CC BY
6Вестник Томского государственного университета. Химия. 2024. № 33. С. 129-144 Tomsk State University Journal of Chemistry, 2024, 33,129-144
Научная статья УДК 54.056
doi: 10.17223/24135542/33/12
Исследование химического состава и антибактериальной активности СО2 экстрактов Juniperus pseudosabina, Larix dahurica, Taxus cuspidata
Елена Григорьевна Шаповалова1, Наталья Юрьевна Селихова2, Дмитрий Александрович Федоришин3, Ксения Игоревна Казанцева4, Дарья Владимировна Хребтова5, Владимир Сергеевич Сидельников6, Ирина Александровна Курзина7
12• 3 4 5 6 7 Томский государственный университет, Томск, Россия 1 [email protected]
3 strix187@yandex. ru
4 xenia. caz@yandex. ru
5 [email protected] 6 sidelnikov.tsu@gmail. com
7 kurzina99@mail. ru
Аннотация. Методом сверхкритической флюидной экстракции получены экстракты хвойных растений Juniperus pseudosabina, Larix dahurica, Taxus cuspidata. Установлено, что наиболее обширную группу веществ в СО2-экстрак-тах всех трех растений составляют полифенолы: изофлавоноиды, флавоноиды и особенно флавоногликозиды, обладающие Р-витаминной активностью. CO2 экстракт Taxus cuspidata можно рассматривать как перспективную альтернативу ягодам Taxus в роли источника для производства отдельных таксанов, таких как паклитаксел и доцетаксел. Наличие в составе СО2 экстрактов таких групп соединений, как флавоноиды, изофлавоноиды, повышает их потенциал как источников биологически активных соединений, пригодных для использования в качестве компонентов биологически активных и кормовых добавок с иммуномоделирую-щими антиоксидантными свойствами.
Ключевые слова: сверхкритическая флюидная экстракция, С02-экстракция, антибактериальная активность, Juniperus pseudosabina, Larix dahurica, Taxus cuspidata
Для цитирования: Шаповалова Е.Г., Селихова Н.Ю., Федоришин Д.А., Казанцева К.И., Хребтова Д.В., Сидельников В.С., Курзина И.А. Исследование химического состава и антибактериальной активности СО2 экстрактов Juniperus pseudosabina, Larix dahurica, Taxus cuspidata // Вестник Томского государственного университета. Химия. 2024. № 33. С. 129-144. doi: 10.17223/24135542/33/12
© Е.Г. Шаповалова, Н.Ю. Селихова, Д.А. Федоришин и др., 2024
Original article
doi: 10.17223/24135542/33/12
Study of the chemical composition and antibacterial activity of CO2 extracts of Juniperuspseudosabina, Larix dahurica,
Taxus cuspidate
Elena G. Shapovalova1, Natalia Yu. Selikhova2, Dmitriy A. Fedorishin3, Ksenia I. Kazantseva4, Daria V. Khrebtova5, Vladimir S. Sidelnikov6,
Irina A. Kurzina7
12,3 4 5,6, 7 jomsk State University, Tomsk, Russia 1 [email protected]
3 strix187@yandex. ru
4 xenia. caz@yandex. ru
5 [email protected] 6 sidelnikov.tsu@gmail. com 7 kurzina99@mail. ru
Abstract. Extracts of coniferous plants Juniperus pseudosabina, Larix dahurica, Taxus cuspidata were obtained by supercritical fluid extraction method. In the present study, it was found that polyphenols: isoflavonoids and flavonoids, and especially fla-vonoglycosides, which have P-vitamin activity, constitute the most extensive group of substances in the CO2 extracts of all three plants. The CO2 extract of Taxus cuspidata can be considered as a promising alternative to Taxus berry in the role of a source for the production of individual taxanes, such as paclitaxel and docetaxel. The presence of such groups of compounds as flavanoids, isoflavanoids in the composition of CO2 extracts increases their potential as sources of biologically active compounds suitable for use as components of biologically active and feed additives with immunomodeling antioxidant properties.
Keywords: supercritical fluid extraction, CO2 extraction, antibacterial activity, Juniperus pseudosabina, Larix dahurica, Taxus cuspidata
For citation: Shapovalova, E.G., Selikhova, N.Y., Fedorishin, D.A., Kazantseva, K.I., Khrebtova, D.V., Sidelnikov, V.S., Kurzina, I.A. Study of the chemical composition and antibacterial activity of CO2 extracts of Juniperus pseudosabina, Larix dahurica, Taxus cuspidate. Vestnik Tomskogo gosudarstvennogo universiteta. Chimia - Tomsk State University Journal of Chemistry, 2024, 33, 129-144. doi: 10.17223/24135542/33/12
Введение
В сверхкритическом состоянии газы проявляют свойства жидкостей с чрезвычайно высокой растворяющей способностью и обладают свойствами газов, что обеспечивает высокий массообменный потенциал [1]. Достаточно часто в качестве экстрагента используют диоксид углерода, который в сверхкритическом состоянии позволяет выделить из растительного сырья достаточно широкий спектр биологически активных веществ (БАВ)
различного химического строения. Очень важно, что экстракцию с использованием сверхкритического диоксида углерода можно проводить при мягких условиях, что позволяет получать достаточно лабильные органические соединения высокой чистоты. Высокая растворяющая способность сверхкритического диоксида углерода дает возможность экстрагировать БАВ с широким диапазоном физико-химических свойств [2]. Также в ряде исследований описан и недостаток диоксида углерода в качестве экстрагента [3], так как СО2 имеет полярность, сравнимую с жидким пентаном, поэтому он подходит для солюбилизации липофильных соединений, таких как липиды и эфирные масла. Однако такой низкий индекс полярности делает CO2 малопригодным для экстракции полярных соединений. Для полного извлечения компонентов из растительного сырья практические подходы включают использование полярных сорастворителей.
