CC BY
8
ИЗМЕНЕНИЯ РОСТОВЫХ СВОЙСТВ, ПЛАЗМИДНОГО СОСТАВА И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ У ГОСПИТАЛЬНЫХ СИНЕГНОЙНЫХ БАКТЕРИЙ ОЖОГОВОГО СТАЦИОНАРА ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЙ НА НИХ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА
Н.А. Кувакина, С.П. Перетягин, А.А. Стручков
ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России, Нижний Новгород ООО «Лаборатория ТОНУС», Нижний Новгород Ассоциация российских озонотерапевтов, Нижний Новгород
Abstract
Growth properties, plasmid composition and sensitivity to antibiotics in hospital pseudomonasal bacteria of a burn hospital after exposure to ozonated saline solution were studied. Changes in pathogenicity factors leading to inhibition of bacterial growth properties have been established. The concentrations of ozone in the saline solution that lead to the greatest changes in the LAG phase, expressed in the lengthening of its time , are justified.
Key words: ozonized saline, bacterial growth, strain plasmid profile, antibiotics resistance, burns, wound, infection, bactericide effect
Исследованы ростовые свойства, плазмидный состав и чувствительность к антибиотикам у госпитальных синегнойных бактерий ожогового стационара после воздействий на них озонированного физиологического раствора. Установлены изменения факторов патогенности, приводящие к угнетению ростовых свойств бактерий. Обоснованы концентрации озона в физиологическом растворе, приводящие к наибольшим изменениям в ЛАГ - фазе, выражающиеся в удлинении её времени.
Ключевые слова: озонированный физиологический раствор, ростовые свойства бактерий, плазмидный профиль штаммов, антибиотикорезистентность, снижение патогенности микробов, ожоги, рана, инфекция, бактерицидный эффект
Устойчивость синегнойной палочки во внешней среде, непритязательность к условиям питания, наличие мощных факторов вирулентности, природная резистентность к антибактериальным препаратам определяют широту ее распространения и формирования госпитальных штаммов, что превращает ожоговый стационар в "эпидемиологический очаг" синегнойной инфекции
(Азолов В.В. и соавт., 1996; Руднов В.А., 2002; Сидоренко C.B., 2003; Komolafe O.O. еt а!., 2003; Li T.Z. еt а1, 2003).
Целью настоящей работы явилось исследование влияния биоцидности озона в физиологическом растворе на ростовые свойства, плазмидный состав и чувствительность к антибиотикам высоковирулентной полирезистентной госпитальной микрофлоры
Материал и методы исследования
С целью оценки биологических особенностей синегнойных бактерий, подвергнутых прямому воздействию озонированного физиологического раствора, исследовались их ростовые свойства, плазмидный состав, чувствительность к антибиотикам.
Для решения поставленных задач выполнены эксперименты in vitro и in vivo по действию ОФР с тремя концентрациями озона: 200 мкг/л, 600 мкг/л и 1000 мкг/л.
В экспериментах in vitro использованы 9 гемокультур P. aeruginosa, выделенных от пациентов с ожоговым сепсисом, и стандартный штамм P. aeruginosa "Тесаков" из Государственной коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича. У микроорганизмов до и после воздействия ОФР изучали: чувствительность к антибиотикам диско-диффузионным методом на агаре Мюллер-Хинтона по общепринятой методике согласно МУК 4.2.1890-04 (2004).; ростовые свойства фотометрическим методом с помощью автоматического микробиологического анализатора iEMS Reader "Labsystems" и программы BACT 3.5" (АОЗТ "Аналитика", г. Москва);
Плазмидный анализ проводился двумя способами: модификацией метода Бирнбойма и Доли (Birnboim, Doli) и согласно методике Кадо и Лю (Kado, Liu). Первый - основанный на щелочной денатурации в присутствии хлористого лития отработан в основном для кишечных бактерий и дает удовлетворительные результаты при обнаружении плазмид средней величины (Леванова Г.Ф. и соавт., 1995). Второй метод наиболее удобен для выявления крупных плазмид (Харди К., 1990) конечный результат получился за счет обобщения 3-4 повторных определений.
Изучение количественного содержания суммарной плазмидной ДНК до озонирования и после воздействия различными дозами озона (копийность плазмид). Определение копийности плазмид довольно сложный процесс, включающий разделение плазмид, элюцию интересующей и сравнение ее со стандартной (Томас К.М.,1990). Поскольку увеличение копий плазмиды представляет собой увеличение общего количества плазмидной ДНК (п-ДНК), в работе использовался упрощенный способ определения суммарного количества п-ДНК в штаммах бактерий, основанный на модификации известных методов отделения плазмидной ДНК от хромосомной (Ivanov I.G., Bachvarov D.R.,1987; Ortlepp S.A.,1989). В конечном итоге количество п-ДНК определялось спектрофотометрически и рассчитывалось в микрограммах на миллиграмм биомассы бактерий, спрессованных центрифугированием при 12 тыс. об/мин. и подсушенных на воздухе. Параллельно вели подсчет на миллиард свеженарощенных бактерий.
