CC BY
10
a This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License ^ by https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
5 ÜÜ RESEARCH ARTICLE | НАУЧНАЯ СТАТЬЯ © Yaborova O.V., Belonogova V.D., Alekseeva I.V., 2022
( ^oi http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-3-86-99
Ш Принята 20.03.2022 | Accepted 20.03.2022
L_ 1 615.89; 615.322
INVESTIGATION OF THE IMMUNOTOXIC PROPERTIES OF STRAWBERRY GARDEN LEAF EXTRACT DRY
Yaborova O. V., Belonogova V.D., Alekseeva I. V.
Perm state pharmaceutical academy, Perm, Russian Federation
ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ ЛИСТЬЕВ ЭКСТРАКТА СУХОГО
Яборова О.В., Белоногова В.Д., Алексеева И.В.
ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России, г. Пермь, Российская Федерация
Abstract: The main task of the preclinical study of the effect of potential drugs on the immune system is to prove or exclude the possibility of developing an immunotoxic effect caused by a pharmacological agent or its metabolites in an animal experiment. The proposed approach to assessing the immunotoxic effect of pharmacological agents consists in the study of a number of integral immunological functions that allow, taking into account the results of hematological and morphological studies of lymphoid organs, to assess the possible risk when using a new pharmacological agent. Mandatory testing for immunotoxicity should be subject to new, original pharmacological agents, as well as well-known drugs for which there is no data on the study of immunotoxicity, recommended for use in long repeated courses; use in pediatric practice, as well as for the treatment of pregnant women and when prescribed during lactation; as prophylactic agents and contraceptives; for use without a doctor's appointment among the general population [2,3]. Strawberry garden leaf extract dry (strawberry garden extract) is one of the potential substances for obtaining safe medicines for the prevention and treatment of diseases of the urinary tract, as it has diuretic and anti-inflammatory activity [4]. The study of the immunotoxic properties of strawberry garden extract is an obligatory part of the preclinical safety assessment of a new
Аннотация: Основная задача доклинического изучения влияния потенциальных лекарственных средств на иммунную систему состоит в том, чтобы в эксперименте на животных доказать или исключить возможность развития
иммунотоксического действия, вызванного фармакологическим средством или его метаболитами. Предложенный подход к оценке иммунотоксического действия
фармакологических средств заключается в исследовании ряда интегральных
иммунологических функций, позволяющих, с учетом результатов гематологических и морфологических исследований лимфоидных органов, оценить возможный риск при применении нового фармакологического средства.
Обязательному тестированию на
иммунотоксичность должны подвергаться новые, оригинальные фармакологические средства, а также известные лекарственные средства, для которых отсутствуют данные об изучении иммунотоксичности, рекомендуемые для применения длительными повторными курсами; применения в детской практике, а также для лечения беременных женщин и при назначении в
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
pharmacological substance for obtaining safe medicines with it. In this regard, studies on the study of the immunotoxic properties of strawberry leaves of dry extract in the framework ofpreclinical studies and substantiation of the use of the substance for the further development of medicines based on it are relevant.
Keywords: strawberry garden leaf extract dry, effect on immunity links, mutagenic activity, lethal mutations, gene mutations.
период лактации; в качестве профилактических средств и контрацептивов; для использования без назначения врача среди широких слоев населения [2,3]. Земляники садовой листьев экстракт сухой (земляники садовой экстракт) - одна из потенциальных субстанций для получения безопасных лекарственных средств для профилактики и лечения заболеваний мочевыводящих путей, так как обладает диуретической и противовоспалительной активностью [4]. Исследование
иммунотоксических свойств земляники садовой экстракта является обязательной частью доклинической оценки безопасности новой фармакологической субстанции для получения безопасных лекарственных средств с ним. В связи с этим актуальными являются исследования по изучению иммунотоксических свойств земляники садовой листьев экстракта сухого в рамках доклинических исследований и обоснования применения субстанции для дальнейшей разработки лекарственных средств на его основе.
Ключевые слова: земляники садовой листьев экстракт сухой, влияние на звенья иммунитета, мутагенная активность, летальные мутации, генные мутации.
REFERENCES
[1] Guidelines for the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances. Methodological guidelines for the study of the general toxic effect of pharmacological substances. The study of "chronic" toxicity. - M.: Medicine. - 2005. - pp. 41-122
[2] International Chemical Safety Program (IPCS). Principles and methods for assessing direct immunotoxicity associated with exposure to chemicals. Geneva: World Health Organization, 1996- - 390 p.
[3] Kataeva R.M., Agletdinov E.F., Kataev V.A., Ivanova N.A., Khalikov R.A. The study of immunotoxicity and allergenic properties of 11-deoxymisoprostol // Fundamental research. - 2014. - No. 10-10. - pp. 19381941;
[4] Yaborova O.V., Sosnina S.A., Turyshev A.Yu. Study of diuretic and anti-inflammatory activity of infusion and extract of dry strawberry leaves // Medical and pharmaceutical journal "Pulse". - 2021. - Vol. 23. - No. 6. - pp. 136-142.
