CC BY
6
ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРОВ БЕЛКОВ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ БАКТЕРИЙ И ВНЕКЛЕТОЧНЫХ БЕЛКОВ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ РАЗНЫХ ДОЗ ОЗОНА
Н.А. Кувакина, С.П. Перетягин, А.А. Стручков
ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород ООО «Лаборатория ТОНУС», Нижний Новгород Ассоциация российских озонотерапевтов, Нижний Новгород
Исследовано влияние на микробную клетку резистентного госпитального штамма синегнойной палочки озонированного физиологического раствора (ОФР), насыщенного газовой смесью с концентрацией озона 1000 мкг/л., с помощью изучения белков и белковых фракций наружной мембраны изучаемых стандартных штаммов и внеклеточных белков. Сравнительный анализ электрофореграмм обработанных и необработанных ОФР культур не показал различий в спектрах белков наружной мембраны и внеклеточных белков, что свидетельствовало о наличии у госпитальных штаммов синегнойных бактерий мощных адаптационных механизмов, благодаря которым они сохраняли способность выживать в неблагоприятных условиях. Снижение вирулентности происходило в результате механизмов взаимодействия молекулы озона с липид-содержащими структурами микробной клетки.
Ключевые слова: синегнойная палочка, резистентность, озонированный физиологический раствор
Abstract
The effect of a resistant hospitalized strain of Pseudomonas aeruginosa on ozonized physiological saline saturated with a gas mixture with an ozone concentration of 1000 ^g/l was estimated by studying proteins and protein fractions of the outer membrane of the studied standard strains and extracellular proteins. A comparative analysis of the electrophoregrams of the treated and untreated OFR cultures did not show differences in the spectra of the outer membrane proteins and extracellular proteins, which indicated the presence of powerful adaptive mechanisms in hospital strains of Pseudomonas aeruginosa, due to which they retained the ability to survive under adverse conditions. The decrease in virulence occurred as a result of the mechanisms of interaction of the ozone molecule with lipid-containing structures of the microbial cell.
Key words: Pseudomonas aeruginosa, resistance, ozonized physiological saline
Среди биологических эффектов озона традиционно первое место занимает бактерио-, фунги- и вирицидный эффект озона. Это прямое действие озона
проявляется при наружном применении его различных модификаций, особенно в высоких концентрациях. При этом, в отличие от многих известных антисептиков, озон не раздражает и не разрушает покровные ткани человека в связи с тем, что, в противоположность микроорганизмам, организм человека обладает мощной антиоксидантной системой защиты (Масленников О.В., Конторщикова К.Н., Шахов Б.Е., 2016).
На практике прямое бактерицидное действие озона может быть менее выражено особенно при генерализованной инфекции: во время озонирования крови ex vivo (инфузии озонированного физиологического растворе, трансфузия озонированной аутокрови пациента). Это происходит вследствие того, что, создавая высокий окислительный потенциал (биоцидный), молекула озона, оказывая прямой лизисный эффект на микробную клетку будет также деструктивно влиять и на клеточные ансамбли окружающих её биологические объектов. Поэтому при системном воздействии озона, его концентрации и дозы должны быть существенно ниже бактерицидных концентраций, использующихся, например, для обеззараживания воды. Ранее нами были показаны результаты воздействий низких концентраций озона на биологические свойства синегнойных бактерий. Было установлено негативное влияние озона на ряд факторов патогенности микробной клетки (адгезивность, ростовые свойства, плазмидный состав) (Кувакина Н.А., 2001, 2019). Представлял интерес оценить в аналогиченых условиях характер влияния озона на белковый состав оболочки микробной клетки.
Спектры белков наружной мембраны бактерий являются уникальной штаммовой характеристикой и являются паспортом штамма.
Внеклеточные белки обладают токсическими свойствами и как любые токсины, играют значительную роль в патогенезе многих заболеваний бактериальной природы. Экзобелки являются потенциально летальными ферментами. Они используются микробиологами в качестве полезных критериев для идентификации и дифференциации бактерий. Внеклеточными принято считать белки, обнаруживаемые в периплазматическом пространстве или в культуральной жидкости активно развивающихся клеток.