Озонированный физиологический раствор получали из стандартного раствора хлорида натрия изотонического 0,9% для инъекций (изготовитель ОАО «Красфарма», г.Красноярск) с помощью аппарата озонотерапии с деструктором озона А0Т-Н-01 - Арз-01 (ТУ 9444-001-07513518-97), код ОК - 005(0кп); 944464; сертификат соответствия № РОСС RU,ME 34 ВО1010.
Концентрацию растворенного в физиологическом растворе озона определяли с помощью оптического анализатора концентрации озона в жидкой среде ИКОЖ-5 (№29708-05 в Государственном реестре средств измерений).
Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с помощью пакета программ '^айэйса" (StatSoft-Russia, 1998). При статистическом анализе выполняли парные групповые сравнения с использованием критериев Стьюдента и Фишера. Результаты считали достоверными при р<0,05.
Результаты
Чувствительность микробов к антибактериальным препаратам. Подавляющее большинство штаммов гемокультур синегнойных бактерий имели высокий исходный уровень резистентности к антибактериальным препаратам.
Таблица 1. Уровень чувствительности синегнойный бактерий к антибактериальным препаратам до и после воздействия ОФР с концентрацией
озона 1000 мкг/л
Название антибиотика Номер (название) штамма
396 21 539 Тес. 768 44 852 41 [9 479 480
Полимиксин S S S S S S S S S S S S S S S S R R S S
Амикацин S S S S S S S S S S I I S S S S I I I I
Карбеницили н R R R R R R S S S S S S R R I I R R S S
Гентамицин R R R R R R S S S S I I R R R R R R I I
Тобрамицин I I R R R R S S S S R R R R R R R R R R
Цефоперазон R I* S S R R S S S S R I* R R S S R R R I*
Цефотаксим I I R R R R I I I I R R R R R R R R R R
Цефтриаксон I I R R R R I I I I R R R R I I R R R R
Цефтазидим S S R R I I S S S S I I R I* S S R R I I
Цефепим S S R R I I S S S S I I R R S S R R I I
Ципрофлокс ацин S S R I* S S S S S S R R R R R I* R I* R R
Офлоксацин S S R R S S S S S S R R R R R R R R R R
Меропенем S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
Азтреонам S S S S S S I I S S S S S S S S S S S S
Нетилмицин S S S S S S I I S S S S S S S S S S S S
S - чувствителен, I - умеренно - устойчив, R - устойчив, * - изменение R ^ I
Анализ антибиотикограмм обработанных ОФР культур выявил, что воздействие на них ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л (табл. 1) приводило к
изменению чувствительности хотя бы к одному антибиотику у 7 штаммов из 10 (№№419, 445,479, 480, 859, 396, 21). Данные таблицы свидетельствуют о переходе этих штаммов из разряда устойчивых - в разряд умеренно-чувствительных в отношении антибиотиков групп фторхинолонов и цефалоспоринов. Озонированный физиологический раствор с концентрациями озона 200 мкг/л и 600 мкг/л не оказывал влияния на чувствительность синегнойных палочек к антибиотикам.
Исследование ростовых свойств госпитальных бактерий после воздействия ОФР. В работе проведены экспериментальные исследования in vitro по изучению влияния ОФР с концентрациями озона (200 мкг/л, 600 мкг/л, 1000 мкг/л) на ростовые свойства синегнойных бактерий в жидкой питательной среде.
В результате отмечено изменение кривых роста под воздействием ОФР различных концентраций, при этом зафиксирован дозозависимый эффект действия озона. С увеличением концентрации озона в ОФР снижалась интенсивность размножения бактерий. Графически это выражалось в снижении оптической плотности взвесей бактерий, прямо пропорционально коррелирующей с изменением их количества.
Это относилось ко всем исследуемым штаммам синегнойных бактерий (рис. 1).
Время,час
Рис. 1. Кривые роста синегнойных бактерий после воздействия ОФР с концентрациями озона 200мкг/л, 600 мкг/л и 1000 мкг/л (усредненные данные по
10 штаммам)
Считается, что к моменту начала стационарной фазы рост бактерий прекращается и взвесь содержит максимальное количество бактериальных клеток. У микроорганизмов, необработанных ОФР оптическая плотность взвеси к 14 часам (окончание экспоненциальной фазы) была равна 1,15 Ед. У синегнойных палочек после обработки ОФР с концентрацией озона 200 мкг/л к
этому времени она была 1,03 Ед. При воздействии ОФР 600 мкг/л оптическая плотность уменьшилась до 0,86 Ед и максимальное ее снижение до 0,72 Ед отмечалось после воздействия ОФР 1000 мкг/л.