[5] Oleshko G.I., Petukhova O.V., Yushkov V.V., Blinova O.A., Marchenko S.D. A method for obtaining a drug with diuretic and anti-inflammatory activity // Patent of the Russian Federation No. 2342945. Patent holder of the State Educational Institution of Higher Education of Roszdrav. 2009. Byul. No. 1.
[6] Yaborova O.V., Sosnina S.A., Turyshev A.Yu. The choice of optimal technology for obtaining dry
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
[1] Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. Изучение «хронической» токсичности. - М.: Медицина. - 2005. - С. 41-122
[2] Международная программа по химической безопасности (МПХБ). Принципы и методы оценки прямой иммунотоксичности, связанной с воздействием химических веществ. Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1996.- 390 С.
[3] Катаева Р.М., Аглетдинов Э.Ф., Катаев В.А., Иванова Н.А., Халиков Р.А Изучение иммунотоксичности и аллергенных свойств 11-дезоксимизопростола // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 10-10. - С. 19381941;
[4] Яборова О.В., Соснина С.А., Турышев А.Ю. Изучение диуретической и противовоспалительной активности настоя и экстракта сухого листьев земляники садовой // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". - 2021. - Т. 23. - №6. - С. 136-142.
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
strawberry leaf extract // Medico-pharmaceutical journal "Pulse". 2021. Vol.23. No. 1. pp. 60-65.
[5] Олешко Г.И., Петухова О.В., Юшков В.В., Блинова О.А., Марченко С.Д. Способ получения средства, обладающего диуретической и противовоспалительной активностью // Патент РФ № 2342945. Патентообладатель ГОУ ВПО ПГФА Росздрава. 2009. Бюл. № 1.
[6] Яборова О.В., Соснина С.А., Турышев А.Ю. Выбор оптимальной технологии получения экстракта листьев земляники садовой сухого // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". 2021. Т.23. №1. С. 60-65.
Author Contributions. Alekseeva I.V. - literature review, text writing; Yaborova O.V., Belonogova V.D. - statistical data processing, collection and processing of materials, research concept and design. Conflict of Interest Statement. The authors declare no conflict of interest.
Yaborova O.V. - SPIN- ID: 2805-7100; ORCID ID: 0000-0002-9995-2989
Research interests, number of main publications: Pharmaceutical chemistry, Pharmacognosy, Technology of drug production, are published more 40 publications from them 10 in VAK.
Belonogova V.D. - SPIN- ID: 7795-5610; ORCID ID: 0000-0001-5193
Research interests, number of main publications: Pharmaceutical chemistry, Pharmacognosy, phytotherapy, resource and phytochemical research, standardization and ecology of medicinal plants and medicinal plant raw materials, are published more 100 publications from them more 60 in VAK and 10 in Scopus.
Alekseeva I.V. - SPIN- ID: 6978-8255; ORCID ID: 0000-0003-4357-5974
Research interests, number of main publications: Technology for obtaining medicines, are published 225 publications from them 42 in VAK and 10 in Scopus.
Вклад авторов. Алексеева И.В. — обзор литературы, написание текста; Яборова О.В., Белоногова В.Д. -статистическая обработка данных, сбор и обработка материалов, концепция и дизайн исследования. Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Яборова О.В. - SPIN ID: 2805-7100; ORCID ID:0000-0002-9995-2989
Сфера научных интересов, количество основных публикаций: Фармацевтическая химия, Фармакогнозия, Технология получения лекарств, опубликованы более 40 публикаций, из них 10 статей в изданиях ВАК.
Белоногова В.Д. - SPIN ID: 7795-5610; ORCID ID: 0000-0001-5193 Сфера научных интересов, количество основных публикаций:
Фармацевтическая химия, Фармакогнозия, фитотерапия, ресурсоведческие и фитохимические исследования, стандартизация и экология лекарственных растений и лекарственного растительного сырья, опубликовано более 100 публикаций, из них более 60 в изданиях ВАК и 10 статей в международной базе цитирования Scopus.
Алексеева И.В. - SPIN ID 6978-8255; ORCID 0000-0003-4357-5974 Сфера научных интересов, количество основных публикаций:
Технология получения лекарств, опубликовано более 225 публикаций, из них 42 в изданиях ВАК и 10 статей в международной базе цитирования Scopus.
For citation: Yaborova O.V., Belonogova V.D., Alekseeva I.V. INVESTIGATION OF THE IMMUNOTOXIC PROPERTIES OF STRAWBERRY GARDEN LEAF EXTRACT DRY // Medical & pharmaceutical journal "Pulse". - 2022. - №3. Vol.24. - C. 86-99. Doi: http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-3-86-99."
Для цитирования: Яборова О.В., Белоногова В.Д., Алексеева И.В. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ ЛИСТЬЕВ ЭКСТРАКТА СУХОГО // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". - 2022. - №3. Т.24. - С. 86-99. Doi: http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-3-86-99.
