CC BY
103. Huggins M.L. // J. Amer. Chem. Soc. 1942. V.64. P.2716-2719.
4. Эскин В.Е. Рассеяние света растворами полимеров и свойства макромолекул. Л.: Наука. 1986. 288с.
5. Рафиков С.Р., Будтов В.П., Монаков Ю.Б. Введение в физико-химию полимеров. М.: Наука. 1978. 328с.
6. Рабек Я. Экспериментальные методы в химии полимеров. Т.1. М.: Мир. 1983. 382с.
7. Цветков В.Н. Жесткоцепные полимерные молекулы. Л.: Наука. 1986. 379с.
8. Кленин В.И., Щеголев С.Ю., Лаврушин В.И.
Характеристические функции светорассеяния дисперсных частиц. Саратов: Изд-во Саратовск. гос. ун-та. 1977. 173с.
9. Петропавловский Г. А. и др. // Журн. прикл. химии. 1983. Т. 56. № 2. С.366-370.
10. Химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия. 1988. Т.3. № 5. 783с.
11. АИагош 8.М.//!Арр1. Ро1ут. Ба. 1977. У.21. Р.1323-1325.
12. Моравец Г. Макромолекулы в растворе. М.: Мир. 1967. 398с.
УДК 577.151.04:577.152.3.321
С.В. АЛЕЕВА, С.А. КОКШАРОВ
ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОЙ ЗАВИСИМОСТИ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИФЕРМЕНТНЫХ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
(Институт химии растворов РАН)
Выявлен сложный характер изменения активности амилолитических препаратов с различной устойчивостью в температурном интервале 37...100оС. Немонотонный вид температурных зависимостей интенсивности деструкции крахмала под действием биопрепаратов обусловлен их многокомпонентностью, наложением процессов повышения активности одних составляющих композиции и инактивации других. Показано, что препарат, содержащий термостабильные амилазы, включает также фракции ферментов с низко- и среднетемпературным диапазоном проявления активности.
Современный этап развития биотехнологий в различных отраслях производства, в том числе и в текстильной промышленности, основывается на создании специализированных ферментных препаратов, позволяющих максимально реализовать уникальную способность биокатализаторов проявлять свою активность только в отношении определенного вида веществ и химических реакций. Поиском наиболее эффективного состава ферментных композиций для решения определенного круга задач в разнообразных процессах переработки целлюлозных текстильных материалов активно занимаются специалисты различных областей знаний: микробиологии [1, 2], химии и эн-зимологии [3, 4], технологии текстильного производства [5, 6]. Результаты проводимых исследований убедительно подтверждают, что одним из основных направлений совершенствования препара-
тов является рациональный подбор ферментов с учетом последовательно-параллельного участия их в катализируемом процессе, возможного проявления синергизма в их действии или ингиби-рующего влияния. При этом важным моментом является обнаруженное отличие некоторых свойств для изоформ одних и тех же ферментов, получаемых с использованием различных микробиологических продуцентов. В частности, в технологическом плане большое значение имеют различия в способности энзимов адсорбироваться на твердофазном субстрате в условиях проявления максимальной активности.
Существенное расширение возможностей использования амилолитических препаратов и достигаемых технологических эффектов продемонстрировано нами [7, 8] на примере полиферментных композиций, получаемых совместно со специали-
стами каф. микробиологии ИГМА при использовании различных штаммов бактериальной культуры Bacillus subtilis коллекции ГосНИИгенетики. Комплексное проведение биохимических и технологических исследований позволяет определить критерии подбора ферментных препаратов для решения специфических задач в различных по технической сущности процессах использования крахмалсодержащих композиций. Одним из недостаточно изученных, но в то же время технологически важных параметров, меняющихся в энзимных препаратах различной микробиологической природы, является зависимость активности ферментов от температуры.
В процессах ферментативной модификации крахмалопродуктов при приготовлении желирую-щих и эмульгирующих, связывающих и загущающих, клеящих и пластифицирующих композиций как в текстильной, так и в пищевой, строительной или нефтедобывающей индустрии необходимо регулируемое расщепление зерен крахмала без глубокой конверсии полимеров. В связи с этим подбор ферментных препаратов должен осуществляться с учетом взаимного наложения температурных закономерностей изменения активности компонентов амилазного комплекса. В настоящей работе проведена оценка температурных превращений каталитических свойств нескольких амилолитических препаратов немодифицированных штаммов Bacillus subtilis, продуцирующих комплекс декстриноген-ных и осахаривающих ферментов.
В качестве объектов исследования использованы амилолитические препараты с индексом Г2х, представляющие собой концентрированные фильтраты продуктов культивирования бактериальных штаммов по глубинной технологии с использованием стандартных жидких питательных сред [9].
