CC BY
32
№ 6 - 2015 г. 14.00.00 Медицинские науки (14.04.00 Фармацевтические науки)
УДК 615.322:582.572.2
ИССЛЕДОВАНИЕ УГЛЕВОДОВ ПОДЗЕМНЫХ ОРГАНОВ ЛИЛЕЙНИКА БУРО-ЖЕЛТОГО (HEMEROCALLIS FULVA L.) И ЛИЛЕЙНИКА ГИБРИДНОГО (HEMEROCALLIS HYBRIDA VAR. «STELLA DE ORO»)
С. М. МарчишинL. Е. В. Заричанская2. М. С. Гарнык2. Т. И. Ющенко2
1ГВУЗ «Тернополъский государственный медицинский университет имени И. Я. Горбачевского МЗ Украины» (г. Тернополъ, Украина) 2Винницкий национальный медицинский университет имени Н. И. Пирогова (г. Винница,
Украина)
Гравиметрическим методом в корнеклубнях двух видов рода Лилейник (Hemerocallis L.) определено общее содержание водорастворимых полисахаридов и пектиновых веществ. Качественный состав сахаров в сырье и их количественное соотношение исследованы методом газо-жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Установлено, что корнеклубни лилейников характеризируются высоким содержанием полисахаридов, в структуре которых преобладают сахароза и фруктоза.
Ключевые слова: лилейник буро-желтый (Hemerocallis fulva L.), лилейник гибридный ( Hemerocallis hybrida var. «Stella De Oro»), водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества, моносахариды, гравиметрия, газо-жидкостная хромато-масс-спектрометрия
Марчишин Светлана Михайловна — доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии с медицинской ботаникой ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский университет имени И. Я. Горбачевского МЗ Украины», рабочий телефон: 8-10-380-352-520518, е-mail: [email protected]
Заричанская Елена Васильевна — ассистент кафедры фармацевтической химии Винницкого национального медицинского университета имени Н. И. Пирогова, рабочий телефон: 8-10-380-432-524699, е-mail: [email protected]
Гарнык Мирослава Сергеевна — кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии Винницкого национального медицинского университета имени Н. И. Пирогова, рабочий телефон: 8-10-380-432-524699, е-mail: [email protected]
Ющенко Татьяна Ивановна — кандидат химических наук, доцент, заведующий
кафедрой фармацевтической химии Винницкого национального медицинского университета имени Н. И. Пирогова, рабочий телефон: 8-10-380-432-524699, е-mail: [email protected]
Введение. Нерациональное использование природных ресурсов и истощение запасов дикорастущих лекарственных растений побуждают к поиску перспективных видов среди культивируемой флоры. Род Лилейник (Hemerocallis L.) относится к подсемейству Hemerocallidaceae семейства Xanthorrhoeaceae и объединяет 18 видов, в дикорастущем виде распространенных в Юго-Восточной Азии, Сибири, Европе, Северной Америке и широко культивируемых повсеместно как цветочно-декоративные. Карл Линней дал лилейникам родовое название Hemerocallis, подчеркивая кратковременность жизни цветка (от греч. hemera — день и callos — красота). Усилиями селекционеров в настоящее время получены гибридные формы лилейников, объединенные видовым названием — Hemerocallis hybrida, насчитывающие сотни высокодекоративных сортов-культиваров. В странах Европы, Северной Америки, в России и Украине лилейники распространены в качестве высокодекоративных цветочных растений, однако в странах Дальнего Востока, а именно — в Китае и Японии, различные виды сырья лилейников издревле использовались с целью лечения многих заболеваний человека. Отвар корнеклубней лилейника рекомендован традиционной китайской медициной для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы, гинекологической сферы; настой цветков используется в народной медицине в качестве ранозаживляющего, обезболивающего и тонизирующего средств, при сердечно-сосудистых заболеваниях; настой листьев лилейника известен в Китае и Японии как антидепрессивное, успокоительное и противовоспалительное средство [5].
Потенциал биологически активных веществ и природный ресурс сырья лилейников в настоящее время используется недостаточно. Поэтому фармакогностическое исследование корнеклубней, цветков и листьев растений рода Лилейник (Hemerocallis L.) представляется перспективным направлением современной фитохимии, фармации и фармакологии.
Известно, что корни растений, особенно утолщенные, накапливают вещества первичного синтеза — углеводы. Исследование количественного содержания и качественного состава углеводов корнеклубней лилейника буро-желтого и лилейника гибридного является целесообразным в связи с тем, что углеводы, кроме важного функционального значения и специфической фармакологической активности, также оказывают влияние на развитие суммарного фармакологического эффекта препаратов, полученных из растительного сырья.
