CC BY
3
МОДИФИКАЦИЯ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ ГОСПИТАЛЬНЫХ СИНЕГНОЙНЫХ БАКТЕРИЙ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЙ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА
Н.А. Кувакина, С.П. Перетягин, А.А. Стручков
1ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород ООО «Лаборатория.ТОНУС», Нижний Новгород Ассоциация российских озонотерапевтов, Нижний Новгород
Abstract
The adhesive properties of hospital strains of P. Aeruginosa were investigated. The concentrations of ozone in physiological saline (200 ^g/L) have been determined to multidirectionally affect the adhesive ability of microbial cells. Concentrations of dissolved ozone and inhibitory adhesive properties of bacteria (600 and 1000 ^g/l) are shown.
Key words: adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa, ozonized physiological saline, decrease in the pathogenicity of microbe cells
Исследованы адгезивные свойства госпитальных штаммов Р. Aeruginosa. Установлены концентрации озона в физиологическом растворе (200 мкг/л) разнонаправленно влияющие на адгезивную способность микробных клеток. Показаны концентрации растворённого озона, угнетающие адгезивные свойства бактерий (600 и 1000 мкг/л).
Ключевые слова: адгезивные свойства синегнойных бактерий, озонированный физиологический раствор, снижение патогенности микробной клетки
Адгезивная активность микроорганизмов является одним из маркеров патогенности. Адгезивные свойства бактерий играют важную роль в развитии инфекционного процесса, обеспечивая прикрепление бактерий к различным органам и тканям. Адгезия создает предпосылки для размножения бактерий. Процесс адгезии основывается на избирательном взаимодействии бактерий с рецепторами эпителиоцитов и /или покрывающем их слоем слизи (муцинами). Некоторые бактерии активно готовят участки для закрепления, обнажая клеточные рецепторы, пользуются дефектами в эпителиальном покрове, сорбируются на ранее прикрепленных бактериях или взаимодействуют с растворимыми белками (например, фибронектином), опосредуя через них закрепление на клеточных рецепторах и соединительно-тканном матриксе (Езепчук Ю.Б., 1986; Сидоренко С.В., 2001).
Реализация патогенетического потенциала синегнойной палочки зависит от закрепления возбудителя во входных воротах. Синегнойная палочка не колонизирует здоровую кожу и слизистые оболочки, но при их физической деструкции или сопутствующей патологии такая возможность появляется (Мороз А.Ф., 1988). Синегнойная палочка обладает галактозо- и маннозофильными пилями, являющимися адгезинами и обуславливающими прилипание клеток к эпителию дыхательных путей и эпидермиса. Адгезия возбудителя наблюдается у лиц с нарушением фибронектинового слоя вследствие основного заболевания или факторов, воздействующих при нахождении в стационаре. При лечебных и диагностических мероприятиях, а также при операциях, приводящих к повреждению эпителиальной ткани, усиливается прилипание, и как следствие увеличивается частота колонизации.
Установлена роль гликокаликса (полимер альгиновой кислоты, экзополисахарид, мукоид) как адгезина синегнойной палочки (Costerton J., 1984; Ramphal R., Pier B., 1985) Обуславливая адгезию Р. aeruginosa к поверхности клеток хозяина, он позволяет также формировать микроколонии (биопленку), которые защищают микроб от клеточных и гуморальных факторов иммунитета. (Oliver A.,Weir D., 1985).
В процессе адгезии между бактериальной и эукариотической клеткой происходит «диалог», каждый из участников которого по-своему отвечает на сигналы партнера. Микроорганизмы не только механически закрепляются в новой экологической нише, но и начинают адекватную новым условиям перестройку метаболизма, что в свою очередь ведет к экспрессии ряда генов вирулентности. В клетках макроорганизма высвобождаются особые вещества -церамиды, стимулирующие синтез ряда цитокинов (IL-1,IL-6,IL-8), последствием активации которых является миграция фагоцитов в субэпителиальные слои (Сидоренко С.В., 2001). Таким образом, адгезия служит сигналом к запуску инфекционного процесса - каскада сложных реакций, как у бактерий, так и у макроорганизма. Возможность влияния на процессы адгезии и последующей колонизации всегда представляла научный и практический интерес (Афиногенов Г.Е. с соавт., 1987; Бриллис В.И. с соавт., 1990; Наумкина А.А. и соавт., 1997; Павлова И.Б, 1999; Павлова И.Б., Ленченко Е.М., 2002).