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
Введение. Основная задача доклинического изучения влияния потенциальных лекарственных средств на иммунную систему состоит в том, чтобы в эксперименте на животных доказать или исключить возможность развития
иммунотоксического действия, вызванного фармакологическим средством или его метаболитами. В Пермской государственной фармацевтической академии на кафедре фармакогнозии из сырья листьев земляники садовой был разработан земляники садовой листьев экстракт сухой [5,6] и получена его опытная серия на ОАО «Биохиммаш» в г. Москва. Также была изучена фармакологическая активность экстракта земляники и установлено его диуретическое и противовоспалительное действие [4]. Изучение острой токсичности земляники садовой экстракта показало, что его можно отнести к малотоксичным веществам [4]. В связи с этим актуальными являются исследования по изучению иммунотоксических свойств экстракта в рамках доклинических исследований и обоснования применения субстанции для дальнейшей разработки лекарственных средств на его основе.
Цель настоящего исследования заключалась в изучении иммунотоксических свойств земляники садовой листьев экстракта сухого.
Материалы и методы. Объектом исследования служил земляники садовой листьев экстракт сухой, полученный на ОАО «Биохиммаш». Исследование иммунотоксических свойств земляники садовой листьев экстракта сухого выполнено в лаборатории лекарственной токсикологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» в соответствии с «Методическим указаниями по оценке иммунотоксического действия
фармакологических веществ» (Руководство по экспериментальному (доклиническому)
изучению новых фармакологических веществ) [1] и в соответствии с рекомендациями ВОЗ «Principes and methods for assessing direct immunotoxicity associated with exposure to chemical» [2].
Иммунотоксические свойства земляники экстракта изучены на модели тимус-зависимого иммунного ответа, которую воспроизводили внутрибрюшинным введением эритроцитов
барана (ЭБ) в оптимальных дозах мышам линии CBA/Lac. Результаты обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (m). Обработка полученных данных производилась с использованием пакета прикладных программ Statistica.
Иммунотоксические свойства земляники садовой экстракта изучали в следующей последовательности:
Изучение влияния земляники экстракта сухого на гуморальное звено иммунитета.
Оценку гуморального звена иммунитета проводили по методу Cunningham с определением количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титра антител к ЭБ в сыворотке крови в микротесте гемагглютинации.
Изучение влияния земляники экстракта сухого на клеточное звено иммунитета.
Влияние земляники экстракта сухого на клеточное звено иммунитета изучали в тесте гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Для постановки реакции ГЗТ (Ihong et Ferrante) мышей иммунизировали подкожным введением в межлопаточную область эритроцитов барана в дозе (2х108 клеток на мышь). Исследования выполнены на 28 мышах линии CBA/Lac (самцы, масса тела 19-21 г), которые разделены на 4 группы по 7 животных в каждой. Индекс реакции вычисляли по формуле: U = (mo -mk) / mk х 100%,
Где mo - масса опытной лапки; mk - масса контрольной лапки.
Изучение мутагенной активности земляники экстракта сухого.
Исследование мутагенной активности земляники экстракта сухого проведено совместно с Институтом общей генетики РАН под руководством доктора биологических наук Абилева С.К. Эксперименты выполнены в соответствии с «Руководство по экспериментальному (доклиническому)
изучению новых фармакологических веществ» [1] в следующих тестах:
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
• Учет хромосомных аберраций, индуцированных земляники экстрактом в клетках костного мозга мышей;
• Учет доминантных летальных мутаций, индуцированных земляники экстрактом в зародышевых клетках мышей;
• Изучение способности земляники экстракта индуцировать генные мутации на индикаторных бактериях в тесте Эймса Salmonella/микросомы.
Учет хромосомных аберраций, индуцированных земляникой экстрактом сухим в клетках костного мозга мышей.
В основе метода лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках на стадии метафазы. Клетки костного мозга характеризуются высоким уровнем митотической активности. Частота клеток с аберрациями хромосом составляет менее 1% (спонтанный уровень). Для получения хромосомных препаратов на стадии метафазы использован метод Ford, Hamerton в модификации А.Н. Малашенко и др..
Исследуемый экстракт вводили мышам однократно внутрижелудочно по «0,5 мл 12% водной суспензии в дозе 3000 мг/кг («1/2 от ЛД50 мышей при данном способе введения). Животные контрольной группы получали внутрижелудочно воду (по «0,5 мл на животное). На каждый опытный и контрольный варианты брали по 5 самцов рандомбредных белых мышей с массой тела 19-21 г. Анализ клеток костного мозга производили через 6, 24 и 48 часов после введения препарата.
За 2-2,5 часа до забоя для накопления метафаз мышам внутрибрюшинно вводили колхицин (0,025% рабочий раствор) по 0,01 мл/г массы животного. Костный мозг из бедренных костей только что забитых мышей быстро вымывали в центрифужную пробирку одним миллилитром гипотонического (0,555%) раствора KCl.
Пробирки помещали в термостатируемую водяную баню на 10 минут, центрифугировали в течение 5 минут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость осторожно сливали, наслаивали 1 мл свежеприготовленного фиксатора (3 части метанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты). Объем фиксатора доводили до 1-1,5 мл и помещали на 10 мин. в холодильник, затем, не взбалтывая осадок, фиксатор сливали, добавляли
новую порцию холодного фиксатора того же объема и выдерживали пробирки в холодильнике 20 минут. Затем вновь фиксатор сливали, осадок разбивали ударами пальца о пробирку, добавляли 1,5-2 мл нового фиксатора и оставляли в холодильнике до следующего дня. Затем пробирки центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин., фиксатор сливали, осадок разбивали и добавляли 0,5 мл фиксатора. Полученную суспензию раскапывали на чистые влажные охлажденные предметные стекла, которые высушивали над пламенем спиртовой горелки. Препараты окрашивали азур-эозином по Романовскому.