Ростовые кривые показывали изменение и отдельных фаз развития микроорганизмов. Результаты исследований свидетельствовали о наиболее существенных изменениях адаптационной фазы (ЛАГ-фазы) синегнойных палочек (рис. 2).
ш
0,5 -| 0,45 -0,4 -0,35 -0,3 -0,25 -0,2 -0,15 -0,1 -0,05 -0 -
□ контроль
□ 200 мкг/л
□ 600 мкг/л
□ 1000 мкг/л
[шишишишишиШ]
Е
0,5
3 4 5
Время,час
Рис. 2. Адаптационная фаза (ЛАГ-фаза) синегнойных бактерий после воздействия ОФР с концентрациями озона 200мкг/л, 600мкг/л и 1000 мкг/л
(усреднённые данные по 10 штаммам)
У микроорганизмов, взятых в эксперимент до озонирования, ЛАГ-фаза составляла в среднем 5 часов. После контакта бактерий с ОФР концентрации озона 200 мкг/л ЛАГ-фаза удлинилась до 6 часов 50мин., при действии ОФР с концентрацией озона 600 мкг/л - до 7 ч.20 мин., при действии ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л - до 7 ч.30 мин.
В целом, у всех микроорганизмов без исключения регистрировалось увеличение ее продолжительности. При исследовании ЛАГ- фазы каждого микроорганизма в отдельности отметились некоторые штаммовые особенности в зависимости от концентрации ОФР (табл. 2).
Воздействие ОФР с концентрацией 200 мкг/л значительно удлиняло период адаптации псевдомонад к условиям питательной среды в сравнении со штаммами необработанными ОФР.
Исследование кривых роста синегнойных палочек до и после влияния на них ОФР с концентрацией озона 600 мкг/л так же показало увеличение ЛАГ-фазы. В отношении 4 штаммов из 10 (№№ 21, 539, 445, 479) определено, что эта концентрация ОФР действует на микроорганизмы примерно так же, как и 200 мкг/л.
1
2
6
7
8
Максимальное удлинение адаптационного периода роста у бактерий отмечалось после применения ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л, как в сравнении с необработанными ОФР штаммами, так и в сравнении с их вариантами после озонирования ОФР 600 мкг/л. Вместе с тем, половина штаммов синегнойных палочек «Тесаков», №№ (852, 419, 479, 480) реагировала на действие ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л и 600 мкг/л в этом плане почти одинаково (табл. 2).
Таблица 2. Продолжительность ЛАГ-фазы синегнойных бактерий после воздействия ОФР с концентрациями озона 200 мкг/л, 600 мкг/л, 1000 мкг/л
Название (номер) штамма Продолжительность ЛАГ-фазы бактерий (часы)
Контроль ОФР 200 мкг/л ОФР 600 мкг/л ОФР 1000 мкг/л
396 4,34 6,00 7,40 8,10
21 5,25 6,55 7,00 8,12
539 4,43 5,50 5,55 6,55
«Тесаков» 5,20 7,00 8,56 9,07
768 4,16 5,31 6,30 6,51
445 4,24 5,50 5,57 7,00
852 5,17 6,37 6,45 6,50
419 4,27 6,00 6,19 6,20
479 3,55 5,50 5,59 6,05
480 6,45 7,55 9,10 9,20
За счет значительного смещения по времени ЛАГ - фазы проследить продолжительность остальных фаз роста синегнойных палочек не представлялось возможным. По ростовым кривым видно, что при воздействии всех 3-х концентраций ОФР бактерии еще не достигли максимального количества к окончанию эксперимента (18 часов) и продолжали расти.
Таким образом, ОФР с концентрациями озона 200 мкг/л, 600 мкг/л, 1000 мкг/л угнетает рост госпитальных синегнойных бактерий, что проявляется изменением их ростовых кривых: происходит медленное нарастание оптической плотности взвесей бактерий, свидетельствующее о снижении скорости их размножения. Сравнительная оценка адаптационного периода (ЛАГ-фазы) показала значительное удлинение его времени у всех подвергнутых озонированию штаммов, при этом выявлены штаммовые особенности реакции синегнойных палочек.
