CC BY
70
УДК 53.087.22
ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК МЕТОДАМИ СКАНИРУЮЩЕЙ ТУННЕЛЬНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
© Т. И. Шарипов*, Р. З. Бахтизин
Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел./факс: +7 (347) 273 65 74.
E-mail: [email protected]
Опробированы методики приготовления образцов для изучения электрической проводимости молекул ДНК методами сканирующей туннельной спектроскопии (СТС). Получены АСМ- и СТМ-изображения молекул ДНК, иммобилизованных на поверхности золота. Измерена вольтамперная характеристика (ВАХ) молекулы ДНК и вычислены флуктуационные характеристики туннельного тока, проходящего через молекулу.
Ключевые слова: сканирующая туннельная спектроскопия, молекула ДНК, вольтамперная характеристика.
Введение
Использование молекул ДНК в наноэлектрон-ных устройствах представляется очень перспективным [1, 2], что вызывает значительный интерес к процессам переноса заряда в этих молекулах. Хотя форма ДНК в виде двойной спирали была установлена более 55 лет назад [3], но до сих пор не установлена точная связь между ее структурными, химическими и электрическими свойствами. Одна из проблем заключается в том, что попытки измерить электрическое сопротивление ДНК дают противоречивые результаты: молекула может проявлять свойства диэлектрика [4, 5], полупроводника [6], металла [7-9] и даже сверхпроводника [10]. Так, Финк и Шоненбергер [7], изучая молекулы ^-ДНК длиной 1 мкм, показали, что их вольт-амперная характеристика (ВАХ) является линейной, а удельное сопротивление р-10-4 Ом-см. РогаШ с соавт. [6] описывают ВАХ с явным зазором ок. 2 В и сопротивлением 3 ГОм при напряжении 4 В у цепочек ДНК Ро1у(0) - Ро1у(С) длиной 10 нм (р~10 Ом-см). Причиной неоднозначности результатов служит сложность самой структуры молекулы ДНК и экспериментальная неопределенность. Кроме того, важными факторами являются приготовление образцов и методика исследований, влияющие на механизм переноса заряда в ДНК.
Для исследования проводимости молекулы ДНК наиболее часто используется два подхода. В первом случае изолированная молекула ДНК располагается между двумя электрическими контактами или одним электрическим контактом и проводящим кантилевером АСМ [11-13]. Два металлических электрода создают физический контакт с исследуемой молекулой, после чего подается напряжение и измеряется ток. Низкая проводимость молекулы ДНК приводит к малой величине измеряемого сигнала. В этом случае расстояние между электродами должно быть небольшим, порядка 110 нм, но достаточным, чтобы препятствовать туннелированию зарядов. Такой эксперимент достаточно сложно реализовать и особенно трудно контролировать.
Второй подход к измерению проводимости индивидуальных молекул основан на использовании сканирующего туннельного микроскопа (СТМ) [14, 15]. Уже первые эксперименты с использованием СТМ показали, что это подходящий инструмент для исследований как одиночных молекул ДНК, так и молекул в монослойных пленках [16, 17], однако, выполнение качественных и достоверных экспериментов по измерению переноса заряда через отдельную молекулу с помощью СТМ чрезвычайно затруднительно, а интерпретация полученных результатов оказывается еще более сложной.
Большая трудность, которая возникает в таких экспериментах - это подведение контактов к единичной молекуле. Точность таких манипуляций очень важна для переноса заряда, но затруднительна в исполнении.
Экспериментальные условия
Объектами исследования служили 20-звенные олигонуклеотиды и 5-тиол-модифицированные
олигонуклеотиды. Также использовались следующие реагенты: 1 мМ 2-меркаптоэтанола, гибриди-зационный буфер 100 мМ Tris.HCl/ШОмМ NaCl, раствор для промывки 100 мМ Tris HCl/ЗООмМ NaCl. Для приготовления всех растворов была использована деионизованная вода I категории качества МіІВД (Мііііроге Ltd.). АСМ и СТМ-эксперименты проводились на воздухе при комнатных условиях на многомодовом сканирующем зон-довом микроскопе Solver P47.
