УДК 661.124
Соколова Е.А., Мохова Е.К., Гордиенко М.Г., Каленов С.В., Суханов Ю.В.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ ПЛЕНОК, СШИТЫХ ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ, НА ОСТРУЮ ТОКСИЧНОСТЬ И ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ
Соколова Екатерина Алексеевна1, студентка 4 курса факультета цифровых технологий и химического инжиниринга; ekaterinasokolova27630@gmail.com.
Мохова Елизавета Константиновна, студентка 2 курса магистратуры факультета цифровых технологий и химического инжиниринга;
Гордиенко Мария Геннадьевна, д.т.н., профессор кафедры химического и фармацевтического инжиниринга; Каленов Сергей Владимирович, д.т.н., доцент кафедры биотехнологии; Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д.20.
Суханов Юрий Владимирович, к.б.н., научно-организационный отдел.
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва, Россия, 119334, ул. Вавилова, 26.
В ходе работы были получены материалы биомедицинского назначения в форме пленок на основе хитозана и поливинилового спирта с внедренными частицами селена. С целью получения высокой механической прочности был использован метод химической сшивки с использованием глутарового альдегида в качестве сшивающего агента. При проведении исследований на острую токсичность и цитотоксичность было установлено, что полученные образцы обладают высокой степенью токсичности. Были предложены методы по уменьшению содержания непрореагировавших альдегидных групп в получаемых образцах. Ключевые слова: полимеры, сшивающий агент, глутаровый альдегид, острая токсичность, цитотоксичность.
STUDY OF POLYMER FILMS CROSS-LINKED WITH GLUTARALDEHYDE FOR ACUTE TOXICITY AND CYTOTOXICITY
Sokolova E.A.1, Mokhova E.K.1, Gordienko M.G.1, Kalenov S.V.1, Sukhanov Y. V.2
1 D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
2 Kol'tsov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
In the course of the work, materials for biomedical purposes were obtained in the form of films based on chitosan and polyvinyl alcohol with embedded selenium particles. In order to obtain high mechanical strength, we used chemical crosslinking with using glutaraldehyde as a cross-linker. When conducting studies on acute toxicity and cytotoxicity, it was found that the obtained samples have a high degree of toxicity. Methods have been proposed to reduce the content of unreacted aldehyde groups in the resulting samples. Keywords: polymers, cross-linker, glutaraldehyde, acute toxicity, cytotoxicity.
Введение
Материалы медико-биологического назначения в виде пленок чаще всего используются при лечении ран и ожогов, для остановки кровотечения и предотвращения контакта раны с окружающей средой. Недостаточная стабильность и риск инфицирования являются основными проблемами традиционных перевязочных материалов. Поэтому актуальной проблемой настоящего времени является поиск таких биологически активных соединений, которые сочетали бы в себе высокую антимикробную активность и низкую токсичность.
Для образования основы перевязочного материала были использованы такие биосовместимые полимеры как хитозан и поливиниловый спирт. В области медицинских разработок они вызывают наибольший интерес за счет низкой токсичности, высокой биологической активности и выраженных антимикробных свойств [1]. В области биомедицины достаточно перспективным является применение селена в наноформе. Известно, что красный наноселен является высокоэффективным антиоксидантом длительного действия и обладает минимальной
токсичностью в сравнении с другими неорганическими и органическими формами селена [2].
В целях повышения механических свойств материалов на основе биосовместимых полимеров, в том числе хитозана и поливинилового спирта, полимеры могут быть сшиты различными методами, предполагающими образование ковалентных связей между функциональными группами, например, амино (-NN2) и гидроксильными (^Щ К настоящему времени разработано большое количество методов сшивки, которые могут быть разделены на два больших класса: физические и химические. В данной работе использовался метод химической сшивки [3].
Химические сшивающие агенты можно разделить на две категории: сшиватели ненулевой длины и сшиватели нулевой длины. Сшивающие агенты с ненулевой длиной (например, глутаровый альдегид, полиэпоксиды и изоцианаты) представляют собой бифункциональные или многофункциональные молекулы, механизм действия которых заключается в их способности связывать группы между соседними полимерными
молекулами, такие как свободные группы карбоновой кислоты, аминогруппы и гидроксильные группы. В случае сшивающего агента нулевой длины образование ковалентной связи происходит из-за взаимодействия реакционноспособных групп, таких как группы карбоновой кислоты и амина, которые присутствуют в цепях полимерной сетки. К сшивающим агентам этой категории относятся ацилазиды, трансглутаминаза и водорастворимые карбодиимиды.
