CC BY
92
УДК 615.36:547.454 012
ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ
КАРБОКСИ-АРАБИНОГАЛАКТАНА ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ (LARIX SIBIRICA L.) С АМИНОГЛИКОЗИДАМИ
© Р. Х. Мударисова1, Л. А. Бадыкова1*, А. А. Фатыхов1, Ю. Б. Монаков1,2
1 Институт органической химии Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.
Тел./факс: +7 (347) 235 60 66.
2Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Tел./факс: +7 (34 7) 273 6 7 78.
E-mail: badykova@mail.ru
Физико-химическими методами исследован процесс взаимодействия карбокси-арабиногалактана лиственницы сибирской (Larix Sibirica L.) с амикацином и гентамицином в водных растворах. Установлены состав и константа устойчивости образующихся комплексов, найдены оптимальные условия получения.
Ключевые слова: арабиногалактан, карбокси-арабиногалактан, полисахариды, комплексо-образование, аминогликозиды
Интерес к природным полисахаридам в значительной степени связан с перспективами создания на их основе пролонгированных лекарственных форм. Известно, что природный полисахарид арабиногалактан обладает уникальными свойствами: высокой и разнообразной биологической активностью, нетоксичностью, водорастворимостью и способностью к биодеградации [1-8]. Поэтому арабиногалактан можно рассматривать как перспективную матрицу для создания лекарственных препаратов пролонгированного действия. Однако более высокой физиологической активностью по сравнению с исходным полисахаридом, обладает окисленный арабиногалактан (карбокси-АГ), представляющий собой продукт окисления лиственничного арабиногалактана. Упрощенно строение карбокси-АГ можно представить следующей формулой:
АМ
„J2SV
N„
„3C'
Целью данной работы явилось исследование взаимодействия карбокси-АГ с двумя антибиотиками аминогликозидового ряда - амикацином (АМ) и гентамицином (ГМ). Данные антибиотики, имея широкий спектр антибактериальной активности, обладают характерным свойством - нефротоксич-ностью и особенно ототоксичностью [9]. Связь лекарственных препаратов с карбокси-АГ может обеспечить пролонгированность действия и существенно снизить токсичность исходных антибиотиков, так как общее количество лекарственного вещества на курс лечения сокращается.
ГМ
Состав полученных соединений изучали методами УФ-спектрофотометрии, вискозиметрии и денсиметрии, возможное строение - методами ЯМР и ИК спектроскопии.
Были исследованы спектры поглощения ами-ногликозидов и их смесей с карбокси-АГ в водных растворах в присутствии 0.1М ЫаС1. Исследуемые аминогликозиды в УФ области при концентрации растворов от 1 • 10-3 до 2• 10-2 моль/л характеризуются полосами поглощения с максимумами при 267 и 286 нм для АМ и ГМ соответственно. В присутст-
2
* автор, ответственный за переписку
вии карбокси-АГ максимумы полос поглощения сдвигаются в коротковолновую область до 245 нм для обоих антибиотиков (сам карбокси-АГ при концентрации 0.5^10-2 моль/л имеет полосу поглощения 278 нм). Согласно [10], такой сдвиг может быть объяснен образованием комплекса аминогли-козид-карбокси-АГ.
Состав комплексов изучали в водных растворах с рН 7 и при длине волны 245 нм для обоих аминогликозидов. Для определения состава использовали спектрофотометрический метод мольных отношений [11], а также методы денсиметрии и вискозиметрии [12].
Для всех исследуемых систем была получена зависимость поглощения растворов от концентрации антибиотиков при постоянной концентрации полисахарида.
По методу мольных отношений спектральные изменения описываются следующим уравнением:
[АГУ(А-А0)=1/(е-е0)+1/((£-£0)-К-[т
где А и А0- оптические плотности растворов в присутствии и в отсутствии Я соответственно, [АГ]0 -начальная концентрация карбокси-АГ, е и е0 -молярные экстинкции соответствующего состава, К - константа устойчивости, [Я] - концентрация второго реагента.
