CC BY
23УДК 677.253:577.151.36
С.В. Алеева, С.А. Кокшаров
ОЦЕНКА ДЕЙСТВИЯ ГОМОГЕННЫХ И ПОЛИФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ РАСШЛИХТОВКЕ ЛЬНЯНЫХ ТКАНЕЙ
(Институт химии растворов РАН) E-mail: [email protected]
Осуществлено подразделение декстриногенной, осахаривающей и деветвящей способности мультиэнзимных композиций, дифференцировано влияние компонентов промышленно выпускаемых биокатализаторов в условиях полунепрерывного способа удаления крахмальной шлихты и определен оптимальный состав ферментов для расшлихтовки тканых льняных полотен.
Ключевые слова: биокатализаторы, мультиэнзимные композиции, расшлихтовка льняного полотна, реологические свойства, деветвящее действие, декстриногенная активность, сахарогенная активность
Основной областью применения отечественных промышленно выпускаемых амилолити-ческих ферментных препаратов являются спиртовое и крахмалопаточное производства, где задачи и условия протекания биокатализируемого расщепления крахмалопродуктов существенно отличаются от процессов разрушения крахмальной шлихты в структуре волокнистых материалов. Это предопределяет актуальность исследований, направленных на оптимизацию состава полиферментных композиций для повышения эффективности их деструктирующего влияния на примеси крахмальной шлихты с учетом особенностей практикуемых методов биохимической обработки текстильных материалов и, в частности, полунепрерывного способа ферментативной расшлихтовки льняных тканей.
Группа ферментов, катализирующих гидролиз полимеров крахмала (амилазный комплекс), является наиболее многочисленной среди карбогид-раз, расщепляющих разные виды полисахаридных соединений, и насчитывает 13 разновидностей белковых катализаторов [1]. По аналогии с другими видами деполимераз амилазный комплекс принято подразделять на две подгруппы ферментов: декст-риногенных - разрушающих макромолекулы на срединных (внутренних) участках с образованием олигомеров (эндоферменты), и сахарогенных - воздействующих на концевые (внешние) участки цепей с отщеплением низкомолекулярных продуктов (эк-зоферменты). При анализе каталитических свойств промышленных препаратов [2, 3] действие первой подгруппы энзимов оценивают по снижению вязкости гидрогелей крахмала или интенсивности окраски иод-крахмального комплекса. Активность оса-харивающих ферментов, мало влияющих на реологию тест-системы, характеризуют по изменению ее редуцирующей способности в результате накопле-
ния альдопиранозных соединений.
Вместе с тем в состав обеих подгрупп наряду с биокатализаторами разрушения а-1,4-глюкозидной связи входят деветвящие [4] ферменты, ускоряющие гидролиз а-1,6-связи в макромолекулах амилопектина. К ним относятся эндофермен-ты изоамилаза, пуллуланаза, олиго-1,6-глюкозидаза, амило-1,6-глюкозидаза и экзо-1,6-а-глюкозидаза, а также экзоферменты экзо-1,6-а-глюкозидаза и у-амилаза, проявляющая активность на обоих типах связи. В гомогенной форме эти энзимы идентифицируются с применением специфических субстратов, но выявить их присутствие в многокомпонентных препаратах стандартными методами [2] невозможно, поскольку результат их действия на гидрогель крахмала аналогичен разжижающему или оса-харивающему эффектам при разрушении а-1,4-связей другими представителями амилаз.
В работе проведено сопоставление каталитических свойств промышленных амилолитиче-ских препаратов разного микробного происхождения амилосубтилин Г10х, амилоризин П10х, глюкаваморин ШОх и амиломезентерин Г10х с действием гомогенных ферментов фирмы 1СЫ а-амилаза, Р-амилаза, у-амилаза и изоамилаза. Активность препаратов оценена с помощью тестовых субстратов амилозы и амилопектина фирмы ГС^ выделенных из кукурузного крахмала (степень очистки 99 %), а также по их влиянию на состояние крахмальной шлихты в льняной ткани арт. 590 с применением оригинального метода оценки долевого распределения полисахаридов в структуре волокнистого материала [5].