Увеличение биостабильности материалов на основе полимеров для биомедицины, достигается в основном сшивкой глутаровым альдегидом. Однако одним из серьезных недостатков стабилизированных глутаровым альдегидом изделий является их токсичность, обусловленная следовыми
количествами альдегида, трудно удаляемых из сшитых биополимерных матриксов [4].
В данной работе были получены полимерные пленки, модифицированные частицами селена, с различным содержанием глутарового альдегида. С целью дальнейшего применения пленок в области биомедицины, были проведены исследования на острую токсичность и цитотоксичность. Экспериментальные испытания образцов осуществлялись при помощи специальных биотест-объектов и в культурах клеток человека с целью определения содержания токсических веществ в образцах.
Материалы и методы
Для приготовления пленок использовали такие
реактивы, как: низкомолекулярный хитозан (Sigma-Aldrich); селенистая кислота (H2SeOз); аскорбиновая кислота; поливиниловый спирт (ПВС); глутаровый альдегид (ГА); гидроксид натрия (NaOH) «Русхим»; уксусная кислота (Sigma-Aldrich).
Частицы селена (SePs) были синтезированы в растворе с хитозаном, который использовался в качестве стабилизатора. Раствор хитозана 2% добавляли по каплям в 1 мл 125 мМ раствора H2SeO3 при перемешивании, а затем к полученной смеси добавляли 5 мл 0,1 М раствора аскорбиновой кислоты. Синтез частиц шел с изменением окраски с желтого на красный, что свидетельствовало о присутствии нульвалентного селена в растворе.
Затем было приготовлено 100 мл 4% раствора ПВС путем его растворения в дистиллированной воде в течении 4 часов при Т=80С. После чего 50 мл приготовленного раствора ПВС смешивали с 50 мл раствора хитозана, содержащего SePs, в течение 2 часов при Т=60 С и охлаждали до комнатной температуры. Далее на подложки из пропилена тонким слоем наносили соответствующие растворы ПВС-Хитозан-SePs и вводили при помощи дозатора сшивающий агент ГА различной концентрации (таблица 1). Для деактивации непрореагировавших альдегидных групп полученные пленки выдерживали в течение часа в растворе 12% NaOH, промывали дистиллированной водой, затем замораживали и лиофильно сушили. Внешний вид образцов после сублимационной сушки представлен на рисунке 1.
А Б В
Рис. 1. Внешний вид образцов после сублимационной сушки
Полученные образцы на основе хитозана и поливинилового спирта были переданы на кафедру биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева для оценки острой токсичности исследуемых соединений с использованием биотест-объектов, в качестве которых были выбраны представители низших ракообразных Daphnia magna Straus. Эти организмы являются крайне чувствительными к загрязняющим веществам различной природы и поэтому широко используются для оценки токсичности различных соединений и сточных вод. Также оценивали цитотоксичность и адгезивность изучаемых образцов при проведении экспериментов в культурах фибропластов человека в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Результаты и обсуждения
Острая токсичность была определена для
полимерных пленок, сшитых разным количеством ГА. Согласно методике оценку воздействия образцов, присутствующих в исследуемой среде, проводили по показателям смертности дафний в сравнении с контрольной группой. Показателем острого токсического действия соединения служит коэффициент подавления.
Для определения острого токсического действия пленок рассчитывали процент погибших дафний в исследуемых группах (А, %) по сравнению с контрольными группами, что представлено в формуле (1):
А = 100%, (1) хк
где Хк - количество выживших дафний в контрольной группе;
Хт - количество выживших дафний в
исследуемых группах.
Если А < 10%, то считается, что исследуемые соединения не обладают острой токсичностью (безвредная концентрация). Если А > 50%, то исследуемые препараты характеризуются острой токсичностью (средняя летальная концентрация) [5].
На основании полученных результатов рассчитывали процент погибших дафний по отношению к контрольной группе, после чего были определены показатели острой токсичности, результаты которых представлены в таблице 1 в соответствии с количеством ГА в каждом образце.
Таблица 1. Спецификация для образцов
Образец Объем раствора ПВС-Хитозан-БеР8 на подложке ГА, ммоль Разбавление ГА водой Подавление, %
А 3 мл 50 - 80
А* 4 мл 50 - 30
Б 5 мл 25 1:4 100
В 5 мл 50 1:4 80
В* 4 мл 50 1:2 70
Исследования показали, что активность дафний с течением времени падает. Исходя из полученных значений процента подавления, рассчитанного спустя 24 часа с начала эксперимента, следует, что образец «Б» обладает наибольшей острой токсичностью, в то время как образец «А*» наименьшей.
