CC BY
21
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 615.371:616-022.7
Получение рекомбинантного слитого белка OprF-aTox Pseudomonas aeruginosa, обладающего защитными свойствами
А. В. Солдатенкова, Н. А. Михайлова, Е. М. Зимина, Е. И. Леонова, А. А. Калошин
Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова, Москва, Россия
Поступила 03.03.2016. Принята к публикации 22.04.2016.
Получен рекомбинантный слитый белок OprF-аТох, который содержал последовательности белка F наружной мембраны (OprF) и дефектной формы экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. Этот рекомбинантный белок был синтезирован в клетках Escherichia coli и очищен с помощью никель-сефарозы. Показано, что слитый рекомбинантный белок OprF-аТох при иммунизации обладал защитными свойствами от инфекции, вызываемой вирулентной токсиген-ной культурой Pseudomonas aeruginosa штамма РА-103.
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa; белок F наружной мембраны; экзотоксин А; анатоксин; слитый рекомбинантный белок OprF-аТох; иммунизация.
Библиографическое описание: Солдатенкова АВ, Михайлова НА, Зимина ЕМ, Леонова ЕИ, НалошинАА. Получение рекомбинантного слитого белка OPRF-ATOX Pseudomonas aeruginosa, обладающего защитными свойствами. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2016; 16 (2): 96-100.
Среди внутрибольничных гнойно-септических инфекций синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) стабильно занимает второе-третье место. Распространение данная инфекция получила из-за высокой неприхотливости микроорганизма к условиям внешней среды, а так же чрезвычайно высокой резистентности к большинству применяемых в клиниках антибиотиков и химиотерапевтиче-ских средств [1-3]. Кроме того, этот патоген является причиной серьезных патологий у больных муковисцидозом, генетическим заболеванием, сопровождающимся увеличением и сгущением секрета, что рано или поздно приводит к колонизации легких P. aeruginosa, с образованием биопленки [3, 4].
Нами рассматривается создание вакцинного антиси-негнойного препарата на основе рекомбинантных белков, полученных в клетках Escherichia coli. Ранее был получен продуцент высокоиммуногенного порообразующего белка F наружной мембраны (OprF), который является консервативным для всех иммунотипов синегнойной палочки. Показано, что рекомбинантный белок OprF в результате иммунизации способствовал повышению выживаемости мышей, экспериментально зараженных нетокси-генным штаммом P. aeruginosa PA-170015 [5]. Так же, был получен и исследован рекомбинантный анатоксин (нетоксичный вариант экзотоксина А без 106 С-концевых аминокислотных остатков) [6]. Экзотоксин А, ингибирующий синтез белков в эукариотических клетках, является одним из основных факторов поражения P. aeruginosa, играя важную роль в разрушении тканей организма хозяина [7].
Целью настоящих исследований явилось слияние генов, кодирующих OprF и анатоксин, с получением рекомбинантного белка, способного вызывать иммунные реакции против мажорного поверхностного белка и экзотоксина А P. aeruginosa. Для достижения данной цели были поставлены и выполнены следующие задачи: встраивание генов, кодирующих OprF и анатоксин, в одном плазмид-ном векторе для экспрессии в клетках E. coli; получение рекомбинантного белка; изучение специфичности и защитных свойств рекомбинантного белка.
Материалы и методы
С целью создания конструкций для экспрессии генов слитых белков использована плазмида (pET28-atox), предназначенная для синтеза рекомбинантного анатоксина [6]. В эту конструкцию встраивали последовательность гена oprF в двух вариантах, который амплифицировали c помощью ПЦР. В качестве матрицы использовали конструкцию для синтеза рекомбинантного белка OpTF ^^30^^) [5]. При амплификации первого варианта, праймеры имели на 5'-концах дополнительный сайт рестрикции Xhol (5'-GAT CTC GAG TAT GAA ACT GAA GAA CAC CTT AG и 5'-CAT CTC GAG CTT GGCTTC AGCTTCTAC), а при втором - использовали праймеры с сайтами рестрикции Hind lll (5'-GAT AAG CTT ATG AAA CTG AAG AAC ACC TTA G и 5'-CAT AAG CTT TTA CTT GGC TTC AGC TTC TAC). Первый амплификат встраивали в плазмиду pET28-aTox по сайту Xhol, второй - по сайту рестрикции Hindlll. Продукты лигирования использовали для трансформации клеток E. coli штамма BL21(DE3). Клоны отбирали с помощью рестриктного анализа и секвени-рования. Секвенирование осуществляли при помощи прибора ABl Prism 3100 Avant Genetic Analyzer («Applied Biosystems»).