Исследование плазмидного состава синегнойных бактерий. Плазмиды бактерий представляют собой экстрахромосомные генетические элементы, которые в бактериальной клетке физически обособлены от хромосомы и способны к бесконечно долгому поддержанию и воспроизводству в такой форме. Плазмиды выполняют регуляторные функции, направленные на компенсацию метаболических деффектов и кодирующие функции, вносящие в бактерию информацию о новых признаках. В случае условно-патогенных бактерий
плазмиды обеспечивают их дополнительной генетической информацией, благодаря которой они становятся патогенными. (Борисов Л.Б., 2002; Пехов А.П., 1986; Покровский В.И. и соавт., 1999).
Наличие в клетке внехромосомных генетических элементов (R-плазмид) определяет плазмидную резистентность бактерий, которая связана с химической модификацией антибиотика или снижением проницаемости мембран. Считается, что именно этому типу принадлежит ведущее место среди причин появления и распространения антибиотикоустойчивых микроорганизмов в клинических условиях (Анисимова Л.А., 1986; Боронин А.М. и соавт., 1984). Часто плазмидный тип устойчивости характеризуется резистентностью одновременно к нескольким лекарственным препаратам, и такая резистентность способна передаваться при коньюгации и трансдукции от одних микробов к другим, в том числе от непатогенных к патогенным.
Это создает постоянную угрозу возникновения резистентных штаммов болезнетворных бактерий. С помощью плазмид возможна передача свойств вирулентности и других признаков, определяющих характер течения патологического процесса, что имеет особое значение при внутрибольничном обсеменении ран резистентными и вирулентными штаммами микроорганизмов.
г
P.aeruginosa P.aeruginosa P.aeruginosa P.aeruginosa P.aeruginosa P.aeruginosa P.aeruginosa P.aeruginosa P.aerugm°sa P.aeruginosa 419 479 480 Тесаков 396 „ 859 445 768 21 539
_A_. . A , А ч . A_ .-A-. К
"Л
I II III I II III I II III I II III I II III I II III I II III I II III I II III I II III
Рис. 3. Плазмидные профили госпитальных синегнойных бактерий (I - без воздействия, II - ОФР с концентрацией озона 600 мкг/л, III - ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л)
В связи с этим постоянно ведется поиск средств, которые бы обладали способностью элиминировать плазмиды лекарственной устойчивости; подавлять генетический перенос R - плазмид; инактивировать ферменты, разрушающие или модифицирующие антибиотики; повышать проницаемость клеточных мембран; препятствовать селекции резистентных вариантов в микробных популяциях. Успешное решение этой задачи имеет важное практическое значение для повышения эффективности ряда химиотерапевтических препаратов и, прежде всего, антибиотиков, находящихся в первом ряду в арсенале средств борьбы с раневой инфекцией (Навашин С.М., 1984). Известно, что плазмиды могут элиминироваться под влиянием ультрафиолетового облучения, акридиновых
красителей, солей тяжелых металлов и др. (Леванова Г.Ф. и соавт., 1991; Маракуша Б.И. и соавт., 2005; Пяткин К.Д. и соавт., 1980).
В задачи исследования входило изучение плазмидных профилей 10 штаммов псевдомонад, выделенных от ожоговых больных до и после обработки ОФР с концентрациями озона 600 мкг/л и 1000 мкг/л.
Все изученные штаммы P.aeruginosa оказались плазмидосодержащими. Суммарные данные, полученные нами двумя методами представлены на рисунке 3, из которого видно, что у подавляющего большинства штаммов присутствует наиболее распространенная для P^eruginosa R-плазмида с молекулярной массой в 40 МД, несущая гены резистентности к канамицину (Иванова Н.И., 1987). Второй представительной плазмидой оказалась плазмида величиной в 60 МД. Кроме того, модификацией метода Бирнбойма и Доли у 2х штаммов (№№768, 859) выявлена плазмида в 5,5МД, а методом Кадо и Лю у двух других (№№445, 480) - крупная плазмида неустановленной молекулярной массы.
К I и III
I И III К
Рис. 4. Пример сравнительного изучения плазмидных профилей у исследуемых
вариантов синегнойных палочек
Важно подчеркнуть, что штаммы до и после обработки ОФР с содержанием озона 600 мкг/л и 1000 мкг/л, обладали одинаковым набором плазмид, т.е. обработка озоном в указанных концентрациях не элюировала их. Более того, при работе более чувствительным методом Бирнбойма и Доли на электрофореграмме можно было визуально заметить некоторое нарастание ширины плазмидной полосы от 1 к 3 варианту (1 - необработанный штамм; 2 - штамм обработанный ОФР с концентрацией озона 600 мкг/л; 3 - штамм обработанный ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л) (рис. 4), что, по-видимому, можно объяснить адаптивной реакцией микроорганизма на усиление неблагоприятного действия озона, что выражалось в увеличении числа копий плазмиды и давало ему
возможность выжить. Это хорошо просматривалось в случае групп 419, 479, 445, 768, Тесаков.