Учет доминантных летальных мутаций, индуцированных земляники экстрактом сухим в зародышевых клетках мышей.
Доминантные летальные мутации -генетические изменения, индуцированные в родительских зародышевых клетках и приводящие к гибели первое поколение на эмбриональных стадиях развития. Для оценки мутагенных свойств лекарственных препаратов учитывают постимплантационную смертность.
Для каждого варианта опыта и контроля (понедельного) использовали белых беспородных мышей приблизительно одного срока рождения, то есть от одного привоза из питомника. Самок в течение 2-3 недель после привоза не брали в опыт для исключения неконтролируемых
беременностей. Каждая группа самцов, обрабатываемых препаратом, была увеличена на 3 животных для использования их в случае непредусмотренной гибели в ходе опыта.
Для выявления возможного эффекта экстракт вводили мышам однократно внутрижелудочно в дозе 3000 мг/кг (« 'Л от ЛД50 для животных данного вида) в объеме 0,5 мл воды. Мышам контрольной группы перорально вводили по 0,5 мл воды. На каждый опытный и контрольный варианты брали по 15 самцов и 45 самок (по 3 самки на одного самца) рандомбредных белых мышей с массой тела 20-21 г. Подсадки самок проводили еженедельно в течение 5 недель. Эмбриональная смертность плодов у самок, забеременевших в первую неделю после введения химического вещества, свидетельствует о мутационных событиях, произошедших в зрелых спермиях, во 2-ю неделю - в поздних сперматидах, в 3-ю неделю - в ранних
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
сперматидах, в 4-ю неделю в поздних сперматоцитах, в 5-ю неделю - в ранних сперматоцитах.
Отсаженных от самцов самок вскрывали на 15-17 день беременности. Большая часть доминантных леталей вызывает смерть эмбрионов при или вскоре после имплантации. Погибшие на этой стадии мертвые эмбрионы выглядят как темные гомогенные округлые тела диаметром 2,5-3,0 мм. При вскрытии регистрировали количество живых и мертвых эмбрионов у каждой самки отдельно.
Изучение способности земляники экстракта земляники садовой листьев индуцировать генные мутации на индикаторных бактериях в тесте Эймса Salmonella/микросомы.
Изучение способности земляники экстракта индуцировать генные мутации на индикаторных бактериях в тесте Эймса Salmonella/микросомы.
Сущность метода Эймса заключается в регистрации способности испытуемого соединения и/или его метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных микроорганизмов в системе метаболической активности in vitro. Индикаторные бактерии вместе исследуемым препаратом,
постмитохондриальным супернатантом
гомогената печени крысы (фракция - S-9) кофакторами (НАДФ, глюкозо-6-фосфат) вносят в слой верхнего полужидкого агара на чашки Петри. Под влиянием ферментов микросомального окисления, содержащихся во фракции S-9, препарат может подвергаться процессу биотрансформации с образованием ряда метаболитов. Как исходное вещество, так и его метаболиты, если они обладают мутагенной активностью, индуцируют мутации у микроорганизмов.
В проведенных экспериментах были использованы индикаторные штаммы Salmonella typhimurium TA97, TA98 и TA100, предложенные Эймсом и сотрудниками.
Наличие мутагенного эффекта у исследуемого земляники экстракта учитывали по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Индукцию ферментов микросомального окисления осуществляли с помощью предварительного введения крысам смеси полихлорированных бифенилов отечественного производства - совола однократно в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно за 5 суток до забоя.
Полную микросомальную активирующую смесь (ПМАС) готовили таким образом, чтобы в 1 мл смеси содержалось 6 мг белка фракции S-9, 4 мМ глюкозо-6-фосфата, 33 мМ KCl, 8 мМ MgCh 0,2 М фосфатного буфера рН 7,4 до 1 мл. В случае составления неполной активирующей смеси (НМАС) вместо кофактора добавляли соответствующее количество растворителя кофакторов.
Результаты и обсуждение. Изучение влияния земляники экстракта сухого на гуморальное звено иммунитета.
Земляники садовой экстракт сухой вводили мышам (самцы, масса тела 19-21 г) линии CBA/Lac в желудок в течение 10 дней в дозах 6 и 60 мг/кг, максимальная из которых являлась 1/100 от ЛД50 для мышей при введении в желудок. Контролем служили животные, получавшие эквивалентные объемы воды. Число животных в группе равнялось 10. На 5-е сутки животных забивали и в суспензии клеток селезенки определяли АОК, а в сыворотке крови - титр гемагглютининов.