Синтез рекомбинантных белков индуцировали с помощью изопропил^^-тиогалактопиранозида (ИПТГ), а очистку осуществляли методом аффинной хроматографии с использованием никель-сефарозы («Amercham») в 8 M буферном растворе мочевины, в соответствии с предварительными исследованиями [5]. Препараты рекомбинантных белков переводили в нативное состояние в результате диализа против физиологического раствора. Определение концентрации белков проводили в спектрофотометре Genesys 6 («Thermoscientific») при длине волны 280 нм. Белковые продукты анализировали электрофорезом в по-лиакриламидном геле по методу Лэммли. В иммуноблот-тинге использовали сыворотки крови кроликов, иммунизированных рекомбинантным белком OpTF и рекомби-нантным анатоксином.
Для иммунизации рекомбинантные белки сорбировали на гидроксиде алюминия из расчета 1 мг Al(OH)3 на
1 мг белка. Сорбцию проводили в течение 12 часов при температуре 4°С. Препараты вводили внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл мышам, массой 16-18 г (филиал «Андреев-ка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА).
При индукции экспериментальной инфекции животных заражали внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл живой вирулентной культурой P. aeruginosa штамма РА-103, после чего в течение семи суток проводили учет погибших и выживших животных. ЛД50, вычисляли по формуле Кербера в модификации Ашмарина-Воробьева:
бинантного слитого белка ОргР-аТох (рис. 16). В последовательности обратного праймера для ПЦР этого варианта гена оргГ отсутствовал терминаторный кодон (ТАА).
После проведения экспрессии отобранных конструкций выявлено, что синтез слитого рекомбинантного белка в существенных количествах происходил только с использованием конструкции рЕТ28-оргР-а1ох. Размер рекомби-
ЛД50 = 10л(1дЛ - lg2 ■ (B,/C, + B2/C2 + + B3/C3 + B4/C4 + B5/C5 - 0,5));
где А — максимальная инфекционная доза в опыте, В — количество животных, павших в группе, С — первоначальное количество животных в группе.
Высокотоксигенный штамм PA-103 был любезно предоставлен для музея лаборатории протективных антигенов НИИВС имени И. И. Мечникова доктором Liu (США) [8].
Все работы с животными проводили в соответствии с положениями «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Результаты и обсуждение
Ранее нами получена плазмидная конструкция для синтеза в клетках E. coli штамма BL21(DE3) дефектной формы экзотоксина А P. aeruginosa. У рекомбинантного белка отсутствовали 106 С-концевых аминокислотных остатков, что привело к нарушению домена, отвечающего за цитотоксическую функцию [6]. Этот делеционный вариант гена toxA, кодирующий рекомбинантный анатоксин, в конструкции рЕТ28-а1ох был расположен между сайтами рестрикции Hind\\\ и Xho\ (рис. 1А). Встраивание последовательности гена oprF осуществляли в двух вариантах.
В первом случае, ген oprF встраивали со стороны 3'-конца гена анатоксина, т.е. по сайту рестрикции Xho\. В результате получена конструкция рЕТ28-а1ох-оргр предназначенная для синтеза рекомбинантного слитого белка аТох-OprF (рис. 1 Б). Прямой праймер для амплификации данного варианта после сайта рестрикции содержал дополнительный нуклеотид (Т), который был необходим для восстановления открытой рамки считывания слитого гена.
Во втором случае, встраивание осуществлялось со стороны 5'-конца гена анатоксина, т.е. по сайту рестрикции Hind\\\, в результате чего была получена конструкция рЕТ28-ор^-а!ох, предназначенная для синтеза реком-
Стоп кодон
Xhol
Регион остановки транскрипции
Ген устойчивости к канамицину
участок инициации плаэмиднои репликации ColEI pBR322
ГеноргР(1053+1 н.п.)
HindiH
Регион кодирующий шесть гистидинов ATG
lac операторный элемент Т7 промотор
Регион остановки транскрипции
Ген устойчивое™ к канамицину
ГенсКох (1588н.п.)
