetone-butyl fermentation in the synthesis of acetone, butanol and ethanol in A.B.E. process of anaerobic bacteria of the genus Clostridium. Renewable non-food sources of raw materials such as sawdust, fallen trees and grass were used as substrates. It is shown that yield of product of acetone-butyl fermentation is shifted toward the formation of ethanol with enzymatic prehyd-rolysis.
Key words: fermentation; butanol; Clostridium; plant materials.
Биобутанол, как жидкий энергоноситель, может частично заменить углеводородное топливо благодаря высокой энергоемкости, хорошей смешиваемости, высокому октановому числу и низкой летучести Он также широко используется как сырье при производстве пластиков, как экстрагент в пищевой и парфюмер-
2
ной промышленности .
Экономическая эффективность процесса получения биобутанола напрямую зависит от стоимости сырья. В настоящее время в качестве перспективного сырья для получения бу-танола рассматриваются опилки, солома, торф, луговые травы и другие растительные отходы 3'4. Поэтому создание эффективного экономически оправданного процесса получения биобутанола вносит вклад в решение как
Дата поступления 29.10.10
топливно-энергетических, так и экономических проблем, связанных с утилизацией растительных отходов 5.
Известны различные технологические схемы получения биобутанола. Двухстадий-ные процессы получения бутанола, основанные на химическом гидролизе растительных полимеров и последующей ферментации продуктов гидролиза, оказались экономически не выгодными. Вместе с тем известно, что некоторые штаммы клостридий, осуществляющих ацетоно-бутиловое брожение, могут продуцировать ферменты, расщепляющие полимерные компоненты растительной биомассы. Это позволяет проводить стадию гидролиза и ферментацию в одном реакторе 6-8. Такой подход значительно сокращает затраты на производство биобутанола.
Ранее нами было показано, что бактерии Clostridium sp. C-1 осуществляют биоконверсию соломы, стеблей подсолнуха и древесных опилок, состоящих главным образом из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина 9. Деградация подобных растительных субстратов у клостри-дий происходит с участием ксиланазы 7'10 и целлюлолитического ферментативного комплекса (целлюлосомы) 8. Это позволяет предполагать наличие у исследуемого штамма аналогичных ферментов, гидролизующих целлюлозу и расщепляющих ксилан — главный компонент гемицеллюлозы. Однако, при использовании этих гидролизатов в процессе сбраживания, выход целевого продукта не превышал 1 — 1.5 г/л 9.
В связи с этим нами продолжен поиск условий и сырьевых источников, перспективных для биоконверсии в биобутанол. Объектом исследования являлись бактерии Clostridium sp. C2 из коллекции культур микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, и Clostridium acetobutilicum СК425 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика. В качестве растительных субстратов использовали луговые травы, опилки, а также полусгнивший валежник.
При исследовании продуктов анаэробной ферментации исследуемого растительного сырья в течение 4 сут с помощью исследуемых микроорганизмов было обнаружено, что бактерии Clostridium acetobutilicum СК425 наиболее эффективно конвертируют луговые травы в ацетон, бутанол и этанол, накапливая в среде около 3.5 г/л бутанола. Древесные отходы (валежник и опилки) являются менее подходящим субстратом для получения бутанола данными микроорганизмами (рис. 1.).
s &
а и я
и
я я
о И
4 3,5
3 2,5
2 1,5
1-М 0,5-|-|
0
I бутанол I этанол I ацетон
Валежник
Луговые травы
Культура Clostridium sp. C2 также оказалась способной конвертировать луговые травы (рис.2), причем выход бутанола в этом случае был в 1.5 раза выше, чем в анаэробной ферментации с участием Clostridium acetobuti-licum СК425 (рис.1). Кроме того, бактерии Clostridium sp. C2 эффективно сбраживают валежник, накапливая в среде более 8 г/л бутанола. Это свидетельствует о перспективности использования данной культуры для получения биобутанола из растительных отходов.
I бутанол I этанол I ацетон
t
Валежник Луговые травы Опилки
Рис.1. Выход продуктов брожения при росте Clostridium acetobutilicum СК425 на средах с древесными отходами и луговыми травами
Рис.2. Выход продуктов брожения при росте Clostridium sp. С2 на средах с древесными отходами и луговыми травами
Вместе с тем, было установлено, что данные бактерии практически не сбраживают опилки (рис. 2).