В табл. 1 представлены результаты воздействия гомогенных ферментов на 1 %-ные растворы тестовых субстратов при 40оС в течение 20 мин. Концентрация ферментов выравнивалась по содержанию белковых компонентов.
Таблица 1
Характеристика каталитической активности гомогенных ферментов Table 1. Parameter of catalytic activity of homogeneous ferments
С Свойства субстрата
Ферментный препарат мг бел- амилоза амилопектин
ка/л ju - ю\ 17 2 - с/ м ■ ю\ м2 • с/ /А//,% RT/ ARr
а-амилаза 25 1,08 /44 0,33/ /83 4,7 V /34 2,30/ /48 /40 9/ /80
(эндоглико-геназа) 50
изоамилаза 25 50 1 ,93/ /0 1,93/ /0 4,2 V /41 1,08/ /75 8 /60 1/ /120
Р-амилаза 25 50 1,87/ /3,1 1,79/ /7,3 7,0V /1,7 7,0V /2,1 14/ /170 23/ /360
у-амилаза (глюкоамила-за) 25 50 1,90/ /1,6 1,88/ /2,6 2, 73/ /62 2,4V /66 /40 1/ /120
Примечание: в числителе условной дроби приведены абсолютные значения показателей кинематической вязкости (ц) и восстанавливающей способности (Rr) анализируемых субстратов, в знаменателе - их изменения относительно параметров исходного состояния полимеров (для амилозы ц=1,93-1(Г2 м2-с; для амилопектина ц=7Д8-1(Г2 м2-с, Rr=5 масс.%).
Note absolute values of kinematic viscosity (ц) and redusing ability (Rr) of substrates under study are shown in numerator of fraction; changes of values mentioned above with respect to parameters of initial polymers state are shown in denominator (for amylase n=1.93-l(T2nr-s for amylopectin ц=7.18-1(Г2 nr-s, Rr=5 mass.%).
Нетрудно видеть, что изоамилаза, представляющая в эксперименте совокупность девет-вящих ферментов, не изменяет реологических свойств раствора амилозы, а разжижающее действие экзодеиолимераз Р -амилазы и у-амилазы на этом субстрате несоизмеримо мало в сравнении с влиянием деполимеризующего эндогенного фермента а-амилазы. Восприятию данных изменения свойств растворов амилопектина способствует представленная на рис. 1 схема воздействия ферментов на гроздеподобную структуру полимера.
Как видно из данных табл. 1, разжижающая способность а-амилазы в растворе амилопектина проявляется значительно меньше, чем на амилозе, поскольку ее действию доступны лишь внешние линейные участки разветвленной макромолекулы. Причем, по данным [6], длина комплементарного для а-амилазы участка полимерной цепи составляет не менее 6 глюкозидных звеньев без ответвлений. Двукратное увеличение концентрации фермента обеспечивает эквивалентный прирост содержания редуцирующих группировок в результате разрыва глюкозидных связей. Вместе с тем изменения кинематической вязкости повышаются лишь в 1,4 раза, что свидетельствует о малой доступности макромолекулы амилопектина для данного вида ферментов.
Деветвящее действие эндофермента изо-амилазы также проявляется преимущественно на внешней поверхности «грозди» амилопектина. При этом более существенные изменения вязкости и редуцирующей способности раствора в сравнении с влиянием а-амилазы (табл. 1) обусловлено отщеплением от макромолекулы полисахарида укруп-
Рис. 1 Механизм деструкции амилопектина под действием ферментов-деполимераз Fig. 1. Destruction mechanism of amilopectin at the action of ferments- depolymerases
ненных структурных фрагментов (рис. 1). Увеличение изменений с ростом концентрации энзима свидетельствует, что в исследуемом концентрационном диапазоне насыщение поверхности субстрата биокатализатором не достигается, поскольку отщепление каждого бокового ответвления вскрывает дополнительное количество реакционно-способных центров макромолекулы.