Сверхкритическая флюидная экстракция (СКФЭ) обладает такими преимуществами над другими методами экстракции, как высокие показатели массообменного процесса, высокая селективность выделения отдельных компонентов, высокая степень экстрагирования и высокое качество получаемого продукта [4, 5]. В публикациях описано получение с помощью сверхкритической флюидной экстракции большого количества компонентов. Например, авторами [6] описан метод извлечения длинноцепочечных поли-изопреноидов из растительного сырья. Сверхкритическая экстракция с CO2 позволяет эффективно извлекать хлорофилл и Р-каротин из багульника [7]. Авторами [8] определен жирнокислотный состав масел морошки, полученный методом СКФЭ-СО2, с повышенной долей связанных жирных кислот при уменьшении доли свободных кислот и большим содержанием ненасыщенных жирных кислот. В статье [9] описан метод СКФЭ с использованием сверхкритического диоксида углерода с 5 и 10 % этанола в качестве сорас-творителя для полного извлечения тилирозида как основного флавоноид-ного соединения из цветков липы Tilia L.
Хвойные растения являются хорошим источником биологически активных веществ, которые проявляют антимикробную, антибактериальную активность. Показано наличие в растении лиственницы Гмелина Larix gmelinii представителей флавононов (нарингенин, эриодиктиол), дигидрофлавоно-лов (дигидрокемпферол, дигидрокверцетин), флавонолов (кемпферол, квер-цетин), флаван-3-ола ((+)-катехин), а также продуктов его конденсации -транс-астрингенин-3'-О-Р^-глюкопиранозида (до 25%) и стильбенов (рез-вератрола, астрингенина), смоляных и жирных кислот [10, 11]. Также известно о мембранопротекторном свойстве сока хвои тиса. Установлены высокая цитотоксичность и отсутствие избирательности по отношению к опухолевым клеткам [12]. Показано, что в водном настое можжевельника содержатся витамин С, витамин P, хлорофилл А, хлорофилл B, каротин и сумма флавоноидов. Среди флавоноидов найдены нарингенин, гигидро-кемпферол, мирицетин, дигидрокверцетин, кемферол, ларицитрин, кверцетин, 3-О-метилкверцетин, сирингетин, изокверцетин, рутин, изорамнетин [13]. В связи с этим целью настоящего исследования являются получение экс-
трактов из хвойных растений можжевельника ложноказацкого Juniperus pseudosabina, лиственницы даурской Larix dahurica, тиса остроконечного Taxus cuspidata, исследование их состава и антибактериальной активности.
Методы
1. Экстракция сверхкритическим СО2
Обработку растительного сырья проводили с использованием сверхкритической системы флюидной экстракции. Для процесса СКФ-экстракции были подобраны оптимальные параметры: давление углекислого газа 400 бар, температура +55°С в сочетании с добавкой 3,4% этанола в качестве полярного модификатора. Измельченное растительное сырье массой около 5,5 г загружали в однолитровый экстрактор, СКФЭ-СО2-экстракцию проводили при скорости подачи экстрагента 250 г/мин.
В данных условиях получены СКФ-экстракты хвои трех растений, представляющих научный интерес с точки зрения потенциально возможной биологической активности: тиса остроконечного, можжевельника ложноказац-кого и лиственницы даурской.
Для проведения пробоподготовки и определения качественного состава исследуемых образцов использованы следующие реактивы и материалы: ацетонитрил для градиентной хроматографии (Carlo Erba, Франция), 85%-ная муравьиная кислота (PanReac, США), 95%-ный этанол (ООО Кон-станта-ФАРМ, Россия), гексан (хч, АО Экос-1, Россия) деионизованная вода, очищенная с помощью системы Millipore Simplicity® UV, картриджи для твердофазной экстракции HF Bond Elut LRC-C18 (Agilent, USA).
2. ВЭЖХ
Исследование качественного состава проб проводили методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) с использованием хроматографа Agilent Infinity 1260, совмещенного с квадруполь-времяпролетным масс-спектрометром 6550 Q-TOF (Agilent, США).
Получение водных фракций. К 1 г экстракта добавляли 8 мл дистиллированной воды и 8 мл гексана. Встряхивали в делительной воронке в течение 2 мин, после чего водный слой отделяли, помещали в мерную колбу на 10 мл и доводили объем раствора до метки деионизованной водой. 100 мкл полученного раствора разбавляли в 10 раз 50%-ным водным раствором ацетонитрила.
Получение спиртовых фракций. К 2 г экстракта добавляли 20 мл этанола. Перемешивали в течение 2 мин, после чего весь объем экстракта пропускали через картридж С18, предварительно кондиционированный этиловым спиртом. Пробы высушивали в токе азота и растворяли в ацетонитриле до получения концентрации 100 мг/мл. 100 мкл полученного раствора разбавляли в 10 раз 50%-ным водным раствором ацетонитрила.
Хроматографическое разделение проводили в обращенно-фазовом режиме на колонке PerfectSil Target ODS-3 (5 мкм, 250 х 4,6 мм) в градиентном режиме элюирования. Использован масс-спектрометрический детектор с источником электрораспылительной ионизации в режиме детектирования
положительных и отрицательных ионов. В качестве подвижной фазы А использовали 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты в воде, подвижной фазы В - 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле. Программа градиента: 0,0-2,6 мин - 40% В; 2,6-20,0 мин увеличение 40-100% В; 20,024,0 мин - 100% В; 24,0-24,1 мин - уменьшение 100-40% В; 24,1-29,0 мин -40% В. Температура термостата колонки - +40 ± 0,8°С. Скорость потока -1 мл/мин. Объем инжекции 25 мкл для образцов лиственницы даурской и можжевельника ложноказацкого и 50 мкл для образца тиса остроконечного. Условия ионизации и масс-спектрометрического детектирования приведены в табл. 1.
