CC BY
137
УДК 579.66:547.94
Л. М. Султанова (ст. преп.), Э. Ф. Хусаинова (студ.), Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), В. В.Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование биоконверсии древесных отходов и луговых трав в биотопливо
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, е-mail: [email protected]
L. M. Sultanova, E. F. Husainova, N. I. Petukhova, V. V. Zorin
Bioconversion of wood waste and grass into biofuel
Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; р^ (347) 2431935, е-mail: [email protected]
Исследованы актиномицеты и грибы — деструкторы природных полимеров, обладающие целлюлазной активностью, выделенные путем скриннинга из почвенных образцов. Культуры были использованы для усиления конверсии целлюлозосодержащих субстратов, используемых в ацетоно-бутиловом брожении при синтезе биотоплива в А.В.Е. процессе анаэробными бактериями рода Clostridium. Субстратом служили возобновляемые непищевые источники сырья: опилки, валежник и луговые травы. Показано, что при осуществлении биокатализируе-мого предварительного гидролиза сырья выход продуктов ацетоно-бутилового брожения смещается в сторону образования биоэтанола.
Ключевые слова: брожение; бутанол; клост-ридии; растительное сырье.
Actinomycetes and fungi — degraders of natural polymers with cellulase activity, isolated by screening from soil samples — were studied. Cultures were used for enhance the conversion of cellulose-containing substrates used in acetone-butyl fermentation in the synthesis of acetone, butanol and ethanol in A.B.E. process of anaerobic bacteria of the genus Clostridium. Renewable non-food sources of raw materials such as sawdust, fallen trees and grass were used as substrates. It is shown that yield of product of acetone-butyl fermentation is shifted toward the formation of ethanol with enzymatic prehyd-rolysis.
Key words: fermentation; butanol; Clostridium; plant materials.
Биобутанол, как жидкий энергоноситель, может частично заменить углеводородное топливо благодаря высокой энергоемкости, хорошей смешиваемости, высокому октановому числу и низкой летучести Он также широко используется как сырье при производстве пластиков, как экстрагент в пищевой и парфюмер-
2
ной промышленности .
Экономическая эффективность процесса получения биобутанола напрямую зависит от стоимости сырья. В настоящее время в качестве перспективного сырья для получения бу-танола рассматриваются опилки, солома, торф, луговые травы и другие растительные отходы 3'4. Поэтому создание эффективного экономически оправданного процесса получения биобутанола вносит вклад в решение как
Дата поступления 29.10.10
топливно-энергетических, так и экономических проблем, связанных с утилизацией растительных отходов 5.
Известны различные технологические схемы получения биобутанола. Двухстадий-ные процессы получения бутанола, основанные на химическом гидролизе растительных полимеров и последующей ферментации продуктов гидролиза, оказались экономически не выгодными. Вместе с тем известно, что некоторые штаммы клостридий, осуществляющих ацетоно-бутиловое брожение, могут продуцировать ферменты, расщепляющие полимерные компоненты растительной биомассы. Это позволяет проводить стадию гидролиза и ферментацию в одном реакторе 6-8. Такой подход значительно сокращает затраты на производство биобутанола.
Ранее нами было показано, что бактерии Clostridium sp. C-1 осуществляют биоконверсию соломы, стеблей подсолнуха и древесных опилок, состоящих главным образом из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина 9. Деградация подобных растительных субстратов у клостри-дий происходит с участием ксиланазы 7'10 и целлюлолитического ферментативного комплекса (целлюлосомы) 8. Это позволяет предполагать наличие у исследуемого штамма аналогичных ферментов, гидролизующих целлюлозу и расщепляющих ксилан — главный компонент гемицеллюлозы. Однако, при использовании этих гидролизатов в процессе сбраживания, выход целевого продукта не превышал 1 — 1.5 г/л 9.
В связи с этим нами продолжен поиск условий и сырьевых источников, перспективных для биоконверсии в биобутанол. Объектом исследования являлись бактерии Clostridium sp. C2 из коллекции культур микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, и Clostridium acetobutilicum СК425 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика. В качестве растительных субстратов использовали луговые травы, опилки, а также полусгнивший валежник.