(3-Амилаза оказывает экзогенное воздействие на нередуцирующие концевые участки амило-пектина (рис. 1), в большом количестве присутствующие в полимере. Отщепление остатков мальтозы обусловливает резкое возрастание показателя ЯГ (табл. 1), но существенной деполимеризации субстрата не происходит, что отражается в незначительных изменениях показателя вязкости.
В отличие от (3-амилазы экзофермент у-амилаза проявляет активность на редуцирующем конце макромолекулы (незафонованный кружок на рис. 1). В соответствии с описанным в литературе механизмом действия этот фермент последовательно отщепляет мономерные звенья и, приблизившись к месту ветвления, обеспечивает гидролиз а-1,6-связи, продолжая свое движение по а-1,4-связям бокового ответвления. При этом начальные акты деветвления в вершинной части макромолекулы сопровождаются распадом амилопектина на крупные декстрины, что приводит к резкому снижению вязкости раствора (табл. 1). Наращивание концентрации фермента обеспечивает увеличение количества отщепляемых мономеров глюкозы и рост показателя восстанавливающей способности, но более глубокое разукрупнение полимера сопровождается менее значительными темпами изменениями реологических свойств.
В табл. 2 суммированы данные изменения свойств тестовых субстратов при тех же условиях эксперимента под влиянием полиферментных препаратов, вводимых в раствор в концентрации 1 г/л, что соответствует экспериментально определенному содержанию белка 50 мг/л и обеспечивает указанные значения декстриногенной (Аэндо) и са-харогенной (Аэкзо) активностей.
При сравнении с данными табл. 1 наиболее легкой идентификации поддается состав глю-каваморина, в котором, наряду с основным, указанным в паспорте энзимом у-амилазой эндогенный компонент представлен а-амилазой, обеспечивающей значительное разжижение раствора амилозы при относительно низком значении показателя Аэндо. На том же основании можно заключить, что а-амилаза присутствует и в остальных биопрепаратах. Причем в амиломезентерине другие виды эндогенных ферментов (деветвящие)
отсутствуют, поскольку изменения вязкости раствора амилопектина невелики и соответствуют влиянию гомогенной а-амилазы. Экзоферментом, очевидно, является Р-амилаза, генерирующая в растворе амилопектина большое количество редуцирующих сахаров.
Таблица 2
Действие полиферментных препаратов на растворы модельных субстратов Table 2. The action of poly ferment preparations on solutions of model substrates
Препарат, активность эндо- и экзогенных ферментов, ед./мл Свойства субстрата
амилоза амилопектин
/л - ю2, м2 • с/ /,\/l'V< /л ■ io2. Л72 • С/ /А//-' Яг/ /АЯГ
глюкаваморин П10х Аэндо 108, АЖзо=529 1,4 V /27 2,23/ /б9 %0
амиломезентерин Г10х Аэндо=150, Аж-зо=916 0,9 V /49 6,10/ /15 22/ /340
амилоризин П10х Аэндо Аэкзо=482 1,31/ /32 3,3V /54 18/ /260
амилосубтилин Г10х Аэндо=450, Аж-=325 зо ~ 0,5 V /73 1,80/ /75 17/ /240
амилан ДСР Аэндо 920, Аэкзо= 60 0,2 V /87 2,0 V /71 1/ /120
Более сложным представляется выявление компонентов амилоризина и амилосубтилина. Однако неэквивалентные изменения вязкости амилозы по мере нарастания активности Аэндо позволяют предполагать, что в их составе присутствуют и деветвящие эндоферменты, способствующие разжижению амилопектина. Осахаривающим ферментом в их составе, очевидно, является Р-ами-лаза, обеспечивающая основной вклад в изменение показателя ЯГ.