Из графика зависимости [АГ]0/(А-А0) от 1/[Я] по тангенсу угла наклона находили константу устойчивости комплексов. Константа устойчивости составила 15.0-103 л/моль для АМ и 1.8-103 л/моль для ГМ.
Графическая зависимость оптической плотности растворов аминогликозида от концентрации карбокси-АГ показывает присутствие в растворе комплексов состава 2:1, т. е. при образовании комплекса на два элементарных звена карбокси-АГ приходится одна молекула антибиотика.
При изучении физико-химических свойств бинарных систем «карбокси-АГ + вода» и трехкомпонентных систем «карбокси-АГ + вода + аминогли-козид» методами денсиметрии и вискозиметрии также получено соотношение, соответствующее стехиометрическому составу комплекса 2:1.
Для получения более полной информации о структуре полученных соединений были зарегистрированы спектры ЯМР 13С. Согласно этим данным, при взаимодействии карбокси-АГ с аминог-ликозидами, в спектрах полученных соединений наблюдается смещение химических сдвигов практически всех атомов углерода по сравнению с исходными компонентами. Наиболее сильные сдвиги наблюдаются у атомов углерода, участвующих в образовании гликозидной связи (С2, С8, С10 - до 0.14 м. д.), а также у атомов углерода с концевыми гидроксильными группами (С5, С24, С25, С26 - до 0.2 м.д.). Также в спектре ЯМР 13С комплекса «карбокси-АГ + аминогликозид», происходит смещение химических сдвигов сигналов атомов углерода карбокси-АГ, в частности изменяется сигнал при С5. Он существенно отличается от стандартного значения в
спектре исходного полисахарида. Эти изменения указывают на происходящее комплексообразование между карбокси-АГ и антибиотиками с участием гидроксильных и гликозидных групп молекул биополимера и лекарственного соединения.
Для систем «карбокси-АГ+аминогликозид» были сняты спектры ЯМР :Н при 25 оС и 50 оС. Анализ спектров показывает, что при повышении температуры, сигнал протонов групп С-О гликози-да при С2 и С21, смещается в слабое поле до 0.2 м.д., что характерно для резонансных сигналов протонов, связанных водородной связью [13]. При повышении температуры наблюдается также расщепление поглощения протонов гликозидной группы антибиотиков на два резонансных сигнала. Данные изменения можно объяснить вовлеченностью глико-зидных групп в межмолекулярную водородную связь, ослабляющуюся при повышении температуры.
Взаимодействие полисахарида с аминоглико-зидами характеризуется значительными изменениями в ИК спектрах. Были исследованы спектры исходных веществ и полученных комплексов с отнесением наиболее важных полос. Обнаружено, что в спектрах выделенных комплексов появляется интенсивная полоса поглощения 1527 см-1 в случае «карбокси-АГ + АМ» и 1531 см-1 в случае «карбок-си-АГ + ГМ», характерная для деформационных колебаний аминогрупп АМ и ГМ. Также проявляются полосы поглощения валентных колебаний аминогрупп в области 3500-3400 см-1 и в области 900-650 см-1 [14]. Кроме того, в спектрах наблюдается смещение максимума поглощения ОН-групп (3600-3050 см-1) до 100 см-1 и групп С-О гликози-да (1135-1070 см-1) на 15-20 см-1 в низкочастотную область. Это может говорить об образовании меж-молекулярных водородных связей за счет гидроксильных и гликозидных групп молекул полимерной матрицы и лекарственного вещества, т. е. присоединение антибиотиков к карбокси-АГ осуществляется, в основном, при взаимодействии этих групп.
Таким образом, учитывая возможность образования различных типов водородных связей карбокси-АГ с аминогликозидами, проведенные исследования позволяют сделать предположение, что в системах «карбокси-АГ + АМ» и «карбокси-АГ + ГМ» взаимодействие между компонентами носит достаточно сложный характер. Вероятно, формирование комплекса протекает через координацию одной молекулы антибиотика и двух углеводных звеньев кар-бокси-АГ с образованием между ними межмолеку-лярных водородных связей с участием практически всех водородсодержащих групп.