Визуализация у всех изученных штаммов псевдомонад от 1 до 3 плазмид может, по-видимому, свидетельствовать о все возрастающей приспособляемости этой группы бактерий к внешним воздействиям. После озонирования выживают наиболее резистентные микроорганизмы, возможно за счет увеличения копийности имеющихся плазмид.
Для подтверждения этого предположения нами проведено изучение количественного содержания суммарной плазмидной ДНК до озонирования и после воздействия различными дозами озона.
Таблица 3. Суммарное содержание плазмидной ДНК (п-ДНК) некоторых штаммов псевдомонад (№419, №479, №445, №768, «Тесаков») после воздействия
П-ДНК в мкг на мг биомассы п-ДНК в мкг на млрд. клеток
Штаммы Варианты Средняя величина из 12-15 повторност Увеличение Средняя величина из 12-15 повторносте Увеличение
в %% в %%
ей и
Pseudomona 1. 1.40 2.8
s aeruginosa № 419 2. 3. 1.65 1.41 18 3.5 2.7 25
Pseudomona 1. 2.17 4.7
s aeruginosa № 479 2. 3. 2.42 2.80 12 29 5.3 5.8 12 23
Pseudomona 1. 2.03 4.5
s aeruginosa № 445 2. 3. 1.95 2.09 — 4.2 4.2 —
Pseudomona 1. 2.47 5.2
s aeruginosa №768 2. 3. 2.44 2.29 — 4.8 4.5 —
Pseudomona 1. 1.81 2.9
s aeruginosa « Тесаков» 2. 3. 2.15 2.27 19 25 3.6 3.7 24 27
Варианты: 1. Исходный штамм, не подвергнутый обработке озоном
2. Штамм, обработанный ОФР с концентрацией озона 600 мкг/л
3. Штамм, обработанный ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л
Известно, что при сверхнеблагоприятных условиях в бактериях могут происходить мутации, которые приводят к увеличению числа копий той или иной плазмиды, хотя обычно число копий каждой плазмиды удерживается на строго определенном уровне, специфичном для этой плазмиды (Томас К.М., 1990). Естественно, что увеличение копийности плазмиды приводит к
повышению резистентности несущего ее штамма к неблагоприятным условиям воздействия и возрастанию общего количества плазмидной ДНК.
Было изучено суммарное содержание п-ДНК пяти исходных штаммов псевдомонад, выделенных от ожоговых больных и 2х вариантов, подвергнутых воздействию озона в концентрациях 600 мкг/л и 1000 мкг/л. Полученные результаты представлены в таблице 3. Они выражены в мкг п -ДНК как средняя величина (М) из 12-15 повторных определений (4-5 биомасс по 3 повторности, выполненных параллельно в одном эксперименте для всех трех вариантов).
Статистическая обработка указала на среднюю ошибку m, равную + 0,1 (колебания от 0,06 до 0,14) при расчете на миллиграмм биомассы и m, равную + 0,5 при расчете на миллиард свеженарощенных клеток. Из таблицы 3 видно, что изученные штаммы отличаются по своей реакции на озонирование. Два из них (№445 и №768), характеризующиеся оригинальными плазмидными профилями (90:40 МД и 40:5.5 МД) не отреагировали на воздействие озона, т.е. увеличения п-ДНК не произошло. Три остальные, относящиеся к одному и тому же плазмидовару (60:40 МД), показали на наличие мутационных изменений: количество п-ДНК в озонированных вариантах возросло от 12 до 29%. Причем в штаммах №479 и «Тесаков» это касается обеих концентраций, а в №419 увеличение п-ДНК отмечено только при воздействии более низкой концентрации озона в ОФР (600 мкг/л), а при 1000 мкг/л - её содержание оставалось без изменения.
Таким образом, анализируя полученные результаты, можно отметить, что обработка штаммов псевдомонад ОФР с концентрациями озона 600 мкг/л и 1000 мкг/л не влечет за собой изменения набора плазмид, характерного для каждого исследуемого штамма. Однако бактериальные культуры отличались по своей реакции на озонирование: три штамма из пяти (№479, «Тесаков» и №419) отреагировали на озон как на сверхнеблагоприятный фактор внешней среды, что привело к модификационным изменениям и выражалось в увеличении числа копий плазмид, и соответственно, возрастанию суммарного количества плазмидной ДНК. Возможно, что при более длительной экспозиции синегнойных бактерий с озоном или при увеличении концентрации озона в ОФР у этих микроорганизмов могли бы развиться изменения, связанные с декомпенсацией защитных от стрессовых факторов механизмов.