Регион кодирующий шесть гистидинов ATG -
Т7 промотор и lac операторный элемент
Генойх (1588н.п.)
Ген oprF (1050 н.п.)
Регион кодирующий шесть гистидинов
ATG —
Участок инициации плазмидной репликации Со1Е1 рВ(?322
Стоп кодон
Регион остановки транскрипции
Ген устойчивости к канамицину
Т7 промотор и lac операторный элемент
Участок инициации плазмидной репликации ColEI pBR322
Рис. 1. Схема создания генно-инженерных конструкций для синтеза рекомбинантных слитых (гибридных) белков аТох-ОргР и ОргР-аТох. А — рЕТ28-а^х; Б — рЕТ28-а^х-оргР; В — рЕТ28-оргР-ак>х.
Рис. 2. Анализ белковых продуктов, полученных в результате экспрессии конструкций pET28-atox-oprFn pET28-oprF-atox в клетках E. coli штамма BL21(DE3). А — полиакриламидный гель, окрашенный Кумасси R-250; Б — нитроцеллюлозная мембрана после иммуноблоттинга с сывороткой к рекомбинантному анатоксину; В — нитроцеллюлозная мембрана после иммуноблоттинга с сывороткой к рекомбинантному OprF. 1 — белки, полученные в результате выращивания клеток трансформированных рЕТ28-а^х^р^ без экспрессии (без добавления ИПТГ); 2 — продукты, полученные при выращивании клеток трансформированных рЕТ28-а^х^р^ с экспрессией; 3 — весовой белковый маркер Fermentas-SM0661 (размеры фрагментов: 200, 150, 120, 85, 70. 60, 50, 40, 30, 25, 20 и 15 кДа); 4 — белки штамма-продуцента OprF-aTox, полученные при выращивании без экспрессии; 5 — белки штамма-продуцента OprF-aTox при выращивании с экспрессией; 6,8 и 10 — очищенный рекомбинантный белок OprF-aTox; 7 — очищенный рекомбинантный белок aTox; 9 — очищенный рекомбинантный белок OprF. Стрелками отмечены рекомбинантные продукты.
нантного продукта составлял около 100 кДа (рис. 2Л), что совпадало с расчетной (105 кДа). Очищенный рекомбинантный белок ОргР-аТох в иммуноблоттинге специфично реагировал с сыворотками, иммунными как к рекомби-нантному ОргР, так и к анатоксину (рис. 26).
На следующем этапе рекомбинантный слитый белок OprF-aTox оценили по способности защищать мышей от экспериментальной инфекции токсигенным штаммом P. aeruginosa. Ранее при исследовании протективных свойств рекомбинантного белка OprF использовали куль-
Таблица 1. Защитные свойства рекомбинантных белков от
Вводимые препараты в дозе Доза заражения (млн. м.к.) Количество мышей павших/выживших ЛД50 (млн. м.к.) ИЗ*
Контроль 100 9/1 30,9 —
(интактные 50 7/3
мыши)
25 4/6
12,5 2/8
6,25 0/10
OprF, 25 мкг 200 8/2 66,1 2,1
100 6/4
50 4/6
25 2/8
12,5 1/9
aTox, 50 мкг 200 100 50 25 12,5 9/1 7/3 3/7 2/8 1/9 61,7 2,0
* ИЗ — индекс эффективности.
инфекции P. aeruginosa
Вводимые препараты в дозе Доза заражения (млн. м.к.) Количество мышей павших/выживших ЛД50 (млн. м.к.) ИЗ*
OprF-aTox, 200 10/0 43,7 1,4
25 мкг 100 7/3
50 5/5
25 3/7
12,5 2/8
OprF-aTox, 200 8/2 107,2 3,5
50 мкг 100 3/7
50 2/8
25 1/9
12,5 0/10
OprF-aTox, 100 мкг 200 100 50 25 12,5 8/2 4/6 2/8 1/9 1/9 93,3 3,0
туру P. aeruginosa штамма, который характеризуется отсутствием синтеза экзотоксина А. В то же время, для оценки рекомбинантного анатоксина использовали ре-комбинантный функциональный экзотоксин А. Для исследования препарата, состоящего из мембранного и экзо-токсинового компонентов, был взят штамм с основными факторами патогенности.