Таблица 1
Влияние земляники садовой листьев экстракта сухого на гуморальный иммунный ответ мышей линии CBA/Lac при 10-дневном внурижелудочном введении
Группы животных Показатели иммунного ответа
Количество АОК на одну селезенку Обратный титр гемагглютининов
¡.Контроль, вода 18450±860 14,2±1
П.Земляники садовой экстракт, 6 мг/кг 20040±480 16,4±0,9
Ш.Земляники садовой экстракт, 60 мг/кг 22350±920* 20,1±1,2*
* Достоверность различий с контролем (*P<0,05)
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
Table 1
The effect of strawberry leaves of dry extract on the humoral immune response of CBA/Lac mice with
10-day intragastric administration
Animal groups Immune response indicators
Number of AOCS per spleen Reverse titer of hemagglutinins
I. Control, water 18450±860 14,2±1
II. Strawberry garden extract, 6 mg/kg 20040±480 16,4±0,9
III. Strawberry garden extract, 60 mg/kg 22350±920* 20,1±1,2*
* Reliability of differences with control (*P<0,05)
Как видно из таблицы 1, исследуемый экстракт в дозе 60 мг/кг статистически значимо увеличивал количество АОК в селезенке и титр гемагглютининов в сыворотке крови мышей по сравнению с контролем, что свидетельствует о стимулирующем действии экстракта в указанной дозе на гуморальный иммунитет.
Изучение влияния земляники экстракта сухого на клеточное звено иммунитета.
Мышам I группы за сутки до иммунизации ЭБ (день «-1») внутрибрюшинно вводили земляники экстракт сухой в дозе 60 мг/кг. Мышам II группы экстракт вводили внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг через 1 час после иммунизации ЭБ (день «0»). Животным III группы экстракт в дозе 60 мг/кг вводили
внутрибрюшинно через 24 часа после инъекции антитела (ЭБ, день «+1»). Контрольные мыши (IV группа) получали внутрибрюшинно в день «+1» соответствующие количества 0,85% №С1. На 5-е сутки после иммунизации все животные получали субплантарно в левую заднюю лапу разрешающую инъекцию ЭБ в дозе 1*108 клеток на мышь в объеме 50 мкл (опытная лапа). В подушечку контралатеральной лапы
(контрольная лапа) вводили 50 мкл 0,85% раствора №С1. Результаты реакции регистрировали через 24 часа путем взвешивания «контрольной» и «опытной» лап. Различие в массе «опытной» и «контрольной» лап характеризовало величину отека и интенсивность реакции ГЗТ. Результаты эксперимента представлены в таблице 2.
Таблица 2
Индекс реакции ГЗТ мышей линии CBA/Lac, получавших земляники садовой листьев экстракт
сухой
Группы животных Индекс реакции
1.Земляники садовой экстракт, 60 мг/кг, день «-1» 40,3±5,4
П.Земляники садовой экстракт, 60 мг/кг, день «0» 49,3±4,8
III. Земляники садовой экстракт, 60 мг/кг, день «+1» 46,8±3,6
^.Контроль, 0,85% NaCl, день «+1» 40,03±3,9
Table 2
HRT reaction index of CBA/Lac mice treated with strawberry garden leaf extract dry
Animal groups Reaction index
I. Strawberry garden extract, 60 mg/kg, day «-1» 40,3±5,4
II. Strawberry garden extract, 60 mg/kg, day «0» 49,3±4,8
III. Strawberry garden extract, 60 mg/kg, day «+1» 46,8±3,6
IV. Control, 0,85% NaCl, day «+1» 40,03±3,9
Анализ данных, представленных в таблице 2, свидетельствует о том, что земляники садовой экстракт сухой в испытанной дозе 60 мг/кг не влияет на формирование реакции ГЗТ у
мышей и соответственно на клеточный иммунитет.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что земляники экстракт сухой оказывает стимулирующее действие на
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
гуморальное звено иммунитета в условиях длительного введения в желудок мышам линии CBA/Lac в дозе 60 мг/кг. Исследуемый экстракт не оказывает влияния на клеточное звено иммунитета.
Изучение мутагенной активности земляники экстракта сухого.
Во всех группах анализировали 500 метафаз. Для анализа отбирали метафазные пластинки правильной формы, с хорошим разбросом хромосом и модальным числом 40.
Каждую метафазную пластинку анализировали на наличие в ней следующих хромосомных аберраций: фрагментов и обменов. Ахроматические «повреждения» (пробелы) учитывали отдельно, не включая в общее число аберраций. Статистическую оценку результатов всех тестов проводили путем сравнения между опытными и контрольными сериями по критерию Стьюдента. Результаты подсчета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей приведены в таблице 3.
Таблица 3
Структурные нарушения хромосом в клетках костного мозга мышей (500 клеток в группе) после введения земляники садовой листьев экстракта сухого
Группы Экспозиция, Количество метафаз с аберрациями Степень
животных часы Одиночные Парные Обмены мутагенного
фрагменты фрагменты эффекта,
абс. % абс. % абс. % баллы
Контроль, - 2 0,4 l 0,2 - - -
вода
Земляники б l 0,2 l 0,2 - - 0
садовой 24 - - - - 2 0,4 0
экстракт, З000 мг/кг 48 l 0,2 - - - - 0
Table3
Structural abnormalities of chromosomes in the bone marrow cells of mice (500 cells in the group) after the introduction of strawberry garden leaf extract dry
Animal groups Exposure, Number of metaphases with aberrations Degree of
hours Single fragments Paired fragments Exchanges mutagenic
abs. % abs. % abs. % effect, points
Control, water - 2 0,4 l 0,2 - - -
Strawberry б l 0,2 l 0,2 - - 0
garden extract, 24 - - - - 2 0,4 0
З000 mg/kg 48 l 0,2 - - - - 0
Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о том, что исследуемый земляники экстракт сухой в изученной дозе 3000 мг/кг не проявляет мутагенной активности в тесте по учету аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей.