Цель исследования — определение, выделение и изучение полисахаридов подземных органов двух видов лилейников, а также анализ их моносахаридного состава. Сырье (корнеклубни лилейника буро-желтого (Hemerocallis fulva L.) и лилейника гибридного ( Hemerocallis hybrida var. «Stella De Oro»)) заготовлено в сентябре 2014 года на исследовательских участках отдела декоративно-цветочных растений Национального ботанического сада имени Н. Н. Гришка НАН Украины (г. Киев, Украина).
Материалы и методы исследования. Определение количественного содержания полисахаридов в двух образцах сырья проводили гравиметрическим методом. Качественный состав и количественное соотношение сахаров были установлены методом
газо-жидкостной хромато-масс-спектрометрии после кислотного гидролиза полисахаридного комплекса [2, 4].
Перед проведением физико-химических исследований в сырье с помощью качественной гистохимической реакции был выявлен инулин, который принадлежит к классу гомополисахаридов; мономером является фруктоза. Именно наличием этого вещества можно обосновать использование подземных органов лилейников в традиционной медицине Китая при заболеваниях поджелудочной железы, печени и сахарном диабете. Сначала гистохимической реакцией с раствором Люголя в подземных органах лилейника буро-желтого и лилейника гибридного было исключено наличие крахмала (реакция отрицательная). Затем с помощью реакции Моллиша (а-нафтол и концентрированная серная кислота) было доказано наличие инулина (реакция положительная — появление бурого кольца в тканях корнеклубней двух образцов в результате воздействия соответствующих реактивов).
Гравиметрический метод определения количественного содержания полисахаридов в растительном сырье является фармакопейным. Перед выделением полисахаридного комплекса отделяли липофильные вещества [1].
Точную навеску сырья помещали в колбу со шлифом объемом 250 мл, добавляли 200 мл воды очищенной, колбу присоединяли к обратному холодильнику и кипятили при помешивании 30 мин. Экстракцию повторяли еще дважды, используя в первый раз 200 мл, во второй — 100 мл воды очищенной. Водные экстракты объединяли, центрифугировали и надосадочную жидкость декантировали в мерную колбу объемом 500 мл сквозь 5 слоев марли, вложенной в стеклянную воронку диаметром 55 мм и предварительно промытую водой очищенной. Фильтры промывали водой до метки (раствор А).
25 мл раствора А помещали в пробирку для центрифугирования, добавляли 75 мл 95 % спирта этилового, перемешивали, подогревали на водной бане до 30 °С на протяжении 5 мин. Через 60 мин содержимое пробирки центрифугировали с частотой 5000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость фильтровали под вакуумом при остаточном давлении 13-16 кПа сквозь высушенный до постоянной массы при температуре 100-105 °С стеклянный фильтр ПОР-16 диаметром 40 мм. Осадок количественно переносили на фильтр, постепенно промывая 15 мл раствора 95 % спирта этилового в воде очищенной (3 : 1), 10 мл ацетона и 10 мл этилацетата. Фильтр с осадком высушивали сначала на воздухе, а затем при температуре 100-105 °С до постоянной массы.
Для отделения спирторастворимых веществ шрот, полученный после выделения липофильной фракции, экстрагировали 82 % спиртом этиловым в соотношении 1 : 10 и настаивали при комнатной температуре 2 ч. Полученный экстракт отфильтровывали, а шрот опять заливали таким же объемом спирта этилового на 2 ч. После удаления спирторастворимых соединений, выделяли фракцию водорастворимых полисахаридов (ВРПС). Сухой шрот экстрагировали горячей водой в соотношении 1 : 10 при нагревании до температуры 95 % на протяжении 60 мин при постоянном перемешивании. Повторное извлечение проводили в соотношении шрот-экстрагент 1 : 10. Полученные вытяжки отделяли от сырья, объединяли и выпаривали до 1/5 от начального объема. ВРПС осаждали троекратным объемом 96 % этанола при комнатной температуре. Осадки, которые образовывались, выделяли, промывали 96 % этанолом, ацетоном, высушивали и взвешивали.
Количественное содержание ВРПС рассчитывали по формуле:
где т1 — масса фильтра, г; т2 — масса фильтра с осадком, г; т — масса сырья, г.
Шрот, оставшийся после извлечения ВРПС, использовали для получения пектиновых веществ (ПВ). Для этого шрот экстрагировали дважды смесью 0,5 % растворами кислоты оксалатной и аммония оксалата (1 : 1) в соотношении шрот-экстрагент 1:20 при температуре 80-85 °С 2 ч. Объединённые экстракты концентрировали и осаждали пятикратным объемом 96 % этанола. Полученные осадки отфильтровывали, промывали этанолом, высушивали и взвешивали [2].