Целью настоящей работы явилось исследование влияния бактерицидных концентраций озона в физиологическом растворе на патогенные свойства гемокультур высоковирулентной госпитальной микрофлоры.
Материал и методы исследования
Для решения поставленных задач выполнены эксперименты in vitro и in vivo с применением ОФР с тремя концентрациями озона - 200 мкг/л, 600 мкг/л и 1000 мкг/л.
В экспериментах in vitro использованы 9 гемокультур P. aeruginosa, выделенных от пациентов с ожоговым сепсисом и стандартный штамм P. aeruginosa "Тесаков" из Государственной коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича. У микроорганизмов до и после воздействия ОФР изучали: культуральные свойства, ферментативную активность с помощью тест-систем (Lachema, Чехия); чувствительность к антибиотикам диско-диффузионным методом; ростовые
свойства фотометрическим методом с помощью автоматического микробиологического анализатора iEMS Reader "Labsystems" и программы «Микроб»; адгезивную способность по В.И. Бриллис и соавт. (1986); фагоцитабельность бактерий определяли по ИЗФ методом З.Е. Матусис и С.И. Пылаевой (1972). Белки наружной мембраны изучаемых штаммов исследовали по Weber и Osborn (1969); внеклеточные белки по Davis и Ornstein (1992); плазмидные профили по Kado, Liu (1981) и суммарную плазмидную ДНК (заявка на изобретение №2006109988 от 23.03.06). В представленном сообщении из общей картины полученных результатов микробиологических исследований представлены только данные о свойствах адгезивности гемокультур P. аeruginosa как одного из факторов патогенности вирулентной микрофлоры и влиянию на них воздействий озоном.
Эксперименты in vivo проведены на 145 обожженных мышах с глубоким контактным ожогом общей площадью 20% поверхности тела. У 50 животных определяли фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови после трехкратного (через сутки, двое и трое после ожога) внутрибрюшинного введения ОФР разных концентраций. У 95 животных оценивали влияние ОФР на течение генерализованной синегнойной инфекции. Для индукции инвазивного типа генерализованной инфекции использовали взвесь стандартного штамма Pseudomonas aeruginosa «Тесаков», которую вводили подструпно по 0,1 мл (50 млн. МТ), трехкратно, через сутки, двое и трое после ожога. Растворы с озоном вводили внутрибрюшинно в те же сроки: животным контрольной группы - по 0,2 мл стерильного физиологического раствора, а животным опытной группы - по 0,2 мл ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л.
Летальность оценивали на 7 сутки. Выживших мышей забивали. Всех мышей вскрывали с соблюдением правил асептики, проводили гистоморфологические и бактериологические исследования внутренних органов: сердца, легких, печени, почек, селезенки.
Озонированный физиологический раствор получали из стандартного раствора хлорида натрия изотонического 0,9% для инъекций (изготовитель ОАО «Красфарма», г. Красноярск) с помощью аппарата озонотерапии с деструктором озона АОТ-Н-01 - Арз-01 (ТУ 9444-001-07513518-97), код ОК - 005(ОКп); 944464; сертификат соответствия № РОСС RU,ME 34 ВО1010; срок действия по 14.06.2008, №5319253.
Концентрацию растворенного в физиологическом растворе озона определяли с помощью оптического анализатора концентрации озона в жидкой среде ИКОЖ-5 (№29708-05 в Государственном реестре средств измерений).
Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с помощью пакета программ "Statistica" (StatSoft-Russia,1998). При статистическом анализе выполняли парные групповые сравнения с использованием критериев Стьюдента и Фишера. Результаты считали достоверными при р<0,05.
Результаты
Проведено изучение адгезивности госпитальных изолятов гемокультур синегнойных бактерий до и после воздействия на них ОФР с концентрациями озона 200 мкг/л, 600 мкг/л и 1000 мкг/л in vitro.
Выполняли определение количества микробных клеток, прикрепленных к одному эритроциту, вычисляя средний показатель адгезии (СПА). Подсчет велся на 50 эритроцитах в разных участках мазка. Затем вычисляли индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ) - среднее количество микроорганизмов на одном, участвующем в адгезивном процессе эритроците. Микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ менее 1.75, низкоадгезивными - от 1.76 - 2.5, среднеадгезивными - от 2.51 - 4.0 и высокоадгезивными при ИАМ выше 4.0.
Исходный ИАМ синегнойных бактерий до воздействия ОФР оказался высоким и средним, т.е был в пределах от 2.51-4.0 и выше.