Исследование проводилось в сравнении с отдельным введением рекомбинантных OprF и анатоксина. OprF вводили в дозе 25 мкг, а анатоксин в дозе 50 мкг на мышь при однократном введении. Данные дозы были подобраны для двукратной иммунизации в предыдущих исследованиях. Слитый белок OprF-аТох вводили в дозах: 25, 50 и 100 мкг (при однократном введении). Контрольная группа включала мышей той же партии, которым вводили физиологический раствор. Животных иммунизировали двукратно, с двухнедельным интервалом. Экспериментальное заражение осуществляли через две недели после курса им-мунизаций. Мышам контрольной группы вводили 6,25; 12,5; 25; 50 и 100 млн. микробных клеток (млн. м.к.) культуры P. aeruginosa. ЛД50 для этой группы животных составила 30,9 млн. м.к. При инфицировании мышей, иммунизированных рекомбинантными белками, использовали следующие дозы: 12,5; 25; 50; 100 и 200 млн. м.к. культуры P. aeruginosa. Показано, что рекомбинантные OprF и анатоксин способностью защищать иммунизированных мышей от P. aeruginosa штамма PA-103 с индексами эффективности (отношение ЛД50 для иммунизированных мышей к ЛД50 в контрольной группе) 2,1 и 2,0. ЛД50 для этих групп были 66,1 и 61,7 млн. м.к., соответственно для OprF и анатоксина. В случае слитого белка OprF-аТох установлены следующие значения ЛД50: 43,6 млн. м.к. — для иммунизирующей дозы 25 мкг; 107,2 млн. м.к. — для дозы 50 мкг
и 93,3 млн. м.к. ? для дозы 100 мкг. Индекс эффективности оптимальной дозы (50 мкг) составил 3,5 (табл. 1).
Полученные данные позволяют рассматривать реком-бинантный слитый белок OprF-аТох в качестве кандидат-ного компонента вакцины, предназначенной для профилактики синегнойной инфекции.
Литература
1. Рудное ВА. Антибиотикотерапия госпитальных инфекций вызванных P. aeruginosa. Русский медицинский журнал 2005; 13(7): 485-90.
2. Илюкееич ГВ. Синегнойная инфекция: е новый век со старой проблемой. Медицинские новости 2004; (12): 3-8.
3. Лазарева АВ, Чеботарь ИВ, Нрыжановская ОА, Чеботарь ВИ, Маянский НА. Pseudomonas aeruginosa патогенность, патогенез и патология. Нлиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2015; 17(3): 170-86.
4. Бобровничий ВИ. Современные подходы к диагностике и лечению синегнойной инфекции у больных муковисцидозом. Медицинский журнал 2012; 1(36): 4-9.
5. Налошин АА, Гатыпова ЕВ, Михайлова НА. Получение рекомбинантных форм белка F наружной мембраны (OprF) Pseudomonas aeruginosa и исследование их иммуногенных свойств. Биотехнология 2011; (2): 74-84.
6. Налошин АА, Исаков МА, Михайлова НА, Вертиев ЮВ. Получение рекомбинантной атоксической формы экзотоксина А Pseudomonas aeruginosa. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2012; 154(9): 330-5.
7. Вертиев ЮВ, Бродвинова НС, Мороз АФ. Экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa и его роль в патогенезе синегнойной инфекции. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 1981; (2): 13-9.
8. Станиславский ЕС, Жванецкая МИ, Машилова ГМ, Гладус МА. Бесклеточная Псевдомонас-вакцина. Сообщение I. Ферментативные свойства и вирулентность штаммов P. aerugi-nosa, протективная активность их водорастворимых антигенов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 1980; (8): 66-71.
Об авторах
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И.
Мечникова». Российская Федерация, 105064, Москва, Малый Казенный переулок, 5А.
Солдатенкова Алена Владимировна. Научный сотрудник лаборатории протективных антигенов.
Михайлова Наталья Александровна. Заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией протективных антигенов,
д-р мед. наук, профессор.
Зимина Екатерина Максимовна. Младший научный сотрудник лаборатории протективных антигенов.
Леонова Евгения Игоревна. Младший научный сотрудник лаборатории протективных антигенов.
Налошин Алексей Алексеевич. Ведущий научный сотрудник лаборатории протективных антигенов, канд. биол. наук.