Результаты и обсуждения. В результате проведенных исследований из подземных органов лилейника буро-желтого и лилейника гибридного выделены ВРПС и ПВ. Выход ВРПС в корнеклубнях лилейника буро-желтого составил 20,23 %, в корнеклубнях лилейника гибридного — 22,78 %; выход ПВ — 3,88 и 3,38 % соответственно. Результаты определения количественного содержания ВРПС и ПВ в корнеклубнях лилейника буро-желтого и лилейника гибридного представлены в табл. 1.
Таблица 1
Количественное содержание водорастворимых полисахаридов и пектиновых веществ в корнеклубнях лилейника буро-желтого и лилейника гибридного
Сырье ПС Масса сырья, г Содержание ПС, г Выход ПС, %
Корнеклубни лилейника буро-желтого ВРПС 9,8675 1,9962 20,23
ПВ 7,2113 0,2798 3,88
Корнеклубни лилейника гибридного ВРПС 17,6754 4,0274 22,78
ПВ 11,0255 0,3731 3,38
Примечание: ПС — полисахариды; ВРПС — водорастворимые полисахариды; ПВ — пектиновые вещества
Использование газо-жидкостной хромато-масс-спектрометрии позволяет со значительной точностью определить качественный состав и количественное содержание моносахаридов и сахарозы в растительном сырье. Метод основан на экстракции свободных сахаров после гидролиза полисахаридного комплекса и получении ацетатов их альдонитрильных производных с последующим анализом. Хроматографическое разделение проводили на газовой хромато-масс-спектрометрической системе Agilent 6890N/5973inert (Agilent technologies, USA). Колонка капиллярная HP-5ms (30 m х 0,25 mm х 0,25 mkm, Agilent technologies, USA). Температура выпаривателя — 250 °С, температура интерфейса — 280 °С. Разделение проводили в режиме программирования температуры — начальную температуру 160 °С выдерживали на протяжении 8 мин, поднимали с градиентом 5 °С/мин до 240 °С. Конечную температуру выдерживали на протяжении 6 мин. Пробу объёмом 1 мкл вводили в режиме разделения потока 1 : 50. Детектирование проводили в режиме SCAN в диапазоне (38-400 m/z). Скорость потока газа-носителя 1,2 мл/мин. Идентификацию проводили по времени удержания стандартов моносахаридов с использованием библиотеки масс-спектров NIST 02; ацетиллированные спирты и сахара
распознавались МАСС-детектором. Количественный анализ проводили путем добавления раствора внутреннего стандарта в исследуемые пробы. В качестве внутреннего стандарта использовался раствор сорбитола. При обычных условиях дериватизации кетоуглевод фруктоза переходит в альдоуглевод глюкозу. Однако разработанная методика позволяет при дериватизации получить два пика фруктозы, которые суммируются при подсчете результатов [3].
Рис. 1. Хроматограмма моносахаридов корнеклубней лилейника буро-желтого: 1
глюкоза, 2 — манноза, 3, 4 — фруктоза
ife ^Ьо tbc гЬ,- ||ю ¡Ы
Рис. 2. Хроматограмма сахарозы корнеклубней лилейника буро-желтого: 1 — сахароза
Рис. 3. Хроматограмма моносахаридов корнеклубней лилейника гибридного: 1 — глюкоза,
2 — манноза, 3, 4 — фруктоза
Рис. 4. Хроматограмма сахарозы корнеклубней лилейника гибридного: 1 — сахароза
Результаты исследования количественного содержания Сахаров в корнеклубнях лилейника буро-желтого и лилейника гибридного представлены в табл. 2.
Таблица 2
Количественное содержание сахаров в корнеклубнях лилейника буро-желтого
и лилейника гибридного
Моносахарид Содержание в корнеклубнях лилейника буро-желтого, мг/кг Содержание в корнеклубнях лилейника гибридного, мг/кг
Сахароза 110,59 95,27
Глюкоза 1,60 1,97
Фруктоза + х-компонент 24, 42 19,89
Манноза 4,73 0,37
Выводы. Анализ результатов проведенных исследований свидетельствует о высоком содержании ВРПС и ПВ в образцах корнеклубней двух исследуемых видов лилейников. Состав сахаров корнеклубней лилейника буро-желтого и лилейника гибридного характеризируется преобладанием в количественном соотношении дисахарида сахарозы. Также обнаружено высокое содержание фруктозы, количество которой в исследуемых образцах корнеклубней значительно преобладает над количеством глюкозы. Исследуемые виды рода Лилейник (Hemerocallis L.) являются перспективными для использования в медицине и требуют расширенного фитохимического и фармакологического анализов.
