CC BY
20
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
Полученные данные свидетельствуют об интенсификации макрофагальной реакции в коже при субдермаль-ном введении ВКМ в форме порошка.
ПЕРСПЕКТИВЫ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Калошин А.А., Солдатенкова А.В., Зимина Е.М., Михайлова Н.А.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва, Россия
Одним из наиболее серьезных возбудителей оппортунистических инфекций является синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa). Этот микроорганизм характеризуется высокой способностью к быстрому развитию резистентности к антибиотикам, что делает неэффективными общепринятые методы лечения. Поэтому актуальным является разработка иммунобиологических препаратов для борьбы с синегнойными инфекциями. Создание вакцин на основе протективных антигенов возбудителя пока не увенчалось положительными результатами из-за технологических трудностей выделения целевых антигенов, что преодолимо с использованием генно-инженерных методов.
Ранее показано, что рекомбинантный белок F наружной мембраны (OprF) P. aeruginosa и делеционная форма экзотоксина А (анатоксин) P. aeruginosa способствовали защите иммунизированных мышей от экспериментальной внутрибрюшинной синегнойной инфекции. При этом комплексное введение обоих белков приводило к увеличению защитных свойств. Поэтому представляло интерес получение слитного рекомбинантного белка, включающего аминокислотные последовательности OprF и анатоксина. С этой целью ген, кодирующий белок OprF, встраивали в рекомбинантную конструкцию на базе плазмиды рЕТ28Ь+, несущей ген анатоксина. В результате экспрессии в клетках E. coli штамма BL21(DE3) созданной конструкции был синтезирован слитый рекомби-нантный белок OprF-анатоксин, который хроматогра-фически очищали на никель-активированном сорбенте. В иммуноблоттинге этот белок специфично реагировал с иммунными сыворотками к отдельным рекомбинант-ным белкам (OprF и анатоксину). Далее с целью увеличения спектра антигенных детерминант в плазмидную конструкцию был встроен ген еще одного мембранного белка P. aeruginosa (OprI). В результате получен слитый рекомбинантный белок OprF-анатоксин-Орг! с молекулярной массой 107,2 кДа, специфично реагирующий в имму-ноблоттинге с сыворотками к рекомбинантным белкам OprF, OprI и анатоксину. Содержание целевого рекомби-нантного продукта в очищенном препарате, составляло 96,4%, что подтверждено капиллярным электрофорезом.
Оценку защитных свойств полученных слитых реком-бинантных белков проводили при двукратном, с двухнедельным интервалом, внутрибрюшинном введении мышам в дозах 50 и 100 мкг на животное. В качестве препарата сравнения использовали комплекс из отдельных рекомбинантных белков: OprF и анатоксина.
Через две недели после курса иммунизации мышей заражали живой вирулентной культурой P. aeruginosa штамма РА103 и далее в течение недели проводили подсчет погибших особей. Для животных, иммунизированных слитым белком OprF-анатоксин в дозе 50 мкг, ЛД50 составила 40,61 млн м.к. (млн микробных клеток), а в дозе 100 мкг —
32,99 млн м.к. В группах животных, иммунизированных слитым белком Ор^-анатоксин-Орг1 в дозе 50 мкг, ЛД50 составила 53,59 млн м.к., а в дозе 100 мкг — 35,36 млн м.к. Для мышей, иммунизированных комплексом двух ре-комбинантных белков, значение ЛД50 соответствовало 46,65 млн м.к., а для контрольных животных ЛД50 соответствовала 15,39 млн м.к.
Таким образом, полученные результаты открывают перспективы для создания иммунобиологических препаратов на основе рекомбинантных белков. В дальнейшем для выбора наиболее эффективной вакцины целесообразно более глубокое изучение влияния рекомбинант-ных препаратов на индукцию специфического иммунного ответа.
КРАТКОСРОЧНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ С РЕЛЬЕФНЫМ КАЛЬЦИЙ-ФОСФАТНЫМ ВЛИЯНИЕМ ОПСОНИЗАЦИИ НА ФАГОЦИТОЗ МИКРОБАКТЕРИЙ МАКРОФАГАМИ У МЫШЕЙ С РАЗНОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ТУБЕРКУЛЕЗУ
Капина М.А., Рубакова Э.И., Логунова Н.Н., Майоров К.Б., Апт А.С.