При оптимизации условий получения комплексов карбокси-АГ с аминогликозидами было рассмотрено влияние температурных режимов реакции, ее продолжительности и соотношения реагентов на состав полученных продуктов. Результаты представлены в табл.
Таблица
Влияние условий комплексообразования на содержание антибиотика в продукте реакции
Мольное соотношение кар-бокси-АГ : антибиотик t, ч н о О Содержание антибиотика, моль / осново-моль полимера
Карбокси-АГ : ГМ
1:1 0.5 20 0.53
1:1 1.0 20 0.50
1:1 3.0 20 0.52
1:1 24.0 20 0.52
1:0.25 2.0 20 0.38
1:0.5 2.0 20 0.48
1:1 2.0 20 0.59
1:2 2.0 20 0.65
1:1 2.0 0 0.55
1:1 2.0 40 0.57
1:1 2.0 80 0.54
Карбокси-АГ : АМ
1:0.25 2.0 20 0.54
1:0.5 2.0 20 0.55
1:1 2.0 20 0.63
1:2 2.0 20 0.71
Из полученных результатов видно, что температурный режим и продолжительность реакции практически не оказывают влияния на содержание лекарственного препарата в комплексе. При возрастании молярного соотношения карбокси-АГ : ами-ногликозид до 1:2, количество присоединяемого антибиотика несколько возрастает. Дальнейшее увеличение количества введенного препарата не приводит к повышению содержания его в комплексе. Синтезированные комплексные соединения были выделены путем осаждения спиртом из водного раствора, очищены и исследованы спектральными методами. Все полученные соединения хорошо растворимы в воде и практически нерастворимы в спирте, ацетоне, эфире.
Т аким образом, в результате проведенного исследования установлено, что при взаимодействии карбокси-АГ с амикацином и гентамицином образуется комплекс средней устойчивости состава 2:1. Формирование комплекса происходит, в основном, с участием гидроксильных и гликозидных групп молекул биополимера и лекарственного соединения.
При изучении острой токсичности максимальная доза введения составила 1500 мг/кг. Дальнейшие токсикологические исследования не проводились из-за явной нетоксичности соединения. Таким образом, исследуемые вещества относится к слаботоксичным соединениям 4 группы. Синтезированные комплексы могут быть эффективными при лечении разнообразных бактериальных инфекций.
Экспериментальная часть
Для окисления был взят лиственничный АГ с молекулярной массой 38500, выделенный водной экстракцией из древесины лиственницы сибирской [15]. Карбокси-АГ получали окислением первичных
гидроксигрупп арабиногалактана в водной среде системой 2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1 -оксил (TEMnO)-NaBr-NaClO (рН 10.2, комнатная температура) с применением в качестве окислителя доступного ~6%-ного водного раствора коммерческого отбеливающего средства - гипохлорита натрия («Белизна»). Отсутствие первичных гидроксигрупп в карбокси-АГ подтверждено данными ИК (появление интенсивного пика при 1600 см-1 для карбок-силат-аниона) и ЯМР спектроскопии. В спектре ЯМР 13С в области 176-178 м.д. наблюдается появление группы сигналов, отвечающих атомам углерода карбоксильных групп окисленных остатков арабинозы и галактозы (арабинуроновой и галакту-роновой кислот соответственно). При этом сигналы атомов углерода групп СН2ОН в области 62-63 м. д. отсутствуют, что также свидетельствует о полной трансформации первичных гидроксигрупп араби-ногалактана в карбоксильные группы.
Спектры ЯМР 13С снимали на спектрометре Bruker AM-300 (рабочая частота - 75.47 МГц) с широкополосным подавлением по протонам и в режиме JMODXH. Использованы 3-5%-ные растворы карбокси-АГ в D2O, внутренний стандарт ТМС. Спектры записаны при температуре 25 °С с задержкой между импульсами 15 сек. Спектры ЯМР 1Н регистрировали на спектрометре Bruker AM-300 (рабочая частота - 300 МГц), растворитель -D2O. УФ спектры водных растворов снимали в кварцевых кюветах на спектрофотометре UV-VIS SPECORD M-40 в области 230-300 нм. ИК спектры записывали на спектрофотометре Shimadzu в области 700-3600 см-1 в вазелиновом масле. Для контроля pH растворов использовали рН-метр «АНИОН 4100». Содержание антибиотика в реакционных смесях определяли с помощью элементного анализа. Элементный состав продуктов реакции определяли по общепринятым методикам на C, H, N, S - анализаторе марки EUKO EA-3000. В расчет брали средний результат из двух параллельных анализов. Ошибка эксперимента составляет 0.2%.