Список литературы
1. Кацуба I. К. Дослщження полiсахаридiв мати-й-мачухи / I. К. Кацуба, О. М. Новосел, В. С. Кисличенко // Украшський медичний альманах. — 2013. — Т. 16, № 4. — С. 25-27.
2. Кисличенко В. С. Полисахариды Brassica oleacea var. Italica plenck / В. С. Кисличенко, И. Н. Владимирова // Химия природных соединений. — 2008. — № 1. — С. 61-62.
3. Оленников Д. Н. Методика количественного определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов / Д. Н. Оленников, Л. М. Танхаева // Химия растительного происхождения. — 2006. — № 4. — С. 29-33.
4. Analysis of the monosaccharide composition of purified polysaccharides in Ganoderma atrum by capillary gas chromatography / Y. Chen [et al.] // Phytochem. Anal. — 2009 — Vol. 20 (6). — P. 503-510.
5. The Antidepressant-like Effect of Ethanol Extract of Daylily Flowers in Rats / Shih-Hang Lin [et al.] // Journal of Traditional and Complementary Medicine. — 2013. — Vol. 3. — Р. 53-61.
RESEARCH OF CARBOHYDRATES OF UNDERGROUND ORGANS OF DAY LILY BROWN-YELLOW (HEMEROCALLIS
FULVA L.) AND DAY LILY HYBRID ( HEMEROCALLIS HYBRIDA VAR. «STELLA
DE ORO»)
S. M. MarchishinL. E. V. Zarichanskaya2. M. S. Garnyk2. T. I. Yushchenko2
1SHPE «Ternopol state medical university n. a. I. Y. Gorbachevsky» of Ministry of Health of the
Ukraine (Ternopol, the Ukraine) 2Vinnytsia national medical university n. a. N. I. Pirogov (Vinnytsia, Ukraine)
The general maintenance of water-soluble polysaccharides and pectinaceous substances is defined by gravimetric method in the pips of two types of the sort Day lily (Hemerocallis L.). Qualitative composition of Saccharums in raw materials and their quantitative ratio are investigated by method of liquid-gas chromato-mass spectrometry. It is established that pipes of day lilies are characterized by the high maintenance of polysaccharides in which structure sucrose and fructose prevail.
Keywords: day lily brown-yellow (Hemerocallis fulva L.), day lily hybrid (Hemerocallis hybrida var. «Stella De Oro»), water-soluble polysaccharides, pectinaceous substances, monosaccharides, gravitation measurements, liquid-gas chromato-mass spectrometry
About authors:
Marchishin Svetlana Mikhaelovna — doctor of pharmaceutical science, professor, head of chair of pharmacognosy with medical botany at SHPE «Ternopil state medical university n. a. I. Y. Gorbachevsky», office phone: 8-10-380-352-520518, e-mail: [email protected]
Zarichanskaya Elena Vasilyevna — assistant of pharmaceutical chemistry chair at Vinnytsia national medical university n. a. N. I. Pirogov, office phone: 8-10-380-432-524699, e-mail: [email protected]
Garnyk Miroslava Sergeyevna — candidate of pharmaceutical science, assistant professor of pharmaceutical chemistry chair at Vinnytsia national medical university n. a. N. I. Pirogov, office phone: 8-10-380-432-524699, e-mail: [email protected]
Yushchenko Tatyana Ivanovna — candidate of chemical science, assistant professor, head of pharmaceutical chemistry chair at Vinnytsia national medical university n. a. N. I. Pirogov, office number: 8-10-380-432-524699, e-mail: [email protected]
List of the Literature:
1. Katsuba I. K. Achievment of polysaccharides of foalfoot / K. Katsuba, O. M. Novosel, V. S.
Kislichenko // Ukraine medical almanac. — 2013. — Vol. 16, N 4. — P. 25-27.
2. Kislichenko V. S. Polysaccharides of Brassica oleacea var. Italica plenck / V. S. Kislichenko, I. N. Vladimirova // Chemistry of natural compound. — 2008. — N 1. — P. 61-62.
3. Olennikov D. N. Methodicc of quantitative definition of group structure of a carbohydrate complex of vegetable objects / D. N. Olennikov, L. M. Tankhayeva // Phytogenesis Chemistry. — 2006. — N 4. — P. 29-33.
4. Analysis of the monosaccharide composition of purified polysaccharides in Ganoderma atrum by capillary gas chromatography / Y. Chen [et al.] // Phytochem. Anal. — 2009 — Vol. 20 (6). — P. 503-510.
5. The Antidepressant-like Effect of Ethanol Extract of Daylily Flowers in Rats / Shih-Hang Lin [et al.] // Journal of Traditional and Complementary Medicine. — 2013. — Vol. 3. — P. 53-61.