В качестве первоначального материала подложки использовалась пластина кремния Si (111), легированная фосфором с удельным сопротивлением 1,6 Ом-см (номинальная концентрация носителей тока ~ 8-1017 см-3). После обезжиривания в толуоле кремниевые подложки промывались в ультразвуковой ванне с ацетоном, а затем деионизова-ной водой. Следующим шагом очистки подложек являлось термообработка. Отжиг осуществляли в сушильном шкафу. Далее происходил процесс термического напыления золота на кремниевую подложку на установке ВУП-4.
* автор, ответственный за переписку
Рис. 1. а) АСМ-изображение кремниевой подложки. Заметно, что структура кремния состоит из борозд, расположенных примерно на одинаковом расстоянии друг от друга. Средняя шероховатость составляет 34 нм; б) АСМ-изображение пленки золота. АСМ-контроль показал, что золото напылилось достаточно ровно, повторив структуру кремния. Средняя шероховатость поверхности уменьшилась до 17 нм.
Следующим этапом эксперимента является модификация поверхности золота для связывания с исследуемыми олигонуклеотидами. Химическая модификация включала создание ковалентной связи химически поляризуемых групп тиолов с чистой поверхностью металла. Адсорбция ДНК осуществлялась за счет кулоновского взаимодействия молекулы с плотно упакованной мономолекулярной пленкой тиола, ориентированной положительными функциональными группами к молекуле ДНК.
Модифицированные 5-тиол олигонуклеотиды были растворены в воде. Затем 5 ^1 этого раствора было нанесено (каплей 3мм) на золотую подложку, которая затем была помещена в чашку Петри с увлажненной атмосферой, созданной при помощи кюветы с водой. Она была выдержана 16 часов при температуре 50 °С. Потом подложка дважды промывалась в воде и в растворе 2-меркаптоэтанола. Данный раствор был использован для увеличения доступности иммобилизируемых образцов к комплементарным последовательностям. Тиольные группы быстро смещали более слабые контакты между ДНК нуклеотидами и подложкой. Затем подложка помещалась обратно в чашку Петри и 2 часа хранилась при температуре 40 °С, после чего подложка промывалась в воде.
Олигонуклеотиды в концентрации 1^М были выдержаны в растворе для гибридизации при 80 °С 10 минут. Непосредственно после этого процесса, 5 ^1 данного раствора было нанесено на подложку, которая затем выдерживалась в течение 1 часа в атмосфере воздуха с температурой 40 °С. Затем она промывалась в буфере для промывки и после в чистой воде. Потом приготовленные подложки сушились при комнатных условиях.
Результаты и их обсуждение
АСМ-исследование показало, что на поверхности исследуемого образца наблюдаются некие объекты (рис. 2а), которые и являются молекулами ДНК. Их расположение на подложке достаточно разряжено. Чтобы измерить вольтамперные характеристики, необходимо получить СТМ-
изображение для идентификации молекул ДНК на поверхности подложки. Известно, что на СТМ-
изображении молекулы ДНК представляются темными пятнами, поскольку они имеют меньшую электрическую проводимость по сравнению с золотом.
СТМ-исследование поверхности золота с иммобилизованными молекулами ДНК проводилось в режиме постоянного туннельного тока. На СТМ-изображении (рис. 2б) наблюдаются темные области малого диаметра - молекулы ДНК. Их латеральные размеры сходятся с размерами ДНК на АСМ-изображениях.
После получения ряда СТМ-изображений и идентификации молекул ДНК на них мы приступили к снятию вольтамперных характеристик (ВАХ), которые представляли собой зависимости силы туннельного тока через молекулы ДНК от величины приложенного напряжения между подложкой и острием СТМ (рис. 3). Вольтамперные характеристики снимались в темных точках, где предположительно и располагаются молекулы ДНК. Интервал измерений напряжения U .между подложкой образца ДНК и острием СТМ составлял от -1.5 В до 1.5 В.