Методика получения комплексов: 5.5 осно-во-ммоль карбокси-АГ (1 г) растворяли в 20 мл воды. Антибиотик в количестве 5.5 ммоль (4.3 г для АМ и 3.0 г для ГМ) растворяли в 20 мл воды и доводили рН до 7.0. К раствору полисахарида при интенсивном перемешивании прикапывали раствор аминогликозида при комнатной температуре. Реакцию проводили в течение 3 ч. По окончании реакции продукт выделяли осаждением этиловым спиртом, переосаждали снова из воды в спирт, осадок отделяли и промывали 3 раза спиртом, затем ди-этиловым эфиром и высушивали под вакуумом.
Плотности растворов исследуемых соединений определяли с помощью пикнометра при температуре 25 °С. В качестве растворителя использовали водные растворы 0.05М NaCl. В трехкомпонентных растворах (карбокси-АГ, вода, антибиотик) концентрация антибиотика была фиксированной
(0.04 моль/л). Концентрация карбокси-АГ (дадт) изменялась в пределах от 0 до 0.16 моль/л.
Вязкость растворов измеряли на вискозиметре типа Уббелоде с висячим уровнем. Измерения вязкости проводили при 25 оС. В трехкомпонентных растворах (карбокси-АГ, вода, антибиотик) кон -центрация антибиотика была фиксированной (0.04 моль/л). Концентрация карбокси-АГ (тдт) изменялась в пределах от 0 до 0.16 моль/л.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антонова Г. Ф., Тюкавкина Н. А. // Химия древесины.
1983. №2. С. 89-96.
2. Арифходжаев А. О. // Химия природных соединений. 2000. №3. С. 185-197.
3. Оводов Ю. С. // Биоорганическая химия. 1998. Т. 24. С. 483-501.
4. Yamada H., Kiyohara H., Cyong J. C., Otsuka Y. // Carbohydrate Research. 1987. V. 159. P. 275-291.
5. Kiyohara H., Yamada H. // Carbohydrate Research. 1989. V. 193. P. 173-192.
6. Kiyohara H., Cyong J. C., Yamada H. // Carbohydrate Re-
search. 1989. V. 193. P. 193-200.
7. Shimizu N., Tomoda M., Gonda R., Kanari M.,Takanashi N. //
Chemical Pharmaceutical Bulletin. 1989. V. 37. Р. 1329-1332.
8. Gonda R., Tomoda M., Ohara N., Takada K. // Biological Pharmaceutical Bulletin. 1993. V. 16. P. 235-238.
9. Машковский М. Д. Лекарственные средства. Харьков: Торсинг, 1997. Т. 2. 590 с.
10. Эндрюс Л., Кифер Р. Молекулярные комплексы в органической химии. М.: Мир. 1967. 206 с.
11. Булатов М. И., Калинкин И. П. Практическое руководство по фотометрическим методам анализа. Л.: Химия, 1986. 386 c.
12. Волкова Н. Л., Лебедева Н. Ш., Парфенюк Е. В. // Координационная химия. 2005. Т. 31. №12. С. 946-949.
13. Гюнтер Х. // Введение в курс спектроскопии ЯМР. М.: Мир, 1984. 478 с.
14. Иоффе Б. В., Костиков Р. Р., Разин В. В. // Физические методы определения строения органических молекул. Л.: изд-во Ленинградского университета, 1976. 344 с.
15. Антонова Г. Ф., Усов А. И. // Биоорганическая химия.
1984. Т. 10. №12. С. 1664-1669.
Поступила в редакцию 16.04.2010 г.