Одной из причин того, что разные виды древесных отходов (валежник и опилки) различно сбраживаются одним и тем же микроорганизмом, является различная степень деструкции полусгнившего валежника и опилок нативной древесины. Исходя из этого можно предположить, что предобработка растительного субстрата с помощью других микроорганизмов-деструкторов будет стимулировать его дальнейшую конверсию в бутанол клостридиями.
В результате скрининга микроорганизмов-продуцентов целлюлаз из образцов почв и остатков гниющей древесины было выделено 11 культур актиномицетов (К-1, К-2, К-3, К-4, К-5, К-6, К-7) и микроскопических грибов (Pénicillium purpurogenum, Fusarium solany, Fusarium oxysporum, A-1 ), растущих на среде с целлюлозой (фильтовальной бумагой).
При исследовании гидролиза карбокси-метилцеллюлозы (КМЦ) найденными микроорганизмами было выявлено, что наибольшее количество редуцирующих веществ (РВ) образуют актиномицеты К-7 и грибы P. purpurogenum.
0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0
1
з &
Рис. 3. Образование редуцирующих веществ (РВ) продуцентами целлюлаз при культивировании на среде с карбоксиметилцеллюлозой
Исследование динамики целлюлолитичес-кой активности этих микроорганизмов при росте на среде, содержащей луговые травы в качестве единственного источника углерода, позволило обнаружить, что максимальное значение активности приходится на 5 сутки для культуры К-7 и 7 сутки для Р. ритритодвпит. Аналогичные исследования с использованием опилок в качестве ростового субстрата показали, что пик активности культур К-7 и Р. ритритодвпит приходится на 5 и 6 сутки, соответственно. При этом на опилках наибольшую активность проявляет гриб Р. ритритодвпит, а на луговых травах — актиномицет К-7 (рис.4).
240
Чапека. Луговые травы гидролизовали с помощью актиномицета К-7 в течение 5 сут, а опилки — с помощью гриба P. purpurogenum в течение 6 сут. По окончании процесса в культу-ральную жидкость вносили бульон и автокла-вированием стерилизовали питательную среду с микроорганизмами, осуществляющими предварительный гидролиз.
После стерилизации среду с предобрабо-танным субстратом инокулировали культурой Clostridium sp. С2 и ферментировали в анаэробных условиях в течение 4 сут с целью получения бутанола. Однако, в результате анализа продуктов брожения было установлено, что в изученных условиях бутанол не образуется, при этом выход сопутствующих продуктов брожения (ацетона и этанола) не уменьшается, а, напротив, увеличивается (рис.5) по сравнению с биоконверсией культурой Clostridium sp. С2 непредобработанных субстратов (рис.2). Это позволяет предположить, что микроорганизмы, осуществляющие предобработку растительных субстратов, накапливают метаболиты, подавляющие образование бута-нола клостридиями.
« 4'
fr 3
I бутанол I этанол
I ацетон
-К-7 на травах
-К-7 на опилках
P. purpurogenum на травах
P. purpurogenum на
Время, сутки
Рис.4. Динамика целлюлолитической активности при росте на луговых травах и опилках актиномицета К-7 и микромицета P. purpurogenum
В течение указанного времени была осуществлена предобработка растительного сырья с помощью наиболее активных микроорганизмов путем аэробной ферментации на среде
Луговые травы
Опилки
Рпс.5. Выход продуктов брожения при росте Clostridium sp. С2 на средах с предварительным гидролизом субстрата
Полученные данные показывают, что двухстадийная биоконверсия растительного сырья с применением на первой стадии грибов или актиномицетов для предварительного гидролиза субстрата (по крайней мере, без удаления жидкой фазы) не целесообразна для получения биобутанола с помощью культуры Clostridium sp. С2. Вместе с тем данный подход может представлять интерес для предобработки растительного сырья в процессах его сбраживания в биоэтанол.