Общую активность амилаз измеряли по методам Каравея [10] и Бюхнера [11]. Метод Каравея основан на способности амилаз катализировать гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с выделением синего растворимого в воде красителя. Для проведения анализа использовали наборы реактивов AMS 50 фирмы Lachema Diagnostika (Чехия). Реакционная смесь содержала 1 мл субстрата и 0,1 мл ферментного раствора. За единицу активности (1 Е/л) по рекомендациям Международного биохимического союза принято превращение 1 мкмоль субстрата (крахмала) за 1 мин в оптимальных условиях эксперимента (30оС, рН 6).
Оценка активности по методу Бюхнера основана на определении времени осветления индикаторного раствора под действием амилолитиче-ских ферментов. В раствор, содержащий 2 мл 0,1 % раствора крахмала, 1 мл 0,85 % раствора хлорида
натрия и 1 мл раствора ферментного препарата, вносили по 0,1 мл 0,1 N раствора йода. Окончание гидролиза крахмала определяли по появлению желтого окрашивания. За единицу активности амилазы условно принимали количество фермента, которое расщепляет 2 мл крахмала за 15 мин при 30оС. Варьируя температуру анализа в диапазоне 30...100оС, проводили сопоставление результатов с введением в подогретый раствор субстрата растворов ферментных препаратов автономно термоста-тируемых при той же температуре в течение 20 мин или без нагрева последних (Т= 20...22оС). Анализу подвергались также растворы биопрепаратов после предварительного их термостатирования в ультратермостате при 80оС и 100оС.
Для определения состава исследуемых полиферментных препаратов использовали дифференцированный анализ декстриногенных и осаха-ривающих свойств амилолитических комплексов в соответствии с рекомендациями [12]. Активность декстриногенных амилаз (эндоферментов) определяли по изменению количества декстринов при гидролизе растворимого крахмала исследуемым биокатализатором. За единицу декстриногенной активности принимали количество фермента, которое в стандартных условиях (30оС, рНсреды 6) за 10 мин катализировало расщепление 1 г растворимого крахмала до декстринов. Измерение активности осахаривающих энзимов (экзоферментов) основано на определении скорости ферментативной реакции превращения крахмала в редуцирующие сахара. Ферментацию 1%-ного раствора крахмала осуществляли в течение 10 мин с последующей инактивацией энзимов добавкой Ш соляной кислоты. Содержание редуцирующих веществ оценивали иодометрическим методом.
Биосинтез ферментов разновидностями одного и того же микроорганизма при одинаковых условиях его культивирования происходит с различной интенсивностью. Как следствие, в зависимости от используемого продуцента могут меняться и показатель общей амилолитической активности, и состав полиферментной композиции. В частности, анализ представленных в табл. 1 каталитических свойств фильтратов культуральной жидкости различных штаммов В. 8иЪ1Ш8 показал, что среди исследуемых биопрепаратов один характеризуется низкой декстриногенной и высокой осахаривающей способностью, два других отличаются доминирующим содержанием декстриногенных ферментов. При смене бактериального продуцента исследуемые препараты различаются не только составом, но и оптимальными параметрами температуры проявления максимальной активности.
Таблица 1
Показатели амилолитической активности ферментных препаратов при 30оС.
№ Общая ак- Активность Активность
препарата тивность по эндофермен- экзофермен-
п/п Каравею, Е/л тов, ед./мл тов, ед./мл
1 320 50 450
2 680 912 50
3 1820 1080 37
На рис. 1 представлены результаты изменения активности препаратов в результате 20-минутного термостатирования при температуре анализа, проводимого по методу Бюхнера с использованием подогретых до соответствующего уровня тестовых растворов. В соответствии с положением оптимума на температурных зависимостях полученные полиферментные препараты можно подразделить на низкотемпературные (кр. 1), проявляющие максимальную активность по отношению к полимерам крахмала при 40.. .50оС, среднетемпературные с диапазоном Топт = 70. 80оС (кр. 2) и термостабильные (кр. 3), реакционная способность которых неуклонно повышается при нагревании до 100оС.
Рис.1. Температурная зависимость показателей активности фильтратов культуральной жидкости по Бюхнеру (Аб). 1, 2, 3 - фильтраты культуральной жидкости различных штаммов В. 5пЫШз (порядковый номер соответствует обозначениям табл.1).
На наш взгляд, наличие перегибов в ходе кривых обусловлено проявлением многокомпо-нентности состава биопрепаратов. Наиболее наглядно это иллюстрирует ход кр. 3. По-видимому, при нагревании раствора биопрепарата происходит одновременное протекание инактивации одних составляющих амилазного комплекса при нарастании активности других компонентов. В частности, замедление подъёма кривой 2 и 3 при 45...60оС может быть связано с потерей каталитической способности одного или нескольких энзимов с низкой
температурной устойчивостью на фоне активации более термостойких амилаз. Аналогичная потеря активности биокатализаторов наблюдается и для кр. 1, при этом определенная часть ферментов сохраняет свои свойства вплоть до 80оС.