Учет доминантных летальных мутаций, индуцированных земляники экстрактом сухим в зародышевых клетках мышей.
В итоговую таблицу вносили данные по каждой серии экспериментов (за серию принимали группу самцов, обработанных
определенной дозой земляники экстракта на данной стадии сперматогенеза), включая число беременных самок и процент фертильности. Основным показателем уровня доминантных летальных мутаций служил уровень постимплантационных потерь: A=d/l+d; где d -число мертвых эмбрионов; 1 - число живых эмбрионов. Для оценки значимости увеличения этого показателя в опыте по сравнению с контролем использовали для соотношения сумм живых и мертвых эмбрионов. В связи с тем, что при таком подходе будет игнорироваться индивидуальная чувствительность мышей, для
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
снижения доли ложно-позитивных результатов решение о наличии мутагенного эффекта принимали на 1% уровне значимости. В основу заключения о степени мутагенной активности
были положены данные постимплантационной смертности на самой чувствительной стадии сперматогенеза. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.
Таблица 4
Результаты изучения способности земляники садовой листьев экстракта сухого индуцировать доминантные летальные мутации в зародышевых клетках мышей
Стадия сперматогенеза Доза, мг/кг Число беременных самок Фертильн ость,% Постимплантационн ая гибель, % X2 Степень эффекта, баллы
Зрелые спермии 0 38 84,4 2,7 - -
3000 40 88,9 5,5 2,047 0
Поздние сперматиды 0 37 82,2 5,1 - -
3000 36 80,0 3,8 0,411 0
Ранние сперматиды 0 34 75,6 4,9 - -
3000 36 80,0 4,4 0,041 0
Поздние сперматоциты 0 38 84,4 3,0 - -
3000 40 88,9 5,7 1,787 0
Ранние сперматоциты 0 36 80,0 5,3 - -
3000 35 77,8 3,7 1,012 0
Table 4
The results of the study of the ability of strawberry garden leaves of dry extract to induce dominant
lethal mutations in the germ cells of mice
Stage of Dose, Number of Fertility,0/« Post-implantation Degree of
spermatogenesis mg/kg pregnant death, % X2 effect,
females points
Mature sperm 0 38 84,4 2,7 - -
3000 40 88,9 5,5 2,047 0
Late spermatids 0 37 82,2 5,1 - -
3000 36 80,0 3,8 0,411 0
Early spermatids 0 34 75,6 4,9 - -
3000 36 80,0 4,4 0,041 0
Late spermatocytes 0 38 84,4 3,0 - -
3000 40 88,9 5,7 1,787 0
Early spermatocytes 0 36 80,0 5,3 - -
3000 35 77,8 3,7 1,012 0
Результаты проведенного эксперимента свидетельствует о том, что исследуемый земляники садовой экстракт сухой в изученной дозе 3000 мг/кг не проявляет мутагенной активности в тесте по учету аберраций хромосом в клетках костного мозга мышей.
Изучение способности земляники экстракта индуцировать генные мутации на индикаторных бактериях в тесте Эймса Salmonella/микросомы.
Исследуемый земляники садовой экстракт сухой растворяли в стерильной воде. Готовили стандартные концентрации препарата - 1,0; 10,0; 100,0; 1000,0; 10000,0 мкг/мл. Во всех случаях
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
растворы готовили с таким расчетом, чтобы при внесении в смесь 0,1 мл раствора концентрация препарата на чашку соответствовала бы необходимой по условиям опыта. Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бани при температуре 1000С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой 45-460С. Вначале в пробирки с агаром вносили 0,1 мл раствора стандартного мутагена в необходимых концентрациях или 0,1 мл ДМСО, затем 0,1 мл суспензии бактерий. После этого вносили 0,5 мл микросомальной активирующей смеси. Все добавки делались вне бани, затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара на чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и разлива полужидкого агара на чашки не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре 30-40 мин. и после полного застывания агара переносили в термостат на 370С. Учет результатов проводили через 48-72 часа инкубации. Параллельно в опыт включали результаты с ПМАС и НМАС. В вариантах с НМАС может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений,
эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний веществ в вариантах ПМАС и НМАС.
В контрольном варианте в слой верхнего полужидкого агара вместе с суспензией бактерий вносили ПМАС и НМАС соответствующий объем растворителя препарата. Эксперимент сопровождали положительными контролями. В качестве позитивных контролей использовали вещества, индуцирующие мутации
соответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации.