Кривая ВАХ имеет симметричный вид относительно нулевых значений как тока, так и напряжения. Вид кривой зависимости тока от напряжения нелинейный. Особенно заметно нелинейный характер ВАХ проявляется при напряжениях больше 1 В. Интересно отметить, что на участках ВАХ с выраженным проявлением нелинейности ^ больше 1В) заметен рост мощности или дисперсии флуктуаций а2 мгновенных значений туннельного тока. При этом, однако, уровень относительных флуктуаций аЛср не только не возрастает, а даже несколько снижается с ростом туннельного тока Iср (см. рис. 5).
При выборе адекватных моделей флуктуаций важное значение имеет оценка функциональной зависимости мощности флуктуаций от величины среднего значения тока (см. рис. 4). В шумовой спектроскопии чаще всего используется степенная аппроксимация вида
=с 0 ■ ^, (1)
где Co - коэффициент аппроксимации; а - показатель степени аппроксимации.
7 і/¿ifі
it І, Л
/. і *’/•
Рис. 2. а) АСМ-изображение молекул ДНК на поверхности золота; б) СТМ-изображение молекул ДНК
на поверхности золота.
Рис. 3. Вольт-амперные характеристики молекул ДНК.
Расчеты, проведенные на основе экспериментальных данных, показали, что показатель степени аппроксимации
а = 1.53 (2)
при коэффициенте значимости Я2 > 0.95.
Для наглядности идентификации шума далее приведена таблица показателей степени аппроксимации токовой зависимости мощности флуктуаций для различных видов шумов [18].
Из таблицы видно, что по полученному соответствию токовой зависимости мощности флуктуаций наиболее подходящими видами шумов являются модуляционные шумы и шум вида 1//.
В случае флуктуации сопротивления необходимые соотношения для дисперсии токовых флуктуаций могут быть получены из закона Ома для участка цепи с активным сопротивлением г(г)
I (,)=и ’ (3)
г (г)
где и постоянное напряжение, приложенное к участку цепи. Продифференцируем (3) по времени с нахождением конечных разностей флуктуаций тока и сопротивления
Я ^ Я Г (г) (4)
Г (г)
Рис. 4. Зависимость дисперсии а2 флуктуаций отсчетных (мгновенных) значений туннельного тока от среднего во времени значения туннельного тока 1ср.
Для нахождения относительных флуктуаций разделим (4) на (3)
ô i(t) = ô r(t), (5)
i(t) r(t)
знак минус означает противоположное направление изменения по величине тока и сопротивления.
Перейдем в (5) к среднеквадратическим значениям флуктуаций тока и сопротивления
а? = (S і )2 = -у(S r )2 = -jа?.
(6)
Из (6) видно, что дисперсия флуктуаций тока пропорциональна квадрату среднего значения
дрейфового тока.
Таблица 1
Показатель степени аппроксимации токовой зависимости мощности флуктуаций для различных видов шумов
Вид шума
Равновесный тепловой шум 0
Дробовой шум 1
Модуляционный шум флуктуации сопротивления 2
Избыточные низкочастотные флуктуации вида 1//. Фликкер-шум 1-2
2
r
r
а
Заметим, что в случае сопоставления экспериментальных данных с модуляционными шумами уменьшенное по сравнению с 2 значение а может быть объяснено наличием системы стабилизации туннельного тока в СТМ.
V А
Рис. 5. Зависимость величины относительных флуктуаций аЛср отсчетных значений туннельного тока от среднего во времени значения туннельного тока 1ср.
Выводы
В работе проведены экспериментальные исследования по измерению вольтамперных характеристик - зависимости силы туннельного тока, проходящего через молекулу ДНК, от величины приложенного напряжения между подложкой и острием СТМ. Вычислены флуктуационные характеристики туннельного тока. Изучение электрической проводимости чрезвычайно важно и имеет решающее значение в развитии амперометрических биосенсоров.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ-Поволжье №11-02-97006-р_поволжье_а.