Проанализировав полученные данные для каждого из образцов, можно сделать вывод, что наименьший процент подавления у пленок с наибольшим содержанием ГА. Было предположено, что при использовании концентрации ГА, равной 50 ммоль, альдегидные группы эффективнее сшиваются с амино- и гидроксильными группами полимеров. Вследствие чего, в дальнейшем на этапе отмывки щелочью вероятность удаления большинства непрореагировавших альдегидных групп
увеличивается.
В исследовании на цитотоксичность оценивали физические и химические свойства тестируемого образца «Б»: способность растворяться в растворе ростовой среды и влияние на рН среды. На первом этапе образцы помещали в лунки диаметром 1,5 см и добавляли культуральную среду, после чего образец оставляли в среде для оценки растворимости и
влияния на рН. Было выявлено, что образец «Б», не растворяется в растворе питательной среды.
Для оценки токсичности и адгезивности образца в культуральные лунки были посеяны фибробласты кожи человека (БЬ d75) в количестве 50 тысяч клеток на лунку. Клетки в присутствии образцов культивировали в течение 3 суток. При визуальном осмотре было выявлено, что клетки в присутствии образцов нормально прикреплялись к дну культуральной лунки в течение 4 часов после посева и проявляли нормальный физиологический фенотип - веретенообразную форму. При этом на поверхность образцов клетки не прикреплялись.
В течение всего времени культивирования в присутствии образца «Б» клетки не показывали активного роста, а часть клеток к концу времени культивирования округлились и открепились от дна лунок. Для оценки жизнеспособности клеток в образце «Б» на 3 сутки после посева клетки в лунках были окрашены витальным красителем Кальцеином АМ по стандартному протоколу. На рисунках 2 и 3 представлен внешний вид культуры клеток, окрашенных Кальцеином инкубированных в контакте с сеточками в течение 3 суток при разрешении 200 нм.
1 2
Рис. 2. Фибробласты человека на поверхности культуральных лунок, после 3 суток культивирования в присутствии образца «Б»; 1 - окраска витальным флуоресцентным красителем кальцеином (Са1сетАМ, зеленое окрашивание) и красителем, окрашивающим только ядра погибших клеток пропидием йодидом (Р1,
красное окрашивание), 2 - фазовый контраст.
Рис. 3. Фибробласты человека на поверхности культуральных лунок, после 3 суток культивирования в контрольной группе; 1 - окраска витальным флуоресцентным красителем кальцеином (Са1сетАМ, зеленое окрашивание) и красителем, окрашивающим только ядра погибших клеток пропидием йодидом (Р1, красное
окрашивание), 2 - фазовый контраст.
Исходя из полученных результатов, мы оценили цитотоксичность представленного образца «Б» как высокую: значительная часть клеток при контакте с ним погибает в течение 3 суток. Адгезивные свойства у образца отсутствуют, в стандартных условиях клетки к его поверхности не прикрепляются.
Разработанные нами пленки биомедицинского назначения показали такие улучшенные физические свойства как механическая прочность и структурная целостность при сохранении микроструктуры и химического состава после сшивания ГА. Увеличение биостабильности за счет сшивки ГА является универсальным и достаточно простым способом обработки медицинских изделий или покрытий на основе биополимеров, но не решает вопроса их острой токсичности и цитотоксичности. С целью снизить степень острой токсичности и цитотоксичности пленок, необходимо разработать методику, основанную на методах физической сшивки при помощи УФ-облучения, гамма-облучения или дегидротермической обработки [4]. Для уменьшения токсического эффекта при использовании химической сшивки рекомендуется проводить обработку в парах ГА, после чего проводить отмывку в фосфатно-солевом буферном растворе, а в случае его недостаточной эффективности - обрабатывать растворами, содержащими аминокислоты [3].
Список литературы
1. Майорова А. В. и др. Современный ассортимент, свойства и перспективы совершенствования перевязочных средств для лечения ран //Фармация и фармакология. - 2018. - Т. 6. - №. 1.
2. Шурыгина И. А., Шурыгин М. Г. Перспективы применения наночастиц металлов для целей регенеративной медицины //Сибирское медицинское обозрение. - 2018. - №. 4 (112). - С. 3137.
3. Немец Е. А. и др. Биостабильность и цитотоксичность медицинских изделий на основе сшитых биополимеров //Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2018. - Т. 20. - №. 1. - С. 79-85.
4. Thakur G., Rodrigues F. C., Singh K. Crosslinking biopolymers for advanced drug delivery and tissue engineering applications //Cutting-Edge Enabling Technologies for Regenerative Medicine. -2018. - С. 213-231.
5. Нечаева О. В. и др. Комплексная оценка токсичности полимерного соединения, обладающего антимикробной активностью // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. - 2016. - Т. 16. - №. 2. -С. 160-164.