При исследовании продуктов анаэробной ферментации исследуемого растительного сырья в течение 4 сут с помощью исследуемых микроорганизмов было обнаружено, что бактерии Clostridium acetobutilicum СК425 наиболее эффективно конвертируют луговые травы в ацетон, бутанол и этанол, накапливая в среде около 3.5 г/л бутанола. Древесные отходы (валежник и опилки) являются менее подходящим субстратом для получения бутанола данными микроорганизмами (рис. 1.).
s &
а и я
и
я я
о И
4 3,5
3 2,5
2 1,5
1-М 0,5-|-|
0
I бутанол I этанол I ацетон
Валежник
Луговые травы
Культура Clostridium sp. C2 также оказалась способной конвертировать луговые травы (рис.2), причем выход бутанола в этом случае был в 1.5 раза выше, чем в анаэробной ферментации с участием Clostridium acetobuti-licum СК425 (рис.1). Кроме того, бактерии Clostridium sp. C2 эффективно сбраживают валежник, накапливая в среде более 8 г/л бутанола. Это свидетельствует о перспективности использования данной культуры для получения биобутанола из растительных отходов.
I бутанол I этанол I ацетон
t
Валежник Луговые травы Опилки
Рис.1. Выход продуктов брожения при росте Clostridium acetobutilicum СК425 на средах с древесными отходами и луговыми травами
Рис.2. Выход продуктов брожения при росте Clostridium sp. С2 на средах с древесными отходами и луговыми травами
Вместе с тем, было установлено, что данные бактерии практически не сбраживают опилки (рис. 2).
Одной из причин того, что разные виды древесных отходов (валежник и опилки) различно сбраживаются одним и тем же микроорганизмом, является различная степень деструкции полусгнившего валежника и опилок нативной древесины. Исходя из этого можно предположить, что предобработка растительного субстрата с помощью других микроорганизмов-деструкторов будет стимулировать его дальнейшую конверсию в бутанол клостридиями.
В результате скрининга микроорганизмов-продуцентов целлюлаз из образцов почв и остатков гниющей древесины было выделено 11 культур актиномицетов (К-1, К-2, К-3, К-4, К-5, К-6, К-7) и микроскопических грибов (Pénicillium purpurogenum, Fusarium solany, Fusarium oxysporum, A-1 ), растущих на среде с целлюлозой (фильтовальной бумагой).
При исследовании гидролиза карбокси-метилцеллюлозы (КМЦ) найденными микроорганизмами было выявлено, что наибольшее количество редуцирующих веществ (РВ) образуют актиномицеты К-7 и грибы P. purpurogenum.
0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0
1
з &
Рис. 3. Образование редуцирующих веществ (РВ) продуцентами целлюлаз при культивировании на среде с карбоксиметилцеллюлозой
Исследование динамики целлюлолитичес-кой активности этих микроорганизмов при росте на среде, содержащей луговые травы в качестве единственного источника углерода, позволило обнаружить, что максимальное значение активности приходится на 5 сутки для культуры К-7 и 7 сутки для Р. ритритодвпит. Аналогичные исследования с использованием опилок в качестве ростового субстрата показали, что пик активности культур К-7 и Р. ритритодвпит приходится на 5 и 6 сутки, соответственно. При этом на опилках наибольшую активность проявляет гриб Р. ритритодвпит, а на луговых травах — актиномицет К-7 (рис.4).
240
Чапека. Луговые травы гидролизовали с помощью актиномицета К-7 в течение 5 сут, а опилки — с помощью гриба P. purpurogenum в течение 6 сут. По окончании процесса в культу-ральную жидкость вносили бульон и автокла-вированием стерилизовали питательную среду с микроорганизмами, осуществляющими предварительный гидролиз.
После стерилизации среду с предобрабо-танным субстратом инокулировали культурой Clostridium sp. С2 и ферментировали в анаэробных условиях в течение 4 сут с целью получения бутанола. Однако, в результате анализа продуктов брожения было установлено, что в изученных условиях бутанол не образуется, при этом выход сопутствующих продуктов брожения (ацетона и этанола) не уменьшается, а, напротив, увеличивается (рис.5) по сравнению с биоконверсией культурой Clostridium sp. С2 непредобработанных субстратов (рис.2). Это позволяет предположить, что микроорганизмы, осуществляющие предобработку растительных субстратов, накапливают метаболиты, подавляющие образование бута-нола клостридиями.
« 4'
fr 3
I бутанол I этанол
I ацетон
-К-7 на травах
-К-7 на опилках
P. purpurogenum на травах
P. purpurogenum на
Время, сутки
Рис.4. Динамика целлюлолитической активности при росте на луговых травах и опилках актиномицета К-7 и микромицета P. purpurogenum
В течение указанного времени была осуществлена предобработка растительного сырья с помощью наиболее активных микроорганизмов путем аэробной ферментации на среде
Луговые травы
Опилки
Рпс.5. Выход продуктов брожения при росте Clostridium sp. С2 на средах с предварительным гидролизом субстрата
Полученные данные показывают, что двухстадийная биоконверсия растительного сырья с применением на первой стадии грибов или актиномицетов для предварительного гидролиза субстрата (по крайней мере, без удаления жидкой фазы) не целесообразна для получения биобутанола с помощью культуры Clostridium sp. С2. Вместе с тем данный подход может представлять интерес для предобработки растительного сырья в процессах его сбраживания в биоэтанол.