Показано, что основная часть экзобелков выходит в стационароной фазе роста, но многие микроорганизмы могут секретировать экзобелки по всему ростовому циклу, даже если скорость синтеза выше в стационарной фазе клеток.
На синтез белков могут оказывать влияние различные факторы. Среди них наиболее известны физические (температурные, радиационные и т.п.), физико -химические (рН, рО2, рСО2) биологические (бактериофаги, бактериальные токсины и т.п.). Действие неблагоприятных факторов на микробные клетки приводит к изменениям мембран, синтезу протекторных соединений (углеводов, аминокислот и др.), образованию ростингибирующих соединений и специальных белков (Феофилова Е.П., 1992; Рощина Е.К., Петров Л.Н., 1997)
В последние годы в связи со значительными достижениями в области геномики и протеомики интерес бактериологов к изучению клеточных белков значительно возрос. (Cordwell S. et al., 1999; Mann M., 1999; Washburn M.P., Yates J.R., 2000).
Обнаружение гена само по себе еще не означает, что он экспрессируется в любом случае, в то же время обнаружение кодируемого геном продукта и определение его количества, как правило, должны учитываться при характеристике свойств клетки, т.е. таким образом можно по характеру белковой экспрессии уловить изменения, ведущие к патогенности, антибиотикорезистентности и т.д.
В поисках средств борьбы с инфекциями различной этиологии большое значение будут иметь исследования, направленные на изучение белковых фракций патогенности микробных клеток в условиях применения антибактериальных и антисептических средств.
Широкое использование озона в медицине связано с бактерицидным действием, основанном на повреждении озоном биомембран бактериальных клеток, в результате чего происходят ее выраженные структурные изменения и нарушается барьерная функция. (Конев С.В. соавт.,1992; Конопельцев И.Г. с соавт., 2005; Mudd I. et а1., 1977). Возможно, что за счет изменения проницаемости мембран происходит окислительная деструкция ДНК и РНК бактерий, в связи с чем может блокироваться синтез белков. Мы решили проверить это предположение.
В задачу исследования входило определение спектра белков наружной мембраны и спектра внеклеточных белков у 10 штаммов синегнойных бактерий, выделенных из крови ожоговых пациентов с бактериемией и сепсисом до и после воздействия на них ОФР.
Учитывая результаты работы в плане эффективности ОФР с концентрациями озона 200 мкг/л, 600 мкг/л и 1000 мкг/л, при определении адгезивной способности, исследовании ростовых свойств, фагоцитабельности, целесообразно было исследовать белковые системы бактерий после действия максимальной, из изучаемых нами концентрации озона в физиологическом растворе - 1000 мкг/л.
Материал и методы
Для решения поставленной задачи выполнены эксперименты in vitro с применением озонированного физиологического раствора (ОФР) с тремя концентрациями озона: 200 мкг/л, 600 мкг/л и 1000 мкг/л.
В экспериментах in vitro использованы 9 гемокультур P. aeruginosa, выделенных от пациентов с ожоговым сепсисом и стандартный штамм P. aeruginosa "Тесаков" из Государственной коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Для изучения спектра белков наружной мембраны выделяли наружные мембраны, получали их экстракты и электрофореграммы. Выделение наружной мембраны проводили по ранее отработанному методу Г.К. Дегтевой (1999). Фракционирование белков наружной мембраны проводили в ПААГ с додецилсульфатом натрия по Weber и Osborn. Электрофорез белков наружной мембраны проводили в стеклянных трубках диаметром 6 мм длиной 10 см. Фракционирование внеклеточных белков псевдомонад проводили с помощью электрофореза в ПААГ по Davis и Ornstein.
Суточные агаровые культуры синегнойных бактерий до и после обработки (ОФР) использовали для постановки методик фракционирования белков
наружной мембраны и внеклеточных белков. Протеинограммы оценивали визуально путем сопоставления их в проходящем свете со стандартными электрофореграммами эталонных культур.