Адрес для переписки: Калошин Алексей Алексеевич; alex-k-1973@yandex.ru
Obtaining the recombinant fusion protein OprF-aTox of Pseudomonas aeruginosa whith protective properties
A. V. Soldatenkova, N. A. Mihailova, E. M. Zimina, E. I. Leonova, A. A. Kaloshin
Federal State Budgetary Scientific Institution «I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera», Moscow, Russia
Into the cells of Escherichia coli (strain BL21(DE3)) two forms of the fusion protein Pseudomonas aeruginosa containing the full length outer membrane protein F (OprF) and nontoxic form of Exotoxin A (without 106 C-terminal amino acid residues) have been synthesized. Two recombinant genes were inserted into plasmid pET28 in different order: oprF-atox and atox-oprF. Only oprF-atox variant allowed to obtain the recombinant protein sufficient for purification by affinity chromatography on Ni-Sepharose. The recombinant fusion protein OprF-aTox showed a high specificity in interaction with the preparations of polyclonal immune rabbit serum to the recombinant OprF, the recombinant nontoxic form of Exotoxin A and the bacterial cells of P. aeruginosa. The purified recombinant fusion protein OprF-aTox after two immunizations protected the mice against toxigenic strain of P. aeruginosa (РА-103) being injected intraperitoneally. The index of efficiency of protective properties of OprF-aTox in the optimal dose (50 pg protein per mouse) was 3.5. This was more efficient than in
cases when the recombinant OprF and the recombinant toxoid were injected separately. The indexes of efficiency of protective properties of OprF and the toxoid were 2.1 and 2.0.
Key words: Pseudomonas aeruginosa; outer membrane protein F; exotoxin A; toxoid; recombinant fusion protein OprF-aTox; immunization.
For citation: Soldatenkova AV, Mihailova NA, Zimina EM, Leonova EI, Kaloshin AA. Obtaining the recombinant fusion protein OprF-aTox of Pseudomonas aeruginosa whith protective properties. BlOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2016; 16 (2): 96-100.
References
1. Rudnov VA. Antibiotic treatment of hospital infections caused by P. aeruginosa. Russkiy meditsinskiy zhurnal 2005; 13(7): 485-90 (in Russian).
2. Ilyukevich GV. Pseudomonas infection: the new century with an old problem. Meditsinskie novosti 2004; (12): 3-8.
3. LazarevaAV, TchebotarIV, Kryzhanovskaya OA, TchebotarVI, May-anskiy NA. Pseudomonas aeruginosa: Pathogenicity, Pathogenesis and Diseases. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya himioterapiya 2015; 17(3): 170-86.
4. Bobrovnichy VI. Modern approaches to diagnosis and treatment of Pseudomonas aeruginosa infection in a patient with cystic fibrosis. Meditsinskiy zhurnal 2012; 1(36): 4-9.
5. Kaloshin AA, Gatypova EV, Mikhailova NA. Obtaining recombinant forms of outer membrane protein F (OprF) of Pseudomonas aeru-
ginosa and assessment of their immunogenic properties. Biotekh-nologiya 2011; (2): 74-84.
6. Kaloshin AA, Isakov MA, Mikhailova NA, Vertiev YuV. Preparation of Recombinant Atoxic Form of Exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa. Bulleten eksperimentalnoy biologii i meditsiny 2012; 154(9): 330-5.
7. Vertiev YuV, Brodinova NS, Moroz AF. Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and its role in the pathogenesis of pyocyaneus infection. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii 1981; (2): 13-9.
8. Stanislavskii ES, Zhvanetskaia MI, Mashilova GM, Gladus MA. Cell-free pseudomonas vaccine. I. Enzyme properties and virulence of strains of P. aeruginosa; protective activity of their water-soluble antigens. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobio-logii 1980; (8): 66-72.
Authors
Federal State Budgetary Scientific Institution «I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera», Maly Kazenny lane, 5A, Moscow, 105064, Russian Federation.
Soldatenkova AV. Researcher of Laboratory of protective antigens.
Mihaylova NA. Deputy Director General for the scientific work, head of Laboratory of protective antigens. Doctor of Medical Sciences, professor. Zimina EM. Junior researcher of Laboratory of protective antigens. Leonova EI. Junior researcher of Laboratory of protective antigens.
Kaloshin AA. Leading researcher of Laboratory of protective antigens. Candidate of Biological Sciences.