6
5
2
0
Экспериментальная часть
Клостридии выращивали на питательной среде, содержащей 2% мясопептонного бульона (МПБ) с добавлением различных источников углерода. В качестве источников углерода использовали опилки, валежник и луговые травы в концентрации 5%. Микроорганизмы культивировали в анаэробных условиях в стерильных флаконах в термостате при 37 oC в течение 4 сут.
Для скрининга микроорганизмов-продуцентов целлюлаз использовали жидкую и агаризованную среду Гетчитсона: (г/л): NaNO3 — 2.5; K2HPO4 - 1.0; MgS047H20 - 0.3; NaCl -0.1; CaCl2 - 0.1; FeCl3 - 0.01; рН среды 7.27.3 ; агар-агар - 20. Культивирование микроорганизмов осуществляли в термостате в течение 14 сут при температуре 28-30 oC.
Для выявления максимального накопления редуцирующих веществ (РВ) микроорганизмы культивировали на среде Чапека с использованием в качестве индуктора карбокси-метилцеллюлозы (КМЦ). Состав среды Чапека (г/л): сахароза - 20.0; NaN03 - 2.0; K2HP04 - 1.0; MgS04 '7Н20 - 0.5; KCl - 0.5; FeS04'7H20 - 0.1; CaC03 - 3.0; агар - 20.0 и Концентрацию редуцирующих сахаров определили по методу Шомодьи-Нельсона 12.
Целлюлолитическую активность микроорганизмов определяли по модифицированныму методу Панчоли и Риса 12. За единицу целлю-лолитической активности исследуемых штаммов принимали количество фермента, который образует 1 мкмоль РВ за сутки при гидролизе 30 мг субстрата в 1 мл ацетатного буфера при рН 5.0 и температуре 30 oC 12.
Концентрацию продуктов определяли методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе ЛХМ-8МД. Условия анализа: колонка длиной 2м с носителем Инертон AW-
DMCS, пропитанным 10% Carbowax 6000, температура колонки 50 0С, температура испарителя 150 0С, скорость газоносителя (азот)— 3 мл/мин, детектор — ионизация в пламени, скорость водорода — 3 мл/мин, скорость воз-духа—300 мл/мин. Концентрацию спиртов определяли методом «внутреннего стандарта» с использованием диэтилового эфира.
Литература
1. Ladisch M. R. // Enzyme Microb. Technol.-1991.- V.13.- P. 280.
2. Ezeji T., Qureshi N., Blaschek H. P. // Process Biochemistry.- 2007.- V.42.- P. 34.
3. Исследовано в России [Электронный ресурс]: Новое поколение биотоплива - биобутанол. -Режим доступа к статье: http://biobutanol. narod. ru/bioenergy/biobutanol/main. html.
4. Исследовано в России [Электронный ресурс]: Биобутанол - топливо II поколения. / Аналитический портал химической промышленности.- Режим доступа к статье: http:// newchemistry.ruletter.phpn_id=690&cat_id=7.
5. Исследовано в России [Электронный ресурс]: Биотопливо с полей. / А. Гуйда - кандидат сельскохозяйственных наук // ГУКК «Кубанский сельскохозяйственный ИКЦ». - Режим доступа к статье: http://www.ikc-apk.kuban.ru/ newapk/innova/innova090207.htm.
6. Ezeji T. C., Qureshi N., Blaschek H. P. // J. of Biotechnology.- 2005.- V.115.- P. 179.
7. Marichamy S., Mattiasson B. // Enzyme and Microbial Technology.- 2005.- V. 37.- P.497.
8. Desvaux M. // Enzyme and Microbial Technology.- 2005.- V. 37.- P. 373.
9. Султанова Л. M., Егорова А. А., Шахмаев Р. Н., Петухова Н. И., Спирихин Л. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2009.- Т.16, №1.- С. 114.
10. Qureshi N., Saha B.C., Cotta M.A. // Bioprocess Biosyst Eng.- 2007.- V. 30.- P.419.
11. Руководство к практическим занятиям по микробиологии /Под ред. Н. С. Егорова.- M: Изд-во МГУ.- 1983.- 215 с.
12. Методы почвенной энзимологии/Ф. X. Хази-ев.- М.: Наука, 1190.- 189 с.