Таблица 1
Условия ионизации и детектирования
Параметры Значения
Режим ионизации ESI(+) ESI(-)
Температура источника ионизации (газа), °С 250 250
Ток осушающего газа, л/мин 15 15
Давление газа-распылителя, psig 50 50
Температура газа-завесы, °С 250 250
Ток таза-завесы, л/мин 12 12
Напряжение на капилляре (VCap), В 4 500 -4 500
Напряжение сопла (Nozzle voltage), В 40 1 800
Диапазон сканирования m/z, Да от 50 до 1 500 от 50 до 1 500
Время детектирования, мин от 2,5 до 24,0 от 2,5 до 24,0
Обработку первичных данных, полученных в ходе ВЭЖХ-МС-анализа, проводили с использованием программного обеспечения MassHunter Workstation (Agilent). Идентификацию компонентов фракций проводили с использованием программного обеспечения для обработки и визуализации масс-спектрометрических данных MZmine 3 и открытой базы данных фотохимических веществ и их метаболитов PhytoHub.
3. Антибактериальная активность
Золотистый стафилококк занимает первое место по частоте возникновения вторичной инфекции ран. Этот микроорганизм обычно вызывает инфекции кожи, пневмонию, эндокардит и остеомиелит. Также золотистый стафилококк отличается крайне высокой устойчивостью и приспособляемостью к различным антибактериальным препаратам. Escherichia coli (E. coli) - это группа грамотрицательных бактерий, которые обитают в кишечнике здоровых людей. Однако некоторые штаммы могут вызывать инфекцию в пищеварительном тракте, мочевыводящих путях и во многих других частях тела. Антибиотики эффективны в лечении инфекций E.coli вне пищеварительного тракта и в лечении большинства кишечных инфекций, но они не применяются для лечения кишечных инфекций, вызванных одним штаммом этих бактерий.
Для изучения влияния образцов на грамположительную и грамотрица-тельную микрофлору в качестве тест-объектов использованы штаммы стафилококка золотистого (Staphylococcus aureus) и кишечной палочки (Escherichia coli) ATCC 25922 (American Type Culture Collection). Определение
антибактериальной активности осуществлялось стандартным луночно-диффузионным методом.
Среды для культивирования тест-объектов готовились согласно рекомендациям производителя. На каждую чашку Петри с 15 мл соответствующей плотной питательной среды осуществлялся посев штамма S. aureus или E. coli методом газона из чистой культуры. Затем в центре чашки с помощью стерильного пробочного сверла делалась лунка диаметром 7 мм на всю толщину слоя агара. В лунку вносилось 0,1 мл раствора образца. После инкубации измерялась зона подавления роста бактерий с точностью до 0,1 мм. Чем больше зона ингибирования роста бактерий, тем выше антибактериальная активность образца. Зоной ингибиции роста бактерий считалась зона полного подавления роста колоний. Однако при этом игнорировались единичные и очень мелкие колонии бактерий в зоне подавления.
Результаты
Результаты, полученные в ходе исследования методом ВЭЖХ-МС, показывают, что исследованные фракции СКФ-экстрактов содержат большое количество компонентов и значительно отличаются по составу. На рис. 1-3 представлены хроматограммы водорастворимых фракций, на рис. 4-6 -спирторастворимых.
Рис. 1. Наложение хроматограмм водорастворимой части СКФ-экстракта тиса остроконечного: ESI(-) - черный цвет, ESI(+) - синий цвет
Рис. 2. Наложение хроматограмм водорастворимой части СКФ-экстракта можжевельника ложноказацкого: ESI(-) - черный цвет, ESI(+) - синий цвет
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)
Рис. 3. Наложение хроматограмм водорастворимой части СКФ-экстракта лиственницы даурской: ESI(-) - черный цвет, ESI(+) - синий цвет
Рис.4. Наложение хроматограмм спирторастворимой части СКФ-экстракта тиса остроконечного: ESI(-) - черный цвет, ESI(+) - синий цвет
Рис. 5. Наложение хроматограмм спирторастворимой части СКФ-экстракта можжевельника ложноказацкого: ESI(-) - черный цвет, ESI(+) - синий цвет
Courts (%) vs. Acquisition Time (min)
Рис. 6. Наложение хроматограмм спирторастворимой части СКФ-экстракта лиственницы даурской: ESI(-) - черный цвет, ESI(+) - синий цвет
Отмечено, что большое количество соединений, входящих в состав исследованных образцов, детектируется в режиме положительной ионизации. При обработке полученных результатов также ориентировались на данные о составе экстрактов, полученных другими методами, приведенные в ряде научных статей [14-19). Перечень соединений, обнаруженных в различных фракциях исследуемых СКФ-экстрактов, приведен в сводных табл. 2, 3.