Определение адгезивности гемокультур синегнойных бактерий до и после воздействия на них ОФР показало, что концентрация озона в ФР 200 мкг/л разнонаправленно влияла на микробные клетки: у одних штаммов снижала, а у других - стимулировала их адгезивную способность (табл. 1).
Таблица 1. Индекс адгезивности (ИА) синегнойных бактерий после воздействия _ ОФР с концентрацией озона 200 мкг/л_
Название (номер) штамма Индекс адгезивности
Исходный Через 30 минут через 60 минут
«тесаков» 2,64 ± 0,05 2,90 ± 0,07* 3,53 ± 0,02*
396 3,97 ± 0,03 4,30 ± 0,04* 3,51 ± 0,02*
21 3,75 ± 0,03 3,70 ± 0,05 3,10 ± 0,02*
419 4,15 ± 0,05 3,05 ± 0,02* 2,90 ± 0,05*
480 4,52 ± 0,05 4,02 ± 0,03* 2,71 ± 0,04*
539 3,65 ± 0,03 5,29 ± 0,05* 4,70 ± 0,02*
479 2,81 ± 0,04 2,81 ± 0,05 2,32 ± 0,02*
768 3,73 ± 0,04 5,60 ± 0,05* 2,92 ± 0,05*
445 3,32 ± 0,04 3,12 ± 0,07 2,10 ± 0,03*
852 4,19 ± 0,06 4,00 ± 0,05 3,80 ± 0,03*
Примечание. «*» - статистически достоверные различия в сравнении с исходным уровнем адгезивности ф<0,05)
После 30-минутного контакта микроорганизмов с ОФР с концентрацией озона 600 мкг/л (табл. 2) у пяти штаммов из десяти (№396,21 539, 445, 852) утрачивалась способность к адгезии (ИАМ менее 1.75), а остальные («Тесаков», №№ 419, 480, 479, 768) снижали ИАМ до низких значений. Взаимодействие синегнойных палочек и ОФР той же концентрации в течение 1 часа приводило к снижению адгезивных свойств: практически все штаммы становились низкоадгезивными.
Таблица 2. Индекс адгезивности (ИА) синегнойных бактерий после воздействия _ОФР с концентрацией озона 600 мкг/л_
Название (номер) штамма Индекс адгезивности
Исходный через 30 минут через 60 минут
«тес» 2,64 ± 0,05 1,83 ± 0,07* 1,87 ± 0,04*
396 3,97 ± 0,03 1,67 ± 0,05* 1,71 ± 0,07*
21 3,75 ± 0,03 1,70 ± 0,05* 2,80 ± 0,05*
419 4,15 ± 0,05 2,12 ± 0,06* 2,30 ± 0,04*
480 4,52 ± 0,05 2,03 ± 0,07* 1,81 ± 0,05*
539 3,65 ± 0,03 1,62 ± 0,04* 2,40 ± 0,03*
479 2,81 ± 0,04 2,21 ± 0,06* 2,30 ± 0,05*
768 3,73 ± 0,04 2,09 ± 0,06* 2,40 ± 0,07*
445 3,32 ± 0,04 1,42 ± 0,06* 2,10 ± 0,05*
852 4,19 ± 0,06 1,70 ± 0,06* 2,10 ± 0,04*
Примечание. «*» - статистически достоверные различия в сравнении с исходным уровнем адгезивности ф<0,05)
Эффективность ОФР концентрации 1000 мкг/л оказалась еще выше (табл.3). Через 30 минут контакта синегнойных палочек с ОФР более половины штаммов переходили из разряда высоко- и средне - адгезивных - в разряд неадгезивных (№ 396, 419, 480, 479, 445, 852), остальные (« Тесаков», №21, 539, 768) становились низкоадгезивными. Адгезивная активность псевдомонад при более длительной экспозиции в течение 1 часа изменялась примерно так же.