ФГБНУ «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза», Москва, Россия
Опсонизация — это биологический процесс прикрепления опсонинов, которыми являются белки плазмы крови или их фрагменты, к поверхности бактерий или вирусов, что обусловливает более легкое распознавание и захват их фагоцитами. К опсонинам, в частности, относятся молекулы антител (преимущественно, IgG и IgM), фрагменты компонентов комплемента, С-реактивный белок. Важность опсонизации при фагоцитозе микобак-терий была показана в работах с антителами к арабино-маннану: инкубация микобактерий с антителами перед заражением животных снижала тяжесть течения инфекции (Hamasur B. et.al., 2004).
В нашей работе мы исследовали влияния опсонинов крови мышей генетически чувствительных и резистентных к туберкулезу (ТБ) линий на способность макрофагов фагоцитировать M. tuberculosis H37Rv. При отработке методов сыворотку крови здоровых и зараженных микобак-териями H37Rv мышей резистентной линии B6 в разных процентных соотношениях (от 20 до 1,25 %) добавляли к микобактериям и инкубировали в течение 30 минут при 4 °С. После инкубации микобактерии добавляли к культуре выделенных из брюшной полости макрофагов в соотношении 1:5 (одна бактерия на 5 макрофагов) и оценивали фагоцитарную активность под микроскопом по окраске аурамином микобактерий, захваченных макрофагами. Результат оценивали по подсчету фагоцитарного числа (процент инфицированных клеток) и фагоцитарного индекса (среднее число микобактерий на инфицированный макрофаг). Наивысшие значения были получены при содержании сыворотки 1,5 — 5%, как от здоровых, так и от инфицированных мышей. В последующих экспериментах для опсонизации использовали 3-процентное содержание сыворотки. Помимо этого, мы оценили влияние опсонизации на жизнеспособность фагоцитированных бактерий по включению радиоактивного ура-цила микобактериями. При опсонизации 3-процентной сывороткой включение урацила было самым низким, что подтверждает благоприятное значение опсонизации для
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
организма-хозяина: после предварительного контакта с факторами плазмы крови внутриклеточные микобакте-рии размножаются хуже. После обработки микобактерий сывороткой, полученной от зараженных ранее мышей, рост микобактерий в макрофагах снижался в 3,5 раза по сравнению с микобактериями, обработанными не иммунной сывороткой, скорее всего, из-за присутствия в иммунной сыворотке специфичных к микобактериям антител.
В последующих экспериментах мы сравнили активность сывороток, полученных от мышей В6 и от выведенных в нашей лаборатории рекомбинантных конгенных линий мышей B6.I-9.3, B6.I-139 и B6.I-100, отличающихся по коротким фрагментам комплекса Н2, которые были перенесены от чувствительной к ТБ линии I/St на генетическую резистентных мышей В6, в результате чего эти линии приобрели разную чувствительностью к ТБ (Logunova et al., 2015). Результаты показали, что при опсо-низации микобактерий сывороткой более высокий фагоцитарный индекс давали сыворотки резистентных линий B6.I-139 (1, 68) и B6.I-9.3 (1,31) по сравнению с сывороткой чувствительной линией B6.I-100 (0,55). По фагоцитарному числу достоверных различий не наблюдалось.
Возможно, еще один из механизмов, определяющих восприимчивость мышей к туберкулезу — это эффективность опсонизации микобактерий, которая влияет на эффективность фагоцитоза.
Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 15-1530020 (клеточные культуры) и гранта РФФИ 15-04-02002 (выведение и поддержание конгенных линий мышей).
ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ МОБИЛЬНОГО ТЕЛЕФОНА НА АКТИВАЦИЮ ЛИМФОЦИТОВ ДОНОРОВ, НАХОДЯЩИХСЯ В ПОСТВАКЦИНАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ
Капустин И.В.1, Тульская Е.АЛ 2, Бляхер М.С.1, Лопатина Т.К.1, Котелева С.И., Нестеренко В.Г.3, Суслов А.П.3, Коноплёва М.В.3
1ФБУН«Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Т.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Москва, Россия
2 ФГБУ«Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
3 ФГБУ ««Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
Введение. Вопрос о влиянии электромагнитного излучения (ЭМИ) мобильных телефонов на разные функции организма привлекает внимание исследователей, работающих в разных областях науки — генетиков, онкологов, гериатров, иммунологов. Изучение этих вопросов проводится с использованием разных методических подходов в опытах in vitro или in vivo, с использованием в качестве источника ЭМИ либо разных моделей мобильных телефонов, либо имитирующих их искусственно созданных систем.
Цель. Сравнение чувствительности клеток периферической крови людей до и после вакцинации к воздействию ЭМИ мобильного телефона.
Материалы и методы. Объектом исследования служили цельная венозная кровь и выделенные из нее лимфоциты 21 взрослого донора (от 20 до 55 лет): 10 — это здоровые доноры и 11 человек, через 7 дней после вакцинации их менингококковой, полисахаридной (серогрупп А, С, Y и W-135), коньюгированной с дифтерийным анатоксином вакциной. Исследование влияния ЭМИ телефона на функциональную активность лимфоцитов периферической крови проводили следующим образом — лимфоциты или клетки цельной крови помещали в лунки культураль-ных планшетов, на планшеты воздействовали мобильным телефоном, принимавшем звонки на протяжении 5 часов, далее среди лимфоцитов определяли % CD69+ лимфоцитов, а в надосадках — концентрацию №N7, TNFa, Ш-6 и ГЬ-8. По разнице этих величин в культуре клеток до и после воздействия ЭМИ телефона судили о наличии или отсутствии его воздействия на эти показатели.
Результаты. Состояние иммунной системы людей из группы здоровых доноров и доноров, которые в дальнейшем подверглись вакцинации, практически не отличалось и все показатели находились в пределах возрастной нормы. Через неделю после вакцинации наблюдались значимые отличия практически по всем основным субпопуляциям, которые выражались в повышении абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов. Кроме того, процент активированных цитолитических Т-клеток (CD3+CD8+), несущих разные активационные маркеры, через неделю после прививки имел тенденцию к снижению: % CD69 с 4,9±2,9 до 2,2±1,0; % HLADR с 4,1±1,5 до 2,5±0,8. Таким образом, в эксперименте были использованы клетки крови практически здоровых доноров и доноров, иммунная система которых была изменена под влиянием вакцины, т.е. в большей степени синхронизирована.
В результате исследования воздействия ЭМИ мобильного телефона на клетки крови выявлено, что изменение процента лимфоцитов, несущих ранний маркер активации CD69, наблюдали существенно чаще и с большей интенсивностью в группе доноров, находившимися в поствакцинальном периоде по сравнению со здоровыми донорами. Под воздействием ЭМИ телефона средние значения продукции изученных цитокинов не изменялись в образцах супернатантов в обеих группах, но у здоровых доноров были в 1,5 — 2 раза выше, чем у людей в поствакцинальном периоде. Продукция всех цитокинов клетками крови существенно чаще и с большей интенсивностью изменялась под влиянием ЭМИ телефона в группе здоровых доноров по сравнению с донорами, находящимися в поствакцинальном периоде. Продукция №N7 клетками крови изменилась у 3 здоровых доноров (в среднем в 3,5 раза, а у одного человека — в 6,5 раз) и у 2 вакцинированных (в среднем в 1,4 раза, такого сильного изменения, как у здоровых доноров не было), т.е. интенсивность этих изменений была принципиально разная; продукция TNFa клетками крови изменилась у 5 здоровых доноров (в среднем в 1,9 раз, а у отдельных людей до 3,5 раз) и у 2 вакцинированных (в 1,4 раза), т.е. и в данном случае интенсивность этих изменений была №N7 разная; продукция ГЬ-6 клетками крови изменилась у 5 здоровых доноров (в среднем в 2 раза, а у отдельных индивидуумов — в 4 раза) то время, как этот показатель изменился под влиянием ЭМИ телефона только у одного вакцинированного (в 2,5 раза); продукция Ш-8 клетками крови изменилась