Таблица 2
Соединения, обнаруженные в водорастворимой части СКФ-экстрактов
№ RT, мин ESI m/z, Да Предполагаемые соединения Предполагаемая брутто-формула Taxus cuspidata Juniperus pseudosabina Larix dahurica
1 10,21 - 908,13 Hydroxychlorophyll isomer C55H71MgN4Ö +
2 11,66 - 635,11 Kaempferol acetyl-galactoside rhamnoside C29H32O16 +
3 11,73 - 417,12 Syringaresinol C22H26O8 + +
4 11,86 - 908,13 Hydroxychlorophyll isomer C55H71MgN4Ö +
5 12,59 - 625,15 Myricetin rutinoside C27H30O17 +
6 12,80 - 317,03 Dihydroxykaempferol C15H10O8 +
7 12,83 - 319,16 Myricetin C15H10O8 +
8 13,14 - 481,13 Methyl-epicatechin glucuronide C22H24O12 +
9 13,25 - 315,13 Isorhamnetin C16H12O7 +
10 13,62 - 373,12 Hydroxymatairesinol C20H22O7 +
11 13,98 - 505,15 Quercetin acetylgalactoside C23H22O13 +
12 14,25 - 429,08 Methylapigenin rhamnoside C22H22O9 +
13 15,21 - 787,11 Patuletin glucosyl-apiosyl-glucoside C33H40O22 +
14 15,47 - 609,16 Kaempferol diglucoside C27H30O16 +
15 15,84 - 431,10 Apigenin glucoside C21H20O10 +
16 16,13 - 696,16 Cyanidin malonyl-glucosyl-glucoside C24H23O14 +
17 16,22 - 711,14 Quercetin malonyl diglucoside C30H32O20 +
18 17,31 - 447,19 Kaempferol glucopyranoside C21H19O11 +
19 17,49 - 299,14 Sativanone C17H16O5 +
20 18,16 - 447,19 Hydroxyluteolin rhamnoside C21H20O11 +
21 18,18 - 301,00 Methoxy-trihydroxyisoflavanone C16H14O6 + +
22 20,56 - 301,00 Pentahydroxyisoflavone C15H10O7 +
23 21,96 - 305,15 Epigallocatechin C15H14O7 +
24 4,14 + 207,11 Dihydroxyphenyl Valerolactone C11H12O4 + +
25 6,64 + 301,12 Methoxy Trihydroxyisoflavanone C16H14O6 +
26 6,93 + 345,25 Cirsilineol C18H16O7 +
27 7,84 + 287,21 Luteolin C15H10O +
28 8,09 + 345,25 Anhydro-secoisolariciresinol C20H24O5 +
29 9,10 + 303,10 Methoxy -trihydroxyisoflavanone C20H40O2 +
30 9,53 + 475,13 Acetylgenistine C23H22O11 +
31 10,19 + 399,16 Sinapoylquinic acid C18H22O10 +
32 10,88 + 333,22 Glucogallin C13H16O10 +
33 10,98 + 459,22 Acetyldaidzin C23H22O10 +
34 11,70 + 301,23 Hydroxymelanettin C16H12O6 + +
35 12,73 + 303,24 Methoxy trihydroxyisoflavanone C16H14O6 +
Окончание табл. 2
№ RT, мин ESI m/z, Да Предполагаемые соединения Предполагаемая брутто-формула Taxus cuspidata Juniperus pseudosabina Larix dahurica
36 12,78 + 301,28 Kaempferide C16H12O6 +
37 13,54 + 581,17 Kaempferol xylosyl-glucoside C26H28O15 +
38 13,98 + 597,41 Eriocitrin C27H32O15 +
39 14,67 + 625,31 Isorhamnetin glucoside rhamnosid C28H32O16 +
40 14,68 + 459,25 Acetyldaidzin C23H22O10 +
41 14,82 + 321,20 Methylepigallocatechin C16H16O7 +
42 15,08 + 271,25 Hydroxydaidzein C15H10O5 +
43 15,94 + 285,34 Hydroxymelanettin C16H12O6 +
44 17,27 + 287,16 Dihydrobiochanin A C16H14O5 +
45 17,56 + 609,36 Methylquercetin dirhamnoside C28H32O15 +
46 18,76 + 827,47 Phosphatidylinositol C43H72O13P + +
47 20,03 + 473,44 Methylepigallocatechin gallate C23H20O11 +
Таблица 3
Соединения, обнаруженные в водорастворимой части СКФ экстрактов
№ RT, мин ESI m/z, Да Предполагаемые соединения Предполагаемая брутто-формула Taxus cuspidata Juniperus pseudosabina Larix dahurica
1 11,74 - 417,12 Syringaresinol C22H26O8 + +
2 12,64 - 431,10 Apigenin glucoside C26H28O14 +
3 12,77 - 317,03 Dihydroxykaempferol C15H10O8 + +
4 13,22 - 315,05 Isorhamnetin C16H12O7 +
5 13,68 - 579,02 Isorhoifolin C27H30O14 +
6 14,00 - 609,11 Xylosyl-glucuronide C26H26O17 +
7 14,09 - 811,39 Rhamnetin acetyldirhamnosyl galactoside C36H44O21 +
8 14,20 - 431,10 Flavonoid glucoside C26H28O14 +
9 14,25 - 299,06 Chrysoeriol C16H12O6 + +
10 14,51 - 696,16 Cyanidin (malonyl-glucosyl-glucoside) C30H33O19 +
11 14,58 - 317,03 Dihydroxykaempferol C15H10O8 +
12 14,78 - 711,17 Quercetin malonyldiglucoside C30H32O20 +
13 15,13 - 431,10 Flavonoid glucoside C26H28O14 +
14 16,10 - 481,10 Hydroxydelphinidin glucoside C21H21O13 +
15 17,25 - 447,08 Kaempferol glucopyranoside C21H19O11 +
16 17,28 - 447,19 Hydroxyluteolin rhamnoside C21H20O11 +
17 17,43 - 447,19 Kaempferol glucopyranoside isomer C21H19O11 +
18 17,56 - 299,14 Sativanone C17H16O5 +
19 18,68 - 626,31 Delphinidin glucosyl-glucoside C27H31O17 +
20 18,75 - 300,99 Pentahydroxyisoflavone C15H10O7 +
21 20,11 - 301,16 Pentahydroxyisoflavone isomer C15H10O7 +
22 20,36 - 303,02 Methoxy trihydroxy isoflavanone C16H14O6 +
23 20,93 - 624,31 Peonidin sophoroside C28H33O16 +
24 21,98 - 305,19 Epigallocatechin C15H14O7 +