Результаты
Типирование исследованных штаммов псевдомонад по спектрам белков наружной мембраны показало отсутствие различий в белковых профилях между обработанными и необработанными озоном культурами (рис. 1 и 2).
Рис. 1. Спектр белков наружной мембраны синегнойных бактерий до воздействия ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л. (слева направо: 539; 768; 396; 419; 21;
479; 852; 445; 480; Тесаков)
Анализ спектров белков наружной мембраны изучаемых штаммов позволил условно разделить их по идентичности на три группы. Одну группу составили штаммы № 768, №396, № 539 (рис.3), имеющие одинаковый рисунок расположения белковых фракций, который был отличен от протеинограмм бактерий второй группы. Вторая группа объединила сходные по мембранным белкам изоляты №21, №419, №479 (рис.4). Четыре другие культуры имели отличные друг от друга белковые спектры, соответствующие разным штаммам №852; №445; №480; «Тесаков» (рис.5).
Культуры бактерий, имеющие одинаковые спектры белков наружной мембраны, считают одним штаммом. Таким образом, внутри двух групп выявлена принадлежность субкультур к двум штаммам вида Pseudomonas aeruginosa.
Рис. 2. Спектр белков наружной мембраны синегнойных бактерий после воздействия ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л. (слева направо: 539; 768;
396; 419; 21; 479; 852; 445; 480; Тесаков)
Изучение спектров внеклеточных белков исследованных штаммов псевдомонад показало совпадение белкового профиля тестируемых культур и не выявило различий между протеинограмами обработанных и необработанных озоном штаммов (рис. 6 и 7).
Рис. 3 Группа 1 штаммов, идентичных по рисунку белкового спектра (слева направо: 539; 768; 396)
Рис. 4. Группа 2 штаммов синегнойных бактерий, идентичных по рисунку белкового спектра (слева направо: 419; 21; 479)
Рис. 5. Группа 3 штаммов синегнойных бактерий разных по рисунку белкового спектра (слева направо: 852; 445; 480; Тесаков)
Рис. 6. Спектр внеклеточных белков синегнойных батерий до воздействия ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л (слева направо: 445; 419; 396; 21; Тесаков; 768;
852; 539; 480; 479)
Проведенные исследования показали, что 6 культур из 10 имеют рисунок расположения белковых фракций, характерный для субкультур двух штаммов вида Pseudomonas aeruginosa.3TO позволяет характеризовать эти штаммы как госпитальные.
Электрофореграммы внеклеточных белков синегнойных бактерий имели высокую степень сходства, что указывало на родовую принадлежность псевдомонад.
Рис. 7 Спектр внеклеточных белков синегнойных батерий после воздействия ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л (слева направо: 445; 419; 396; 21;
Тесаков; 768; 852; 539; 480; 479)
При изучении действия ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л на микробную клетку выявлено, что экзобелки и белки наружной мембраны не изменялись. Это свидетельствует о наличии мощных адаптационных механизмов у госпитальных синегнойных бактерий, благодаря которым они сохранили способность выживать в неблагоприятных условиях, что особенно важно для сохранения патогенности и вида в целом.
Анализ протеинограмм белков наружной мембраны изучаемых псевдомонад подтверждал их госпитальное происхождение. Внутри 2 групп штаммов, выделенных в разное время (с 1997 по 2001 гг.), выявлены культуры, имеющие одинаковый рисунок расположения белковых фракций. Это позволяет характеризовать эти штаммы как госпитальные
Сравнение электрофореграмм обработанных и необработанных ОФР культур не показало различий в спектрах белков наружной мембраны и внеклеточных белков. Это свидетельствует о наличии мощных адаптационных механизмов у госпитальных синегнойных бактерий, благодаря которым они сохранили способность выживать в неблагоприятных условиях, что особенно важно для сохранения патогенности и вида в целом.