ЛИТЕРАТУРА
1. S. Zalis, I. Kratochvílová, A. Zambova, J. Mbindyo, T. E. Mallouk, T. S. Mayer, Combined experimental and theoretical DFT study of molecular nanowires negative differential resistance and interactionwith gold clusters // Eur. Phys. J. 2005. V. 18. P. 201-206.
2. I. Kratochvílová, S. Nespurek, J. Sebera, S. Zális, M. Pavelka, G. Wang, J. Sworakowski, New organic FET-like photoactive device, experiments and DFT modeling // Eur. Phys. J. 2008. V. 25. P. 299-307.
3. J. D. Watson, F. H. Crick. Molecular structure of nucleic acids // Nature. 1953. V. 171. P. 737-738.
4. Brauns E. B., Madaras M. L., Coleman R. S., Murphy C. J., Berg M. A. // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 11644.
5. Storm A J, Noort J van, Vries S de, Dekker C. // Appl. Phys. Lett. 2001. V. 79. P. 3881.
6. Porath D., Bezryadin A., De Vries S., Dekker C. // Nature. 2000. V. 403. P. 635.
7. H. W. Fink, C. Schonenberger // Nature. 1999. V. 398. P. 407.
8. Rakitin A, Aich P, Papadopoulos C, Kobzar Y, Vedeneev A S, Lee J. S., Xu J. M. // Phys. Rev. Lett. 2001. V. 86. P. 3670;
9. Tran P., Alavi B., Grüner G. // Phys. Rev. Lett. 2000. V. 85. P 1564.
10. Kasumov A. Y., Kociak M., Gueron S., Reulet B., Volkov V. T., Klinov D. V., Bouchiat H. Science. 2001. V. 291. P. 280.
11. A. F. Morpurgo, C. M. Marcus, D. B. Robinson, Controlled fabrication of metallic electrodes with atomic separation // Appl. Phys. Lett. 1999. V. 74. P. 2084.
12. P. J. de Pablo, F. Moreno-Herrero, E. Artacho, Absence of DC-conductivity in X-DNA molecules between nanoelectrodes at the 100 nm length scale // Appl. Phys. Lett. 2001. V. 79. P. 3881.
13. P. J. de Pablo, F. Moreno-Herrero, J. Colchero, J. Gomez Herrero, P. Herrero, A. M. Baro, P. Ordejon, J. M. Soler, and E. Artacho, Absence of DC-conductivity in X-DNA // Phys. Rev. Lett. 2000. V. 85. P. 4992-4995.
14. H. Cohen, C. Nogues, R. Naaman, D. Porath, Direct measurement of electrical transport through single DNA molecules of complex sequence // PNAS. 2005. V. 102. P. 11589-11593;
15. I. Kratochvílova, K. Kral, M. Buncek. Conductivity of natural and modified DNA measured by scanning tunneling microscopy. The effect of sequence, charge and stacking // Biophys. Chemistry. 2008. V. 138. P. 3-10
16. A. I. Onipko, K. F. Berggren, Y. O. Klymenko, L. I. Malysheva, J. J. W. M. Rosnik, L. J. Geerlings, E. van der Drift, S. Radelaar, Scanning tunneling spectroscopy on п-conjugated phenyl-based oligomers: a simple physical model // Phys. Rev. B. 2000. V. 61 P. 11118-11124.
17. J. J. W. M. Rosnik, M. A. Blauw, L. J. Geerlings, E. van der Drift, S. Radelaar. Tunneling spectroscopy and modeling of electron transport in small conjugated azomethine molecules // Phys. Rev. B 2000. V. 62. P. 10459-10466.
18. Гоц С. С. Основы описания и компьютерных расчетов характеристик случайных процессов в статистической радиофизике. Учебное пособие. Уфа: РИО БашГУ, 2005. 166 с.
Поступила в редакцию 06.11.2012 г. После доработки - 16.11.2012 г.