Окончание табл. 3
№ RT, мин ESI m/z, Да Предполагаемые соединения Предполагаемая брутто-формула Taxus cuspidata Juniperus pseudosabina Larix dahurica
25 22,04 - 431,23 Apigenin glucoside C21H20O10 +
26 22,73 - 441,08 Catechin gallate C22H18O10 +
27 23,15 - 506,27 Delphinidin acetyl-glucoside C23H23O13 +
28 23,17 - 593,29 Apigenin diglucoside C26H28O14 +
29 23,32 - 310,26 Cyanidin diglucoside C27H31O16 +
30 4,38 + 207,11 Dihydroxyphenyl valerolactone C11H12O4 + +
31 5,21 + 712,39 Cyanidin malonyl-glucuronosylglucoside C30H31O20 +
32 6,45 + 301,12 Methoxy trihydroxyisoflavanone C16H14O6 +
33 6,50 + 475,25 Acetylgenistin C23H22O11 +
34 6,78 + 345,25 Cirsilineol C18H16O7 +
35 7,27 + 579,29 Isorhoifolin C27H30O14 +
36 7,46 + 682,38 Tetracetoxy(methylaminophen yl)propionyloxy taxadiene C38H51NO10 +
37 7,65 + 287,21 Luteolin C15H10O +
38 7,76 + 696,40 Taxagifine C37H44O13 +
39 7,93 + 345,25 Anhydro-secoisolariciresinol C20H24O5 +
40 8,70 + 554,31 10-Deacetylbaccatin C29H36O10 +
41 9,07 + 291,21 Epicatechin C15H14O6 +
42 9,58 + 475,13 Acetylgenistine C23H22O11 +
43 9,78 + 757,34 Kaempferol glucosyl-rhamnosyl-galactosid C33H40O20 +
44 10,08 + 303,10 Methoxy trihydroxyisoflavanone C20H40O2 +
45 10,19 + 399,16 Sinapoylquinic acid C18H22O10 +
46 10,23 + 459,25 Acetyldaidzin C23H22O10 + +
47 10,72 + 333,22 Glucogallin C13H16O10 +
48 11,69 + 832,37 Cephalomannine C45H53NO14 +
49 12,01 + 854,36 Taxol C47H51NO14 +
50 12,12 + 301,28 Hydroxymelanettin C16H12O6 +
51 12,84 + 303,24 Methoxy trihydroxyisoflavanone C16H14O6 +
52 12,86 + 301,28 Kaempferide C16H12O6 +
53 13,98 + 597,41 Eriocitrin C27H32O15 +
54 14,28 + 317,22 Methylquercetin C16H12O7 +
55 14,72 + 363,26 Secoisolariciresinol C20H26O6 +
56 14,80 + 321,15 Methylepigallocatechin C16H16O7 +
57 15,08 + 271,25 Hydroxydaidzein C15H10O5 +
58 15,16 + 581,16 Kaempferol xylosyl-glucoside C26H28O15 +
59 15,31 + 301,22 Sativanone C17H16O5 +
60 16,12 + 625,34 Isorhamnetin glucoside rhamnoside C28H32O16 +
61 16,14 + 481,24 Methyl epicatechin glucuronide C22H24O12 +
62 16,17 + 405,14 Oleoside methylester C17H24O11 +
63 16,82 + 747,32 Epigallocatechin-epicatechin-gallate ester C37H30O17 +
64 17,01 + 447,14 Apigenin glucuronide C21H18O11 +
65 18,79 + 827,47 Phosphatidylinositol C43H72O13P + +
С использованием метода ВЭЖХ-МС в составе исследуемых образцов экстрактов, полученных методом сверхкритической экстракции, обнаружено большое количество органических веществ, потенциально имеющих высокую ценность. Вследствие высокой экстрагирующей способности метода СКФЭ во всех исследованных экстрактах обнаружены как вещества, растворимые в воде, так и вещества, растворимые в этаноле.
Установлено, что в составе СКФ-экстрактов всех трех растений наиболее обширную группу веществ составляют полифенолы [20, 21]: изофлавоноиды и флавоноиды, а в особенности флавоногликозиды, обладающие P-витамин-ной активностью.
Экстракт лиственницы даурской содержит большее разнообразие флаво-ноидов как во фракции, реэкстрагированной водой, так и в спиртовой фракции. Следует предполагать, что метод СКФ-экстракции может быть предложен для эффективного извлечения большого количества ценных соединений из данного растения.
Извлечение из можжевельника ложноказацкого характеризуется меньшим разнообразием идентифицированных полифенолов. Предположительно, значительная часть СКФ-экстракта можжевельника может представлять собой вещества терпеновой группы, не образующие сигналов на масс-спектрах вследствие неспособности к ионизации под действием электрораспыления.
В составе спиртового раствора экстракта тиса остроконечного обнаружено большое количество флавоноидов, а также специфичные для вида Taxus вещества таксанового ряда: паклитаксел (таксол) [22], таксагифин и дезацетилбаккатин [23]. Эти вещества характеризуются крайне высокой токсичностью, особенно в отношении делящихся клеток. Поэтому СКФ-экс-тракт тиса остроконечного можно применять только после тщательной очистки от таксанов, например после водной реэкстракции. С другой стороны, СКФ-экстракт тиса остроконечного можно рассматривать как перспективную альтернативу тису ягодному в роли источника получения индивидуальных таксанов, например паклитаксела и доцетаксела - действующих веществ жизненно важных лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.