Заключение
Изучение ростовых свойств синегнойных бактерий после воздействия ОФР с концентрациями озона 200 мкг/л, 600 мкг/л, 1000 мкг/л показало дозозависимый эффект действия озона. Чем выше концентрация озона в физиологическом растворе, тем ниже была скорость размножения микроорганизмов и тем медленнее нарастала оптическая плотность взвесей бактерий. Максимальное угнетающее действие на рост оказывал ОФР с насыщающей концентрацией озона 1000 мкг/л. Анализ ростовых кривых показал значительные изменения отдельных фаз роста, наибольшие из которых определялись в адаптационую фазу (ЛАГ-фазу). Вполне закономерно, что синегнойные палочки, несмотря на чрезвычайную их устойчивость во внешней среде отреагировали на озон как на оксидативный стресс и изменили свой внутренний метаболизм. Кислородные
радикалы в первую очередь повреждают мембранные липиды, белки и ДНК (Nakashima K. e.a., 1996; Storz G. e.a., 1998). Молекулярные основы токсичности кислорода не вполне ясны. Для объяснения его действия предлагаются различные гипотезы. В частности, существует предположение, что токсичное действие обусловлено окислением чувствительных к кислороду SH-групп различных белков, в том числе и SH-групп ферментов, таких как коэнзим А, фосфодиэстераза (фермент принимающий участие в метаболизме ц-АМФ) или SH-групп ферментов, входящих в состав дыхательной цепи микрорганизмов и т.д. (Афиногенов Г.Е и соавт., 1987). При избытке кислорода и в среде, и в клетках могут накапливаться продукты неполного восстановления кислорода: перекись водорода и супероксидный радикал, характеризующийся высокой реакционной способностью. Если парциальное давление кислорода становится «критическим», то бактерии «включают» защитные ферментативные системы: каталазу, пероксидазу, супероксиддисмутазу, катализирующие реакции разрушения токсичных продуктов кислородного метаболизма. Oxy-R-белок грамотрицательных бактерий - необходимый компонент ответа на оксидативный стрессор, одновременно является сенсором РФК и транскрипционным активатором, включающим экспрессию этих ферментов (Баснакьян И.А., 2003). Однако при значительном влиянии стрессора наступает декомпенсация ферментных систем, в клетках накапливается Н2О2, и в результате происходит дополнительное повреждение клетки и снижение их жизнеспособности (Ждан-Пушкина В.Д., Сарья Махмуд Кызы, 1983; Конопельцев И.Г., Видякина Е.В., Костяев А.А., 2005).
Анализ антибиотикограмм выявил, что у 7 штаммов из 10 под действием ОФР с максимальной концентрацией озона 1000 мкг/л происходило изменение чувствительности к наиболее часто применяемым при синегнойной инфекции антибиотикам групп цефалоспоринов и фторхинолонов.
Расширение спектра чувствительности к антибиотикам очевидно связано с повреждением озоном биомембран бактериальных клеток, в результате чего происходят ее выраженные структурные изменения и нарушается барьерная функция (Конев С.В., Матус В.А.,1992; Конопельцев И.Г., Видякина Е.В., Костяев А.А., 2005; Mudd I., Freeman B.A., 1977), за счет этого, по - видимому, упрощается проникновение антибиотика внутрь.
В исследованиях Жаденова И.И. и соавт. (2000) охарактеризована микрофлора гнойных ран после обработки озоном и повиарголом: при идентификации культур никаких отклонений в биохимической активности не установлено, в то же время показано, что под воздействием озона у антибиотикорезистентных штаммов восстанавливается чувствительность к антибиотикам. Факт снижения антибиотикорезистентности микрофлоры под воздействием озона отмечают Аксенова С.В. и соавт. (2000), Муравьев А.В. (1990), Позднякова Б.Я. и соавт. (2005), Родоман Г.В и соавт. (1999). Патогенность и вирулентность определяются генетическими детерминантами бактериальной клетки. Внехромосомные элементы ДНК цитоплазмы микробной клетки, так называемые плазмиды выполняют метаболические функции и контролируют вирулентные свойства микроорганизмов, в том числе определяют
резистентность бактерий к антибактериальным препаратам. Показано, что среди причин появления и распространения антибиотикоустойчивых микроорганизмов в клинических условиях ведущее место принадлежит плазмидам резистентности - R-плазмидам (Анисимова Л.А., 1983; БоронинА.М., 1987; Габисония Т.Г. и соавт., 1992; Леванова Г.Ф. и соавт., 1991). Плазмидный тип устойчивости характеризуется резистентностью одновременно к нескольким лекарственным препаратам, и такая резистентность способна передаваться при коньюгации и трансдукции от одних микробов к другим, в том числе от непатогенных к патогенным (Пехов А.П., 1986; Покровский В.И. и соавт 1999). Это создает постоянную угрозу возникновения резистентных штаммов болезнетворных бактерий. С помощью плазмид возможна передача свойств токсичности и других признаков, определяющих характер течения патологического процесса, что имеет особое значение при внутрибольничном обсеменении ран резистентными и вирулентными штаммами микроорганизмов.