Для вариантов НМАС были использованы 2-нитрофлуорен (2-НФ) для штамма ТА 98, азид № - для штамма ТА 100 и 9-аминоакридин (9-АА) - для штамма ТА 97. Активность фракции S-9 контролировали, используя параллельно в вариантах с ПМАС и НМАС 2-аминоантрацен. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 3 чашки. Эксперимент повторялся дважды. Результаты учитывали при наличии мутагенного эффекта во всех вариантах позитивного контроля.
Результаты экспериментов представлены в таблицах 5 и 6. Обработку результатов проводили с помощью метода множественных сравнений Даннета.
Таблица 5
Действие земляники садовой листьев экстракта сухого на индикаторные штаммы бактерий в
тесте Эймса SalmoneПa/микросомы (опыт 1)
Штамм, Препарат Доза Среднее геометр. числа Кратность Степень
вариант препарата, мкг/чашку ревертантов на чашку превышения мутагенного эффекта, баллы
ТА 97 Вода 0 72 1,00 0
НМАС Земляники 0,1 80 1,06 0
садовой 1,0 72 1,00 0
экстракт 10,0 74 1,03 0
100,0 69 0,94 0
1000,0 66 0,91 0
2-АА 5,0 83 1,10 0
9-АА 10,0 1480 20,55 2
ТА 97 Вода 0 75 1,00 0
ПМАС Земляники 0,1 79 1,05 0
садовой 1,0 91 1,13 0
экстракт 10,0 85 1,06 0
100,0 76 0,98 0
1000,0 70 0,87 0
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
2-АА 5,0 970 13,00 2
ТА 98 НМАС Вода 0 30 1,00 0
Земляники садовой экстракт 0,1 33 1,09 0
1,0 32 1,06 0
10,0 31 1,03 0
100,0 25 0,86 0
1000,0 23 0,79 0
2-АА 5,0 33 1,06 0
2-НФ 5,0 1230 41,00 2
ТА 98 ПМАС Вода 0 36 1,00 0
Земляники садовой экстракт 0,1 39 1,05 0
1,0 36 1,00 0
10,0 36 1,00 0
100,0 33 0,91 0
1000,0 30 0,85 0
2-АА 5,0 1640 45,51 0
ТА 100 НМАС Вода 0 110 1,00 0
Земляники Садовой экстракт 0,1 119 1,08 0
1,0 121 1,10 0
10,0 129 1,16 0
100,0 103 0,92 0
1000,0 110 1,00 0
2-АА 5,0 123 1,11 0
Азид № 5,0 1720 15,63 2
ТА 100 ПМАС Вода 0 121 1,00 0
Земляники садовой экстракт 0,1 131 1,07 0
1,0 113 0,92 0
10,0 105 0,86 0
100,0 114 0,92 0
1000,0 105 0,86 0
2-АА 5,0 1920 15,86 2
Table 5
The effect of strawberry leaves of dry extract on indicator strains of bacteria in the Ames Salmonella
test/microsomes (experiment 1)
Strain, variant Medication Dose of the drug, mcg/cup Geometric mean of the number of revertants per cup Multiplicity of excess Degree of mutagenic effect, points
TA 97 NMAS Water 0 72 1,00 0
Strawberry garden extract 0,1 80 1,06 0
1,0 72 1,00 0
10,0 74 1,03 0
100,0 69 0,94 0
1000,0 66 0,91 0
2-AA 5,0 83 1,10 0
9-AA 10,0 1480 20,55 2
TA 97 PMAS Water 0 75 1,00 0
Strawberry garden extract 0,1 79 1,05 0
1,0 91 1,13 0
10,0 85 1,06 0
100,0 76 0,98 0
1000,0 70 0,87 0
2-AA 5,0 970 13,00 2
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
TA 98 NMAS Water 0 30 1,00 0
Strawberry garden extract 0,1 33 1,09 0
1,0 32 1,06 0
10,0 31 1,03 0
100,0 25 0,86 0
1000,0 23 0,79 0
2-АА 5,0 33 1,06 0
2-НФ 5,0 1230 41,00 2
TA 98 PMAS Вода 0 36 1,00 0
Strawberry garden extract 0,1 39 1,05 0
1,0 36 1,00 0
10,0 36 1,00 0
100,0 33 0,91 0
1000,0 30 0,85 0
2-АА 5,0 1640 45,51 0
TA 100 NMAS Water 0 110 1,00 0
Strawberry garden extract 0,1 119 1,08 0
1,0 121 1,10 0
10,0 129 1,16 0
100,0 103 0,92 0
1000,0 110 1,00 0
2-АА 5,0 123 1,11 0
Azide Na 5,0 1720 15,63 2
TA 100 PMAS Water 0 121 1,00 0
Strawberry garden extract 0,1 131 1,07 0
1,0 113 0,92 0
10,0 105 0,86 0
100,0 114 0,92 0
1000,0 105 0,86 0
2-АА 5,0 1920 15,86 2
Таблица 6
Действие земляники садовой листьев экстракта сухого на индикаторные штаммы бактерий в
тесте Эймса SalmoneПa/микросомы (опыт 2)
Штамм, Препарат Доза пре- Среднее геометр. числа Кратность Степень
вариант парата,мкг/ча шку ревертантов на чашку превышения мутагенног о эффекта, баллы
ТА 97 Вода 0 80 1,00 0
НМАС Земляники 0,1 90 1,12 0
экстракт 1,0 93 1,16 0
10,0 82 1,01 0
100,0 79 0,98 0
1000,0 72 0,88 0
2-АА 5,0 94 1,16 0