Таблица 2.
Инактивация амилаз препарата №1 в процессе нагрева и выдержки при 80оС.
Время выдержки, мин Температура раствора, оС Общая активность по Каравею, Ак, Е/л Активность эндоферментов, Аэндо, ед/мл Активность эк-зоферментов, Аэкзо, ед/мл
0 22 320 53,4 450
3 52 362 73,4 470
5 67 355 72,6 334
7 74 303 71,1 273
10 78 276 59,2 182
15 80 151 45,7 73
20 80 80 20,9 38
30 80 <10 <5,0 <5,0
Вместе с тем даже при температуре термо-статирования 80оС потеря активности происходит в течение определенного промежутка времени. В табл. 2 суммированы результаты анализа проб нагреваемого препарата №1 с мгновенным их охлаждением до температуры проведения тестовых экспериментов для дифференцированной и общей оценки амилолитических свойств. Как видно, группы экзо- и эндоферментов ведут себя при повышении температуры по-разному. Декстриноген-ные амилазы обладают большей устойчивостью в сравнении с экзо-деполимеразами. Снижение активности осахаривающих ферментов начинается при меньших значениях температуры и происходит более высокими темпами.
С учетом показанных особенностей проведен анализ изменения интенсивности деструкции крахмального субстрата под действием ферментного препарата, обладающего термической устойчивостью, в процессе нагревания без изотермической выдержки. В этом случае весь полиферментный комплекс (экзо- и эндоферменты) проявляет активность. Как показано на рис. 2, температурная зависимость (кр.1) приобретает вид, отличающийся от кр.2, полученной после 20-ти минутного термостатирования препарата при температуре, соответствующей варьируемым условиям анализа (аналог кр.3 на рис. 1), или от хода кривых 3 и 4, соответствующих предварительному термостати-рованию системы при 80оС и 100оС.
AB, УН]. Sä
30 40 50 60 70 so 90 100
Рис. 2. Температурная зависимость амилолитической активности термостойкого препарата №3. Экспериментальные данные: 1-
без термостатирования ферментной композиции; 2 - термо-статирование ферментов при температуре анализа (т = 20 мин);
3 - термостатирование при 80оС; 4 - термостатирование при 100оС. Расчетные данные активности фракций полиферментного препарата: НФ- низкотемпературные ферменты; СФ- среднетем-пературные ферменты; ТФ- термостойкие ферменты.
В температурном диапазоне до 75оС кривые 1 и 2 практически совпадают, но после термо-статирования при 80оС (кр.3) активность препарата снижается в связи с дезактивацией его компонентов, обладающих низкой температурной устойчивостью. Температурная зависимость каталитической активности низкотемпературной фракции (кривая НФ) получена графическим методом по разнице значений кривых 1 и 3. Вид кривой НФ практически идентичен ходу кр. 1 на рис.1.
Верхняя ветвь кр. 2 является результирующей от вклада термостойких (кр. 4) и средне-температурных ферментов, которые инактивиру-ются при температурах более 95оС. Изменение активности среднетемпературных ферментов, иллюстрируемое расчетной кривой СФ, в интервале 35...70оС задается ходом кр. 3, а в интервале 70.. ,100оС - разностью значений кривых 2 и 4.
Таким образом, амилазный комплекс биопрепарата № 3, отличается от мультиэнзимных систем других исследуемых ферментативных фильтратов (№1 и №2) более сложным составом, а именно, присутствием в композиции наряду с низко- и сред-нетемпературными энзимами, термостабильных биокатализаторов. Термостабильная фракция может быть выделена выдержкой мультиферментной композиции при 100оС. Препарат, не содержащий фрак-
ции НФ, может быть получен термостатированием фильтрата при 80оС. В этом случае осахаривающая способность экзоферментов снижается в 6 раз.
Проведенный анализ амилолитических препаратов позволяет организовать более рациональное построение биокатализируемого процесса при облагораживании текстильных материалов. В зависимости от требуемого технологического эффекта возможны варианты исключения влияния отдельных компонентов ферментного препарата на стадии разогрева системы или сохранения и усиления их действия за счет замедления темпов неизотермической обработки, целенаправленного смещения температурных параметров использования биокатализатора, повышения долевого содержания целевого фермента.
В частности, для технологии получения узорчатой расцветки с использованием печатных красок на основе крахмальных загустителей получен специализированный ферментный препарат Амилан ДТФ. Он представляет собой выделенную термостойкую фракцию амилолитических ферментов, проявляющих активность в диапазоне температур 70... 1000С. За счет введения Амилана ДТФ в состав готовой красящей композиции осуществляется регулируемая конверсия крахмального загустителя на материале в процессах сушки и фиксации печатного состава. Разработанная технология способствует улучшению качества получаемых окрасок, благодаря повышению степени фиксации красителей на 4... 18 %, показателя интенсивности окраски на 5... 29 % и прочности окраски к физико-химическим воздействиям, а также позволяет интенсифицировать удаление компонентов печатной краски при промывке и предотвратить возможное закрашивание белого фона печатных рисунков. Технология колорирования тканей с использованием специализированных ферментных препаратов защищена патентом РФ [13].