Была проведена оценка антибактериальной активности экстрактов. Для исследования взяты образцы водорастворимой части экстрактов можжевельника, лиственницы и тиса с концентрацией 100 мг/мл (табл. 4).
Таблица 4
Образцы, использованные для определения антибактериальной активности
№ Образец Концентрация, мг/мл
1 Larix gmelinii 100
2 Juniperus pseudosabina 100
3 Taxus cuspidata 100
В качестве отрицательного контроля использовался физиологический раствор. Все представленные на исследование образцы экстрактов проявили незначительную антибактериальную активность в отношении грамотрица-
тельной микрофлоры (Escherichia coli) (р < 0,05). В отношении грамполо-жительной микрофлоры (Staphylococcus aureus) активности не выявлено (отсутствуют зоны подавления). Контрольный образец также не проявил антибактериальной активности. Малый размер зон подавления роста может быть связан с незначительной активностью образцов и высокой устойчивостью тест-объекта (рис. 7).
Рис. 7. Уровень антибактериальной активности образцов в отношении грамотрицательной микрофлоры (E.coli): 1 - лиственница даурская, 2 - можжевельник, 3 - тис
Резистентность микроорганизмов к антибиотикам постоянно возрастает и меняется в различные годы. Это обусловливает особые требования к выбору антибиотика для проведения рациональной терапии ран и определяет необходимость постоянного мониторинга возбудителей инфекционных заболеваний и уточнения их чувствительности к антибактериальным препаратам.
Выводы
Методом сверхкритической флюидной экстракции получены экстракты Juniperus pseudosabina, Larix dahurica, Taxus cuspidata. Проведено исследование состава методом ВЭЖХ-МС. Установлено, что экстракт лиственницы даурской содержит большее разнообразие флавоноидов как во фракции, ре-экстрагированной водой, так и в спиртовой фракции. Метод СКФ-экстракции может быть предложен для эффективного извлечения большого количества ценных соединений из данного растения. СКФ-экстракт тиса остроконечного можно рассматривать как перспективную альтернативу тису ягодному в роли источника получения индивидуальных таксанов, например паклитак-села и доцетаксела. Присутствие в составе СКФ-экстрактов таких групп соединений, как флаваноиды, изофлаваноиды, повышает их потенциал как источников биологически активных соединений, пригодных для использования в качестве компонентов биологически активных и кормовых добавок, имеющих иммуномоделирующие антиоксидантные свойства.
Список источников
1. Егоров А.Г., Мазо А.Б., Максудов Р.Н., Тремасов Е.Н., Аляев В.А. Численное модели-
рование массопереноса при сверхкритической флюидной экстракции // Вестник Казанского технологического университета. 2010. № 9. С. 183-185.
2. Дадашев М.Н., Шелков Е.М., Короткий В.М. Термодинамические аспекты сверхкри-
тической флюидной экстракции // Химия и химическое производство. 2009. № 2. С. 64-67.
3. Diaz-Reinoso B., Moure A., Dominguez H., Parajo J.C. Supercritical CO2 extraction and
purification of compounds with antioxidant activity // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2006. Vol. 54. P. 2441-2469.
4. Aris N.A., Idrus N.F.M., Yian L.N., Idham Z., Syafiq M., Hazwan R., Yunus M.A.C.
The Effect of Fluid Flow Rate and Extraction Time in Supercritical Carbon Dioxide // Journal of Advanced Research in Applied Sciences and Engineering Technology. 2019. Vol. 16 (1). P. 26-34.
5. Herrero M., Castro-Puyana M., Mendiola J.A., Ibanez E. Compressed fluids for the extrac-
tion of bioactive compounds // Trends in Analytical Chemistry. 2013. Vol. 43. P. 67-83.
6. Jozwiak A., Brzozowski R., Bujnowski Z., Chojnacki T., Swiezewska E. Application of
supercritical CO2 for extraction of polyisoprenoid alcohols and their esters from plant tissues // Journal of Lipid Research. 2013. Vol. 54. P. 2023-2028.
7. Попова А.С. Исследование метода сверхкритической флюидной экстракции для вы-
деления биологически активных веществ багульника // Достижения вузовской науки: Химические науки. 2015. № 17. С. 132-141.
8. Ивахнов А. Д., Садкова К.С., Собашникова А.С., Скребец Т.Э., Богданов М.В. Получе-
ние масла из ягод морошки экстракцией сверхкритическим диоксидом углерода // Химия растительного сырья. 2019. № 2. С. 91-97.
9. Pieczykolan A., Pietrzak W., Roj E., Nowak R. Effects of Supercritical Carbon Dioxide
Extraction (SC-CO2) on the content of tiliroside in the extracts from Tilia L. flowers // Open Chemistry. 2019. Vol. 17. P. 302-312.
10. Макаренко С.П., Шмаков В.Н., Коненкина Т.А., Дударева Л.В., Константинов Ю.М. Жирнокислотный состав липидов каллусов двух видов лиственницы (Larix gmelinii и Larix sibirica // Химия растительного сырья. 2014. № 2. С. 121-127.
11. Неверова Н.А., Медведева Е.Н., Левчук А.А., Бабкин В.А. Исследование камеди лиственницы Гмелина (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) // Химия растительного сырья. 2017. № 2. С. 137-141.
12. Бушмелева К.Н., Теренжев Д.А., Шаронова Н.Л., Белов Т.Г., Любина А.П. Биологическая активность соков хвои некоторых растений порядка Сосновые (Pinales) // Бюллетень ГНБС. 2021. № 141. С. 64-70.
13. Матвеенко Е.В., Алёшина Е.Н., Величко Н.А. Состав настоев древесной зелени можжевельника сибирского // Вестник КрасГАУ. 2013. № 7. С. 257-259.