Таблица 3. Индекс адгезивности (ИА) синегнойных бактерий после воздействия _ ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л_
Название (номер) штамма Индекс адгезивности
Исходный через 30 минут через 60 минут
«тес» 2,64 ± 0,05 1,95 ± 0,04* 1,46 ± 0,07*
396 3,97 ± 0,03 1,69 ± 0,07* 1,57 ± 0,05*
21 3,75 ± 0,03 2,41 ± 0,06* 1,98 ± 0,04*
419 4,15 ± 0,05 1,53 ± 0,07* 1,74 ± 0,02*
480 4,52 ± 0,05 1,70 ± 0,06* 1,66 ± 0,04*
539 3,65 ± 0,03 2,00 ± 0,05* 1,31 ± 0,04*
479 2,81 ± 0,04 1,37 ± 0,06* 1,21 ± 0,07*
768 3,73 ± 0,04 2,12 ± 0,07* 1,40 ± 0,03*
445 3,32 ± 0,04 1,59 ± 0,02* 2,09 ± 0,04*
852 4,19 ± 0,06 1,70 ± 0,05* 2,06 ± 0,03*
Примечание. «*» - статистически достоверные различия в сравнении с исходным уровнем адгезивности ф<0,05)
Результаты эксперимента показали, что использование озонированного физиологического раствора с концентрацией озона 200 мкг/л изменяло уровень ИАМ синегнойных бактерий, но, всё-таки, все штаммы сохраняли способность к
адгезии. После контакта микроорганизмов с озонированным физиологическим раствором 600 мкг/л и 1000 мкг/л половина штаммов и более утрачивали адгезивность, остальные снижали ИАМ до уровня низких значений. Установлено, что ОФР угнетает адгезивные свойства госпитальных синегнойных бактерий, вследствие чего нарушаются процессы прикрепления и дальнейшего взаимодействия микробных клеток и клеток макроорганизма.
Заключение
Исследования адгезивной способности Р.aeruginosa - одного из важных факторов патогенности показали, что культуры имели высокий и средний исходный индекс адгезивности (ИА). Концентрация озона в ФР в 200 мкг/л разнонаправленно влияла на микробные клетки: у одних штаммов снижала, а у других - стимулировала их адгезивную способность.
После контакта микроорганизмов с озонированным физиологическим раствором с концентрацией озона 600 мкг/л и 1000 мкг/л у всех штаммов снижался уровень ИАМ и более половины штаммов переходили из разряда высоко- и средне- адгезивных - в разряд неадгезивных. Максимальное по эффективности и продолжительности действие оказывал ОФР с насыщающей концентрацией озона 1000 мкг/л., ослабляя патогенность госпитальных штаммов гемокультур синегнойных бактерий.
Снижение и утрата адгезивной способности синегнойных бактерий стали результатом окислительного взаимодействия озона и структур, участвующих в адгезии -тонких нитей пилинов - полипептидов, входящих в состав пилей, а также гликолипопротеида слизи (Мороз А.Ф.,1988; Сидоренко С.В., 2001, 2003; Ramphal R.,1985). В структуре молекул адгезинов могли произойти конформационные химические изменения, нарушающие процессы прикрепления и дальнейшего взаимодействия микробных клеток и клеток макроорганизма.
Список литературы
1. Афиногенов Г.Е., Елинов Н.П. Антисептики в хирургии. Л.: Медицина, 1987. 144 с.
2. Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. Формирование микробной биопленки под влиянием антисептиков и антисептических средств на модели культуры клеток // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер. 2005. Прил. С. 1213.
3. Бриллис В.И., Брилине Т.А., Тюваева Р.Ф. и др. О возможности влияния на цитадгезию микроорганизмов // Антибиотики и колонизационная резистентность: Тр. НИИ антибиотиков. М., 1990. Вып. 19. С. 187.
4. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.: Медицина, 1986. 240 с.
5. Мороз А.Ф. Синегнойная инфекция. М.: Медицина, 1988. 256 с.
6. Наумкина Е.В., Обгольц А.А., Рейс Б.А., Чернышов А.К. Влияние сорбирующих материалов на гидрофобность и адгезивность гр- микроорганизмов // Эфферентная терапия. 1997. Т.3, №1. С. 26-28.
7. Павлова И.Б. Закономерности развития популяций бактерий в окружающей среде (электронно-микроскопическое исследование): Автореф. ... дисс.д-ра биол. наук. М., 1999. 22 с.
8. Павлова И.Б., Ленченко Е.М. Электронно-микроскопическое исследование адгезивности бактерий // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2002. №1. С. 3-6.
9. Сидоренко С.В. Инфекционный процесс как «диалог» между хозяином и паразитом // Клинич. микробиология и антимикробная терапия. 2001. Т. 3, №4. С. 301-315.
10. Ramphal R., Pier G.B. Role of Pseudomonas aeruginosa mucoid exopolysaccharide in adherence to tracheal cells // Infect. and Immun. 1985. Vol. 47, №1. P. 1-4.