ЛИТЕРАТУРА
1. Бравова Г.Б., Самойлова М.В. Мацерирующие ферменты: получение и применение в народном хозяйстве.- М.: Наука. 1981.- 237 с.
2. Головлева Л.И., Леонтьевский А.А. Биодеградация лигнина. // Успехи микробиологии.- 1990. Т. 24. С.128-155.
3. Гусаков А.В., Синицын А.П. // Текстильная химия. 1998. № 2 (14).- С. 68-73.
4. Гришутин С.Г. и др. // Текстильная химия. 2000. № 2 (18). - С. 65-70.
5. Афанасьева В. А., Башилова Т.Г., Шкиперова С.А. // Российский химический журнал. 2002. Т. XL VI. №2. С. 36-42.
6. Шигаева И.В., Туркина Н.Р., Шамолина И.И. //
Текстильная промышленность. 2002. №4. С. 27-28.
7. Алеева С.В., Кокшаров С.А. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2003.Т.46. Вып.1. С. 120-124.
8. Кокшаров С.А. и др. // Текстильная промышленность. 2003. № 4. С. 51-53.
9. Колунянц К.А., Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты (Технология и оборудование). М.: Пищевая промышленность. 1979. 300 с.
10. Searcy R.L., Wilding P.J., Berk J.E. // Chim. Asta.
1967. № 15. Р. 189.
11. Кужленова О.Д., Ивченко Т.М. Руководство по практическим занятиям по биологической химии. М.: Медицина. 1974. 424 с.
12. ГОСТ 20264.4-89 Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности.
13. Патент РФ №2196196 Способ колорирования целлю-лозосодержащих тканей // С.А. Кокшаров и др./ Опубл. 10.01.2003. БИ № 1.
Лаборатория химии растворов текстильных вспомогательных препаратов
УДК 678.032.8 : 678.01 : 543.336
В.И. КОРЧАГИН
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМЕРНОЙ ФАЗЫ НА ТЕРМООКИСЛИТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ В НАПОЛНЕННЫХ БУТАДИЕН-СТИРОЛЬНЫХ КАУЧУКАХ
(Воронежская государственная технологическая академия)
При термическом воздействии на бутадиен-стирольный каучук, в том числе карбок-силатный, отмечается в области температур 468 - 483 К термоокислительный процесс. Начало и пик экзотермического эффекта определяется содержанием двойных связей в полимерной фазе наполненного каучука и практически не зависит от степени конверсии и содержания карбоксильных групп в каучуке, но примеси металлов в наполнителе (керогене -70) способствуют каталитическому действию на термоокислительный процесс.
Одним из основных критериев термостабильности полимеров является температура начала деструкции, т.е. температура, при которой отмечается интенсивная потеря массы. Однако в процессе термического воздействия на каучуки в среде кислорода воздуха возможно протекание термоокислительных процессов при более низких температурах. Так в источнике [1] было отмечено, что натуральный каучук, подвергнутый нагреванию в атмосфере кислорода, содержит экзотермы, начинающиеся при температуре 473 К, что вызвано окислением эластомера.
Жидкофазное наполнение каучуков, в частности на стадии латекса, характеризуется лучшим комплексом физико-механических показателей вулканизатов в сравнении с наполнением традиционным способом - сухим смешением. В свою очередь, жидкофазное наполнение затрагивает проблему структурных превращений при переработке наполненных каучуков. Преобладание процесса деструкции или структурирования опреде-
ляется рядом факторов, в частности средой кислорода воздуха [2].
Целью работы является изучение процесса термоокисления наполненных бутадиен-стироль-ных каучуков в зависимости от содержания двойных связей в сополимере с учетом влияния наполнителя.
Наполненные каучуки были получены при использовании опытно-промышленных карбокси-латных бутадиен-стирольных латексов БСК - 15/2, БСК - 30/2 и БСК - 45/2, товарного латекса БС -30, а также латекса товарного каучука СКС - 30 АРКП.
В качестве наполнителя использовали ор-ганоминеральное соединение кероген - 70, которое используется в производстве резино-техничес-ких изделий и эбонитов (см. таблицу).
Комплексные термические исследования по выявлению термостабильности наполненных полимерных систем проводили на дериватографе фирмы «МОМ» (Венгрия). Навеска образцов составляла 190 - 210 мг. Скорость нагрева образцов - 5 °С/мин.