14. Lisa M., Holcapeka M., Rezanka T., Kabatovac N. High-performance liquid chromategra-phy-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry and gas chromatography-flame ionization detection characterization of A5-polyenoic fatty acids in triacylglycerols from conifer seed oils // Journal of Chromatography A. 2007. Vol. 1146. P. 67-77.
15. Fu T., Elie N., Brunelle A. Radial distribution of wood extractives in European larch Larix decidua by TOF-SIMS imaging // Phytochemistry. 2018. Vol. 150. P. 31-39.
16. Faggian M., Bernabe G., Ferrari S., Francescato S., Baratto G., Castagliuolo I., Dall'Acqua S., Peron G. Polyphenol-Rich Larix decidua Bark Extract with Antimicrobial Activity against Respiratory-Tract Pathogens: A Novel Bioactive Ingredient with Potential Pharmaceutical and Nutraceutical Applications // Antibiotics. 2021. Vol. 10 (7). Art. 579.
17. Baldan V., Sut S., Faggian M., Dalla Gassa E., Ferrari S., De Nadai G., Francescato S., Baratto G., Dall'Acqua S. Larix decidua Bark as a Source of Phytoconstituents: An LC-MS Study // Molecules. 2017. Vol. 22. Art. 1974.
18. Yang L.X. Allelopathic potential of root exudates of larch (Larix gmelini) on Manchurian walnut (Juglans mandshurica) // Allelopathy Journal. 2007. Vol. 20. P. 127-134.
19. Voronin K.S., Fenin A.A., Zhevlakova A.K., Zavadskii S.P., Selivanova I.A. Polyphenolic Profile of Larch Knotwood // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2021. Vol. 55. P. 781-786.
20. Tang J., Dunshea F.R., Suleria H.A.R. LC-ESI-QTOF/MS Characterization of Phenolic Compounds from Medicinal Plants (Hops and Juniper Berries) and Their Antioxidant Activity // Foods. 2019. Vol. 9 (1). doi: 10.3390/foods9010007
21. Tavares L., McDougall G.J., Fortalezas S., Stewart D., Ferreira R.B.; Santos C.N. The neuroprotective potential of phenolic-enriched fractions from four juniperus species found in Portugal // Food Chemistry. 2012. Vol. 135. P. 562-570.
22. Madhusudanan K.P., Chattopadhyay S.K., Tripathi V.K., Sashidhara K.V., Kukreja A.K., Jain S.P. LC-ESI-MS analysis of taxoids from the bark of Taxus wallichiana // Biomedical Chromatography. 2002. Vol. 16 (5). P. 343-355.
23. Shirshekanb M., Rezadoost H., Javanbakht M., Ghassempour A. The Combination Process for Preparative Separation and Purification of Paclitaxel and 10-Deacetylbaccatin III Using Diaion® Hp-20 Followed by Hydrophilic Interaction Based Solid Phase Extraction // Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 2014. Vol. 16. P. 1396-1404
References
1. Egorov A.G.; Mazo A.B.; Maksudov R.N.; Tremasov E.N.; Alev V. A. Numerical modeling
of mass transfer using a cryptographic system Numerical modeling of mass transfer during extraction with a supercritical liquid. Bulletin of the Kazan Technological University. 2010, No. 9, 183-185.
2. Dadashev M.N.; Shelkov E.M.; In Short.M. Thermodynamic aspects of supercritical fluid
extraction [thermodynamic aspects of supercritical fluid]. Chemistry and chemical production. 2009, 2, 64-67.
3. Diaz-Reynoso B., Moore A., Dominguez H., Parajo J. Supercritical CO2 extraction and
purification of compounds with antioxidant activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2006, 54, 2441-2469.
4. Aris, N.A.; Idrus, N.F.M.; Ian, L.N.; Idham, Z.; Syafik, M.; Hazvan, R.; Yunus, M.A.S.
Influence of liquid flow velocity and extraction time in supercritical carbon dioxide. Journal of Advanced Research in Applied Sciences and Engineering Technologies. 2019, 16(1), 26-34.
5. Herrero, M.; Castro-Puyana, M.; Mendiola, J.A.; Ibanez, E. Compressed liquids for the ex-
traction of biologically active compounds. Trends in analytical chemistry. 2013, 43, 67-83.
6. Jozwiak, A.; Brzozowski, R.; Buinowski, Z.; Hojnacki, T.; Swiss, E. The use of supercritical
CO2 for the extraction of polyisoprenoid alcohols and their esters from plant tissues. Journal of Lipid Research. 2013, 54, 2023-2028.
7. Popova A.S. Investigation of the method of supercritical fluid extraction for the isolation
of biologically active substances of bagulica [study of supercritical extraction of liquid for the isolation of biologically active substances of bagulica]. Achievements of University Science: Chemical Sciences. 2015, 17, 132-141.
8. Ivakhnov A.D.; K Sadkova.S.; Sobashnikova A.S.; Skrebets T.E.; Bogdanov M.V. Obtain-
ing oil from cloudberries by extraction with supercritical carbon dioxide [obtaining oil from cloudberries by extraction with supercritical carbon dioxide]. Chemistry of Vegetable Raw Materials. 2019, 2, 91-97.
9. Pechikolan, A.; Pietshak, V.; Roy, E.; Novak, R. The effect of supercritical extraction with
carbon dioxide (SC-CO2) on the content of tiliroside in extracts from Tilia L. flowers. Open Chemistry. 2019, 17, 302-312.
10. Makarenko S.P.; Shemakov V.N.; Konenkina T.A.; Dudareva L.V.; Konstantinov V.M. Fatty acid composition of lipids in the calluses of two species (Larix gmelinii, Gmelinia
larch, Siberian larch) [Electronic resource species of larch (Larix gmelinii and Larix sibirica). Chemistry of Vegetable Raw Materials. 2014, 2, 121-127.