6
5
2
0
Экспериментальная часть
Клостридии выращивали на питательной среде, содержащей 2% мясопептонного бульона (МПБ) с добавлением различных источников углерода. В качестве источников углерода использовали опилки, валежник и луговые травы в концентрации 5%. Микроорганизмы культивировали в анаэробных условиях в стерильных флаконах в термостате при 37 oC в течение 4 сут.
Для скрининга микроорганизмов-продуцентов целлюлаз использовали жидкую и агаризованную среду Гетчитсона: (г/л): NaNO3 — 2.5; K2HPO4 - 1.0; MgS047H20 - 0.3; NaCl -0.1; CaCl2 - 0.1; FeCl3 - 0.01; рН среды 7.27.3 ; агар-агар - 20. Культивирование микроорганизмов осуществляли в термостате в течение 14 сут при температуре 28-30 oC.
Для выявления максимального накопления редуцирующих веществ (РВ) микроорганизмы культивировали на среде Чапека с использованием в качестве индуктора карбокси-метилцеллюлозы (КМЦ). Состав среды Чапека (г/л): сахароза - 20.0; NaN03 - 2.0; K2HP04 - 1.0; MgS04 '7Н20 - 0.5; KCl - 0.5; FeS04'7H20 - 0.1; CaC03 - 3.0; агар - 20.0 и Концентрацию редуцирующих сахаров определили по методу Шомодьи-Нельсона 12.
Целлюлолитическую активность микроорганизмов определяли по модифицированныму методу Панчоли и Риса 12. За единицу целлю-лолитической активности исследуемых штаммов принимали количество фермента, который образует 1 мкмоль РВ за сутки при гидролизе 30 мг субстрата в 1 мл ацетатного буфера при рН 5.0 и температуре 30 oC 12.
Концентрацию продуктов определяли методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе ЛХМ-8МД. Условия анализа: колонка длиной 2м с носителем Инертон AW-
DMCS, пропитанным 10% Carbowax 6000, температура колонки 50 0С, температура испарителя 150 0С, скорость газоносителя (азот)— 3 мл/мин, детектор — ионизация в пламени, скорость водорода — 3 мл/мин, скорость воз-духа—300 мл/мин. Концентрацию спиртов определяли методом «внутреннего стандарта» с использованием диэтилового эфира.
Литература
1. Ladisch M. R. // Enzyme Microb. Technol.-1991.- V.13.- P. 280.
2. Ezeji T., Qureshi N., Blaschek H. P. // Process Biochemistry.- 2007.- V.42.- P. 34.
3. Исследовано в России [Электронный ресурс]: Новое поколение биотоплива - биобутанол. -Режим доступа к статье: http://biobutanol. narod. ru/bioenergy/biobutanol/main. html.
4. Исследовано в России [Электронный ресурс]: Биобутанол - топливо II поколения. / Аналитический портал химической промышленности.- Режим доступа к статье: http:// newchemistry.ruletter.phpn_id=690&cat_id=7.
5. Исследовано в России [Электронный ресурс]: Биотопливо с полей. / А. Гуйда - кандидат сельскохозяйственных наук // ГУКК «Кубанский сельскохозяйственный ИКЦ». - Режим доступа к статье: http://www.ikc-apk.kuban.ru/ newapk/innova/innova090207.htm.
6. Ezeji T. C., Qureshi N., Blaschek H. P. // J. of Biotechnology.- 2005.- V.115.- P. 179.
7. Marichamy S., Mattiasson B. // Enzyme and Microbial Technology.- 2005.- V. 37.- P.497.
8. Desvaux M. // Enzyme and Microbial Technology.- 2005.- V. 37.- P. 373.
9. Султанова Л. M., Егорова А. А., Шахмаев Р. Н., Петухова Н. И., Спирихин Л. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2009.- Т.16, №1.- С. 114.
10. Qureshi N., Saha B.C., Cotta M.A. // Bioprocess Biosyst Eng.- 2007.- V. 30.- P.419.
11. Руководство к практическим занятиям по микробиологии /Под ред. Н. С. Егорова.- M: Изд-во МГУ.- 1983.- 215 с.
12. Методы почвенной энзимологии/Ф. X. Хази-ев.- М.: Наука, 1190.- 189 с.