Принципиальным моментом является то, что при жидкостном способе расшлихтовки ткани деструкция крахмала всеми видами ферментов сопровождается удалением продуктов гидролиза в раствор. При традиционных режимах подготовки льняных тканей, включающих пропитку расшлихтовывающим агентом и вылеживание мокроотжа-того полотна, образующиеся олигосахариды мигрируют вглубь материала, что затрудняет их удаление даже с применением моющих средств. Это подтверждают представленные на рис. 2 результаты анализа распределения крахмала в структуре ошлихтованных нитей льняной ткани арт. 590. При этом изотермы изменения содержания крахмала в
4.0
^v, масс. %
Gy
ПОВ
МЕ
G
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
х, мин
4.03.53.02.52.01.51.00.50.0
б)
0
10
20
30 х, мин
40
50
4.0 3.5 3.0-i 2.5 2.01.51.00.50.0
0
10
20 30 х, мин
40
50
60
дикой [5], а влияние биодеструкции оценивалось путем предварительной пропитки ткани раствором исследуемых ферментов при 40оС, последующей термостатируемой выдержки без обсыхания в течение 20 мин, промывки водой без ПАВ при 40оС и сушки при 80оС для полной инактивации энзимов.
Изменение положения начальной точки изотерм 2-10 характеризует количество крахмала Gy, расщепленного ферментами до водорастворимых продуктов и удаленного с ткани при промежуточной промывке. Экстраполяцией линейных участков кинетических кривых на начальный момент времени определено долевое соотношение фракций крахмала, дислоцированных соответственно на поверхности нити Gn0B, в межволоконных пространствах GMB и в структуре волокон GB. Полученные результаты приведены в табл. 3.
Таблица 3
Влияние биопрепаратов на изменение дислокации шлихты в мокроотжатой ткани (модельный эксперимент) и на эффективность ее расшлихтовки Table 3. The influence of bio preparations on change of size position in wet pressed fabric (model experiment) and on the desizing efficiency
Рис. 2. Изотермы десорбции крахмальной шлихты из льняной ткани арт. 590 в раствор амилосубтилина Г10х при 40 °С после обработки гомогенными (а, б) и мультиэнзимными ферментными препаратами (в): 1-исходная шлихта; 2-(3-амилазой; 3-а-амилазой; 4-изоамилазой; 5-у-амилазой; 6-амиломезентерином; 7- амилоризином; 8- амилосубтилином;
9- глюкаваморином; 10- амиланом ДСР Fig. 2. Isotherms of desorption of starch size from flax fabric of
article 590 into amylosubtilyne Г10х solution at 40°C after treatment of hogeneous (a,6) and multi-enzyme ferment preparations (в): 1 - initial size; 2-(3-amylaze; 3-a-amylaze; 4- iso amylase; 5 - Y-amylase; 6 - amylomesenteryne; 7- amylorisine; 8 -amylosubtiline; 9- glucaquamarine; 10-amylane ДСР
волокнистом материале (СК) при обработке раствором амилосубтилина Г10х суровой ткани (кр. 1) снимались в соответствии с вышеуказанной мето-
Ферментный препарат Доля фракций крахмала, % АСк, %
G У G ПОВ G МВ G В 40 мин 60 мин
- - 22 63 15 -
а-амилаза 19 7 57 17 51 76
Р-амилаза 5 19 61 15 15 25
изоамилаза 13 7 34 46 32 43
у-амилаза 5 18 62 15 22 36
глюкаваморин Г10х 14 12 58 16 31 51
амиломезен-терин Г10х 7 14 61 18 20 36
амилоризин П10х 10 6 45 39 29 48
амилосубти-лин Г10х 21 6 38 35 49 64
амилан ДСР 20 12 52 16 86 92
Как видно, деструкция полимеров крахмала по а-1,4-связям на поверхности нити и в межволоконных пространствах сопровождается преимущественным удалением продуктов гидролиза. Это в большей степени характерно для обработки а-амилазой, в меньшей - для Р-амилазы. Результатом деветвящего действия изоамилазы является миграция значительной части малоразветвленных декстринов в структуру волокон и их закрепление за счет образования многоточечных водородных связей с целлюлозой. Как следствие, доля фракции О |; повышается в 3 раза, что резко снижает степень удаления крахмала (АСК, %) по полуне-
прерывному способу расшлихтовки ткани. Вид изотерм 7 и 8 на рис. 2в, аналогичный ходу кр. 4 (рис. 2б), и приведенные в табл. 3 результаты их анализа убедительно свидетельствуют о наличии деветвящих ферментов в препаратах амилоризин и амилосубтилин. Под их влиянием доля фракции GВ более чем удваивается, что и обусловливает низкую степень расшлихтовки материала даже при увеличении длительности вылеживания мок-роотжатого полотна до 60 мин.