11. Novikova N.A., Shvedova E.N., Levchuk A.A., Babkin V.A. Study of stony foliage of Gmelin (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.) [Study of gum larch Gmelin (Larix gmelinii (Rupr.) Rupr.)]. Chemistry of Public Administration. 2017, 2, 137-141.
12. Bumeleva K.N., Terenzhev D.A., Sharonov N.L., Belov T.G., Lyubina A.P. Biological activity of a juicer of some plant origin. Biological activity of juices from the needles of some plants of the order Pine (Pinales)]. GNBSBulletin. 2021, 141, 64-70.
13. Matveenko E.V., Alina E.N., Velichko N.A. The composition of the infusion of woody greens of Siberian juniper. Plant Biology. Bulletin of KrasGAU. 2013, 7, 257-259.
14. Lissa, M.; Holchapeka, M.; Rzhezanka, T.; Kabatovac N. High-performance liquid chro-matography- mass spectrometry with chemical ionization at atmospheric pressure and gas chromatography -flame ionization to determine the characteristics of A5-polyene fatty acids in triacylglycerols from coniferous seed oils. Journal of Chromatography A. 2007, 1146, 67-77.
15. Fu T., Eli N., Brunelle A. Radial distribution of extractive substances of European larch Larix decidua wood according to TOF-SIMS data. Phytochemistry. 2018, 150, 31-39.
16. Fagian, M.; Bernabe, G.; Ferrari, S.; Francescato, S.; Baratto, G.; Castaluolo, I.; Dall'Aqua, S.; Peron, G. Polyphenol-rich decidual larch bark extract with antimicrobial activity against respiratory tract pathogens: A new biologically active ingredient with potential applications in pharmaceuticals and nutraceuticals. Antibiotics. 2021, 10 (7), 579.
17. Baldan V., Sut S., Fagian M., Dalla Gassa E., Ferrari S., De Naday G., Francescato S., Baratto G., Dall'Aqua S. Bark of deciduous trees as a source of phytocomponents: a study by the LC-MS method. Molecules. 2017, 22, 1974.
18. Yang, L.H. Allelopathic potential of root secretions of larch (Larix gmelini) on Manchurian walnut (Juglans mandshurica). Journal of Allelopathy. 2007, 20, 127-134.
19. Voronin K.S., Fenin A.A., Zhevlakova A.K., Zavadsky S.P., Selivanova I.A. Polyphenolic profile of larch wood. Journal of Pharmaceutical Chemistry. 2021, 55, 781-786.
20. Tang, J.; Danshi, F.R.; Suleria, H.A.R. Characterization of phenolic compounds of medicinal plants (hops and juniper berries) by LC-ESI-QTOF/MS method and their antioxidant activity. Food products. 2019, 9(1), 7.
21. Tavares L., McDougall G.J., Fortalezas S., Stewart D., Ferreira R.B., Santos K.N. Neuro-protective potential of phenol-enriched fractions of four juniper species native to Portugal. Food Chemistry. 2012, 135, 562-570.
22. Madhusudanan, K.P.; Chattopadhyay, S.K.; Tripathi, V.K.; Sashidhara, K.V.; Kukreja, A.K.; Jain, S.P. LC-ESI-MS analysis of taxoids from the bark of Taxus wallichiana. Biomedical Chromatography, 2002, 16(5), 343-355.
23. Shirshekanb, M.; Rezadust, H.; Javanbakht, M.; Ghassempour, A. Combined method of preparative separation and purification of paclitaxel and 10-deacetylbaccatin III using Diaion ® Hp-20 followed by solid-phase extraction based on hydrophilic interaction. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2014, 16, 1396-1404
Сведения об авторах:
Шаповалова Елена Григорьевна - кандидат технических наук, старший преподаватель Томского государственного университета (Томск, Россия). E-mail: [email protected] Селихова Наталья Юрьевна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник Томского государственного университета (Томск, Россия). E-mail: [email protected] Федоришин Дмитрий Александрович - ассистент Томского государственного университета (Томск, Россия). E-mail: [email protected]
Казанцева Ксения Игоревна - лаборант Томского государственного университета (Томск, Россия). E-mail: [email protected]
Хребтова Дарья Владимировна - младший научный сотрудник Томского государственного университета (Томск, Россия). E-mail: [email protected]
Сидельников Владимир Сергеевич - заведующий лабораторией Томского государственного университета (Томск, Россия). E-mail: [email protected] Курзина Ирина Александровна - доктор физико-математических наук, доцент, заведующая кафедрой природных соединений, фармацевтической и медицинской химии Томского государственного университета (Томск, Россия). E-mail: [email protected]
Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Information about the authors:
Shapovalova Elena G. - Candidate of Technical Sciences, Senior Lecturer, Tomsk State University (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]
Selikhova Natalia Yu. - Candidate of Chemical Sciences, Senior Researcher, Tomsk State University (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]
Fedorishin Dmitriy A. - Assistant, Tomsk State University (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]
Kazantseva Ksenia I. - Laboratory Assistant, Tomsk State University (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]
Khrebtova Daria V. - Junior Research Assistant, Tomsk State University (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]
Sidelnikov Vladimir S. - Head of the Laboratory, Tomsk State University (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]
Kurzina Irina A. - Doctor of Physical and Mathematical Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Natural Compounds, Pharmaceutical and Medicinal Chemistry, Tomsk State University (Tomsk, Russia). E-mail: [email protected]
Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts of interests.
Статья поступила в редакцию 26.01.2024; принята к публикации 16.04.2024 The article was submitted 26.01.2024; accepted for publication 16.04.2024