Воздействие ОФР с концентрациями озона 600 мкг/л и 1000 мкг/л не элиминировало плазмиды, но приводило к модификационным изменениям микроорганизмов. У трети культур регистрировалось увеличение числа копий плазмид и возрастание суммарного количества плазмидной ДНК в среднем с 15% до 27%. Увеличение копийности плазмид и возрастание общего количества плазмидной ДНК свидетельствовали о негативном влиянии ОФР на бактерии, поскольку обычно число копий каждой плазмиды удерживается на строго определенном уровне, специфичном для этой плазмиды. Процесс копийности плазмид регулируется определенными генами, которые под влиянием стрессовых факторов могут утрачивать контроль за этим процессом (Пехов А.П., 1986; Покровский В.И. и соавт., 1999). Можно предположить, что копированные R-плазмиды будут неполноценными для осуществления своих основных функций, а нерегулируемый процесс копийности их приведет в конечном итоге к серьезным мутациям клетки.
Список литературы:
1. Азолов В.В., Попова М.М., Жегалов В.А. с соавт. Эпидемиология ожогов и состояние помощи пострадавшим в России // Нижегородский медицинский журнал. 2004. Прил. «Комбустиология».
2. Азолов В.В., Пылаева С.И., Гординская Н.А. с соавт. Эпидемиологическая характеристика внутригоспитальной инфекции и основные принципы ее профилактики в Республиканском ожоговом центре // Травматология и ортопедия России. 1996. №1. С. 5-9.
3. Аксенова С.В., Корабельникова И.А., Асадуллаев М.Р. с соавт. Влияние различных факторов на антибиотикорезистентность кишечной микрофлоры in vitro // Информационный сборник «Реаниматология и интенсивная терапия. Анестезиология». 2000. №4. Прил. «Озон и методы эфферентной терапии в медицине». С. 28.
4. Алексеев А.А. Ожоговый сепсис: диагностика, профилактика, лечение: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М.,1993. 40 с.
5. Алексеев А.А., Крутиков М.Г., Еропкина А.Г. Ожоговый сепсис как осложнение ожоговой болезни // Тез. докл. Междунар. конф. «Раны и раневая инфекция». М., 1998. С. 196-198.
6. Анисимова Л.А. Сравнительное изучение и классификация плазмид резистентности Pseudomonas aeruginosa: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 1983. 17 с.
7. Афиногенов Г.Е., Елинов Н.П. Антисептики в хирургии.-Л.: Медицина, 1987. 144 с.
8. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. М.: Медицина, 2003. 136 с.
9. Боронин А.М. Плазмиды резистентности и биодеградации бактерий рода Pseudomonas:Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М., 1987. 37 с.
10. Вазина И.Р., Бугров С.Н. Основные причины смерти обожженных в восьмидесятые и девяностые годы 20 века // Тез. междун. конф. «Актуальные проблемы термической травмы». СПб., 2000. С. 40-41.
11. Вазина И.Р., Бугров С.Н., Пылаева С.И. Пневмонии - одна из основных причин смерти обожженных // Нижегородский медицинский журнал. 2004. Прил. «Комбустиология». С. 67-68.
12. Вазина И.Р., Сосин Е.Ю., Бушуев Ю.И. Особенности сепсиса у обожженных в настоящее время // Вестник хирургии им. Грекова. 1995. Т. 155, №12. С. 66-68.
13. Габисония Т.Г., Галушка Ф.П., Чанишвили Т.Г. Изучение конъюгативных R-плазмид, выделенных из госпитальных штаммов синегнойной палочки // Антибиотики и химиотерапия. 1992. Т. 37, №12. С. 39-40.
14. Жаденов И.И., Азолов В.В., Перетягин С.П. с соавт. Характеристика микрофлоры гнойных ран после обработки озоном и повиарголом // Информационный сборник «Реаниматология и интенсивная терапия. Анестезиология». 2000. №4. Прил. «Озон и методы эфферентной терапии в медицине». С.15-16.
15. Ждан-Пушкина В.Д., Сарья М.-К. Основы роста культур микроорганизмов. Л.: Изд-во ЛГУ,1983. 187 с.