Результаты исследований позволили определить оптимальное сочетание амилолитических ферментов для расшлихтовки льняных тканей по полунепрерывному способу. Наиболее предпочтительным представляется комплексное воздействие на полимеры крахмала ферментов а-амилаза и у-амилаза. Небольшие количества последней могут обеспечить резкое разукрупнение макромолекул амилопектина (см. рис. 1), повышая тем самым возможность деструкции образующихся дестри-нов а-амилазой.
На этой основе создан экспериментальный препарат амилан ДСР, действие которого на полимеры крахмала проиллюстрировано в табл. 2 и 3. Обеспечивая эффективное расщепление и амилозы, и амилопектина, препарат практически не
увеличивает долевое содержание крахмала в волокне GB в результате деструкции фракций шлихты, дислоцированных на поверхности нити и в межволоконных пространствах, при длительном вылеживании мокроотжатой ткани, а переводит полимеры в водорастворимые продукты и олиго-меры, экстрагируемые из материала моющими средствами в полном цикле расшлихтовки. Это позволяет удалить внешне нанесенные фракции шлихты при длительности их расщепления в мок-роотжатой ткани 40 мин.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта №06-08-00600).
ЛИТЕРАТУРА
1. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов. Киев: Наукова думка. 1987.192 с
2. ГОСТ 20264.4-89. Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности.
3. Рухлядьева П.П., Полыгалина Г.В. Методы определения гидролитических ферментов. М.: Легпищепром. 1981. 290 с.
4. Dauville e D. et al. // Plant Science. 2000. Vol.157. P. 145-156.
5. Алеева С.В., Кокшаров С.А. // Изв. вузов. Технология текстильной промышленности. 2005. № 1. С. 19-22.
6. Allen J. D. Thoma J.A. // Biochem. J. 1976. Vol.159. N 1. P. 105-120.
Лаборатория химии растворов текстильных вспомогательных препаратов
УДК 615.36:547.454 012 Р.Х. Мударисова*, Л.А. Бадыкова*, Е.И. Коптяева**, А.А. Фатыхов*, Ю.Б. Монаков*
ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ АРАБИНОГАЛАКТАНА ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ (LARIX SIBIRICA L.) С АМИКАЦИНОМ И ГЕНТАМИЦИНОМ
(*Институт органической химии Уфимского научного центра РАН, Башкирский государственный университет) E-mail: [email protected]
Физико-химическими методами исследован процесс взаимодействия арабинога-лактана лиственницы сибирской (Larix Sibirica L.) с амикацином и гентамицином в водных растворах. Установлены состав и константа устойчивости образующихся комплексов, найдены оптимальные условия получения.
Ключевые слова: арабиногалактан, амикацин, гентамицин, комплексообразование, спектро-поглощение, ЯМР-спектр, водородные связи
Создание новых биологически активных соединений на основе полисахаридов с лекарственными препаратами представляет интерес как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. Известно, что природный полисахарид арабиногалактан ^апх Sibiгica L.) обладает уникальными
свойствами: высокой и разнообразной биологической активностью, нетоксичностью, водораствори-мостью и способностью к биодеградации [1-8]. Поэтому арабиногалактан можно рассматривать как перспективную матрицу для создания лекарственных препаратов пролонгированного действия.