9-АА 10,0 1100 13,58 2
ТА 97 Вода 0 88 1,00 0
ПМАС 0,1 96 1,08 0
Земляники 1,0 88 1,00 0
экстракт 10,0 80 0,91 0
100,0 82 0,92 0
1000,0 75 0,85 0
2-АА 5,0 1470 16,70 2
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
ТА 98 НМАС Вода 0 35 1,00 0
Земляники экстракт 0,1 42 1,20 0
1,0 41 1,19 0
10,0 35 1,00 0
100,0 29 0,82 0
1000,0 27 0,77 0
2-АА 5,0 42 1,20 0
2-НФ 5,0 2100 60,00 2
ТА 98 ПМАС Вода 0 38 1,00 0
Земляники экстракт 0,1 42 1,10 0
1,0 43 1,13 0
10,0 41 1,07 0
100,0 39 1,01 0
1000,0 35 0,92 0
2-АА 5,0 1800 42,85 2
ТА 100 НМАС Вода 0 122 1,00 0
Земляники экстракт 0,1 134 1,09 0
1,0 129 1,05 0
10,0 119 0,98 0
100,0 116 0,95 0
1000,0 101 0,82 0
2-АА 5,0 131 1,07 0
Азид № 5,0 1640 13,44 2
ТА 100 ПМАС Вода 0 129 1,00 0
Земляники экстракт 0,1 122 0,94 0
1,0 137 1,06 0
10,0 126 0,97 0
100,0 125 0,96 0
1000,0 115 0,89 0
2-АА 5,0 1830 14,18 2
Table 6
The effect of strawberry leaves of dry extract on indicator strains of bacteria in the Ames Salmonella
test/microsomes (experiment 2)
Strain, variant Medication Preparate dose, mcg/cup Geometric mean of the number of revertants per cup Multiplicity of excess Degree of mutagenic effect, points
TA 97 NMAS Water 0 80 1,00 0
Strawberry garden extract 0,1 90 1,12 0
1,0 93 1,16 0
10,0 82 1,01 0
100,0 79 0,98 0
1000,0 72 0,88 0
2-AA 5,0 94 1,16 0
9-AA 10,0 1100 13,58 2
TA 97 PMAS Water 0 88 1,00 0
Strawberry garden extract 0,1 96 1,08 0
1,0 88 1,00 0
10,0 80 0,91 0
100,0 82 0,92 0
1000,0 75 0,85 0
2-AA 5,0 1470 16,70 2
Water 0 35 1,00 0
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
TA 98 Strawberry 0,1 42 1,20 0
NMAS garden extract 1,0 41 1,19 0
10,0 35 1,00 0
100,0 29 0,82 0
1000,0 27 0,77 0
2-AA 5,0 42 1,20 0
2-H® 5,0 2100 60,00 2
TA 98 Water 0 38 1,00 0
PMAS Strawberry 0,1 42 1,10 0
garden extract 1,0 43 1,13 0
10,0 41 1,07 0
100,0 39 1,01 0
1000,0 35 0,92 0
2-AA 5,0 1800 42,85 2
TA 100 Water 0 122 1,00 0
NMAS Strawberry 0,1 134 1,09 0
garden extract 1,0 129 1,05 0
10,0 119 0,98 0
100,0 116 0,95 0
1000,0 101 0,82 0
2-AA 5,0 131 1,07 0
Azide Na 5,0 1640 13,44 2
TA 100 Water 0 129 1,00 0
PMAS Strawberry 0,1 122 0,94 0
garden extract 1,0 137 1,06 0
10,0 126 0,97 0
100,0 125 0,96 0
1000,0 115 0,89 0
2-AA 5,0 1830 14,18 2
Как показали результаты
экспериментов, земляники садовой экстракт сухой не вызывает точковых мутаций у бактерий в тесте Эймса.
Таким образом, проведенные исследования показывают, что земляники садовой листьев экстракт сухой не индуцирует генетические нарушения в соматических и зародышевых клетках млекопитающих в исследованных дозах. Экстракт не проявляет также мутагенной
активности на штаммах сальмонеллы, регистрирующих различные типы точковых мутаций. Все это может свидетельствовать об отсутствии у него иммунотоксического действия и перспективности дальнейших исследований по разработке и получению лекарственных средств с земляники садовой листьев экстрактом сухим, обладающих диуретической и противовоспалительной активностью.
Corresponding Author: Yaborova Olga Vladimirovna - candidate of pharmaceutical Sciences, associate Professor of the Department of pharmacognosy with a course in botany, PERM state pharmaceutical Academy,
Perm, Russian Federation
E-mail: [email protected]
Ответственный за переписку: Яборова Ольга Владимировна — кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакогнозии, ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России, г. Пермь, Российская Федерация
E-mail: [email protected]
Номер свидетельства: ЭЛ № ФС 77 — 76345 от 02.08.2019, выдан Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций, включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК при Министерстве образования
и науки Российской Федерации ---—