Ранее при электронно-микроскопических исследованиях влияния озонидов на структуру клетки микробов St. aureus и E. соН через час после воздействия в условия. В условиях in vitro были установлены нарушения структуры клеток в 80% микробной массы. Это происходило за счёт локальных повреждений биополимеров клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, которые заключались в утрате этими структурами типичного слоистого строения, что несомненно нарушало избирательную проницаемость мембран и сопровождалось лизисом микроорганизмов за счёт активизации собственных ферментных систем.
(Конопельцев И.Г., Видякина Е.В., Костяев А.А., 2005).
Заключение
Таким образом, оценивая влияние молекул озона на белковый компонент синегнойной бактерии можно констатировать что в диапазоне исследуемых концентраций, использованных для насыщения газом физиологического раствора большее воздействие на снижение вирулентных свойств микробов активный кислород оказывает через механизмы своего взаимодействия с липидсодержащими структурами микробной клетки (снижение адгезивности, повышение фагоцитабельности госпитальных синегнойных бактерий, сдерживание ростовых свойств, модификационных изменениях плазмид).
Список литературы
1. Дегтева Г.К., Беляева Е.В., Ермолина Г.Б. Беловые системы бактерий. Роль в таксономии и эпидемиологической практике. Монография. Нижний Новгород: изд-во ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 1999. 138 с.
2. Конев С.В., Матус В.К Озонотерапия: молекулярно-мембранные основы. Мат. 1-й Всеросс. научно-практ. конф. «Озон в биологии и медицине» Нижний Новгород, 1992. С. 1.
3. Конопельцев И.Г., Видякина Е.В., Костяев А.А. Ультраструктурные изменения у микроорганизмов при обработке озонированным рыбьим жиром // Нижегородский медицинский журнал. 2005. Прил. «Озон в биологии и медицине». С. 236-237.
4. Конопельцев И.Г., Троегубов Д.А., Платонов В.А. Антимикробные свойства новой озонированной эмульсии // Нижегородский медицинский журнал. 2005. Прил. «Озон в биологии и медицине». С. 238.
5. Кувакина Н.А., Перетягин С.П., Стручков А.А. Изменения ростовых свойств, плазмидного состава и чувствительности к антибиотикам у госпитальных синегнойных бактерий ожогового стационара после воздействий на них озонированного физиологического раствора // Биорадикалы и антиоксиданты 2019 № 4 С 8- 22
6. Кувакина Н.А., Пылаева С.И., Перетягин С.П. Экспериментальные предпосылки использования озона для борьы с синегногйной госпитальной инфекцией // Мат. научн. конф. «Актуальные проблемы травматологии и ортопедии» в рамках междунар. Форума «Человек и травма». Нижний Новгород, 2001. С. 199-200.
7. Масленников О.В., Конторщикова К.Н., Шахов Б.Е. Руководство по озонотерапии. Нижний Новгород, 2018. 346 с.
8. Никулин Д.М. Иммунный статус телят и пути его коррекции // Тез.докл Всеросс.научно-практ. конф., посвящ. 30-летию ВНИИТИБП. Щелково, 2000. С. 276-277.
9. Рощина Е.К., Петров Л.Н. Выделение белка во внеклеточное пространство как неспецифическая реакция Escherichia coli на стресс // Микробиология. 1997. Т.66, №2. С. 179-184.
10. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз // Микробиология. 1992. Т.61, №5. С. 741-755.
11. Cordwell S., Noawens A.,Verrills N. et al. The microbial proteome
database - an automated laboratory. Catalogue for monitoring protein expression in bacteria // Electrophoresis. 1999. №20. P. 3580-3588.
12. Mann M. Quantitative proteomics? // Nat Biotechnol. 1999. Vol. 17. P. 954-955.
13. Mudd I., Freeman B.A. Reaction of ozone with biological membranes // Biochem. Eff. Environ Pdl. Ann. Arter. Science. 1977. Vol. 7. P. 97-133.
14. Washburn M.P., Yates J.R. Analysis of the microbial proteome // Current Opinion. Microbiol. 2000. №3. P. 292-297.