16. Идов И.Э. Аспекты применения озона в медицине // Анестезиология и реаниматология. 1997. №1. С. 90-94.
17. Крутиков М.Г. Инфекция у обожженных: этиология, патогенез, диагностика, профилактика и лечение: Автореф. .дис. докт. мед. наук. Москва. 2005. 45 с.
18. Леванова Г.Ф., Парфенова О.В., Кашников С.Ю. Молекулярно-биологические способы идентификации и дифференциации бактерий: Метод. Рекомендации // ННИИЭМ. М., 1995. 19 с.
19. Леванова Г.Ф., Трошкина Д.М., Талаева Е.Б. Выявление возможного влияния дезинфектантов на формирование плазмидного состава у антибиотикорезистентных штаммов стафилококков клинического происхождения // Межвуз. сб. «Биотехнология и генетика». Нижний Новгород, 1991. С.25-32.
20. Муравьев А.В. Озонотерапия гнойных ран и трофических язв: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Ярославль. 1990. 19 с.
21. Пехов А.П. Плазмиды бактерий. М.: Медицина, 1986. 223 с.
22. Покровский В.И., Поздеев О.К. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. 1183 с.
23. Родоман Г.В., Лаберко Л.А., Оболенский В.Н. и др. Озонотерапия в лечении больных с гнойно-воспалительными заболеваниями // Российский медицинский журнал. 1999. №4. С.32-36.
24. Руднов В.А. Научно-обоснованные стандарты диагностики и интенсивной терапии больных с хирургическим сепсисом // Материалы конф. «Стандарты диагностики и лечения в гнойной хирургии». М., 2001. С.206- 211.
25. Сидоренко С.В. Клиническое значение Pseudomonas aeruginosa // Клиническая фармакология и терапия. 2003. №2. С.1-10.
26. Томас К.М. Репликация плазмид // Плазмиды. Методы: Пер. с англ. М.: Мир,1990. С.19-61.
27. Харди К. Плазмиды. М.: Мир, 1990. 223с.
28. Boukind L.,Chlihi A.,Chafiki N. et al. Zerouali Ox Etude De La Mortalite Par Brulure A Propos de 414 Cas De Deces // Ann. Burns and Fire Dis. 1995. Vol. 8, N4. P. 74-78.
29. Cioffi W.G., Kim S.H., Pruitt B.A. Cause of mortality in thermally injured patients // US Inst. Of Surg.Res. 1993. N 7. P. 11.
30. Dayoub A., Zeidan F., Radidy S. Infections on burns: Experience Of Teaching Hospital In Syria // Ann. Medit. Burns Club. 1995. Vol. 8, N1. P. 126-132.
31. Gang R.K., Bang R.L., Sanyal S.C. et al. Pseudomonas aeruginosa seticaemia in burns // Burns. 1999. Vol. 25, N7. P. 611-616.
32. Greenfield E., McManus A.T. Infectious complications: prevention and strategies for their control Nurs // Clin. North. Am. 1997. Vol. 32, N2. P. 297-309.
33. Ivanov I.G., Bachvarov D.R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. // Analyt. Biochem. 1987. Vol. 165. P. 137-141.
34. Kado C., Liu S. Method of plasmids detection // J. Bacteriol. 1981. Vol.145. P. 1365.
35. Komolafe O.O., James J., Kalngolera L. et al. Bacteriology of burns at the Queen Elizabeth Central Hospital, Blantyre, Malawi // Burns. 2003. Vol. 29, N3. P. 235-238.
36. Lesseva M., Hadgiiski O. Treatment оf serious infectious complications in burned patients With- Emipenem / Cilastatin // Ann. Burns Fire Disasters. 1998. Vol. 11, N2. P. 74-80.
37. Li T.Z., Luo L., Xu Y.B. et al. Clinical Significance of the predominant bacterial strains on burn wound during early postburn stage // Zhonghua Shao Shang Za Zhi. 2003. Vol. 19, N 2. P. 71-74.
38. Mudd I., Freeman B.A. Reaction of ozone with biological membranes // Biochem. Eff. Environ Pdl. Ann. Arter. Science. 1977. Vol. 7. P. 97-133.
39. Nakashima K., Kanamuru K., Mizuno T. et al. A novel member of the cspA family of genes that is induced by cold shock in Ecsherichia coli // J. Bact. 1996. Vol. 178. P. 5788-5792.
40. Ortlepp S.A. An improved boiling method for the preparation of bacterial plasmid and phage DNA // Gene Anal. Techn. 1989. Vol. 6, N5. P. 93 -96.
41. Storz G., Tartaglia L.A., Farr S.B. et al. Bacterial defenses against oxidative stress // Trends Genet. 1990. Vol. 6. P. 363-368.
