CC BY
15
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
Научная статья УДК 579.66
DOI: https://doi.org/10.21285/2227-2925-2023-13-2-245-254 EDN: HIUHAE
Исследование характеристик роста штаммов-продуцентов молочной кислоты с использованием глюкозного сиропа в качестве источника углерода
А.А. Суханова, Н.Л. Ертилецкая^1, А.Н. Бояндин, С.Н. Сырцов, А.А. Середа, Ю.А. Прокопчук,
В.В. Бротт
Сибирский государственный университет науки и технологий им. М.Ф. Решетнева, г. Красноярск, Российская Федерация
Аннотация. В работе исследованы характеристики роста и продуктивности штаммов-продуцентов молочной кислоты Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 (ВКПМ В-2368), Lactobacillus acidophilus 5 Дс (ВКПМ В-2846) и Lactococcus lactis subsp. lactis (ВКМ В-1662) на стандартной среде MRS с использованием глюкозного сиропа в качестве углеродного субстрата. По результатам периодического культивирования выбранных штаммов в ферментерах объемом 5 л в течение 72 ч было установлено, что продуктивность снижается в ряду Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 > Lactobacillus acidophilus 5 Дс > Lactococcus lactis subsp. lactis. Максимальную продуктивность по молочной кислоте 1,94 г/(л*ч) показал L. delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 с соответствующей степенью конверсии глюкозы 87%. После культивирования отмечено незначительное снижение содержания азота, калия и натрия в культуральной жидкости исследуемых штаммов-продуцентов. Содержание остальных макроэлементов (фосфора, кальция, серы, магния, бария и железа) для всех штаммов повысилось пропорционально добавлению глюкозного сиропа в ходе культивирования, что непосредственно связано с их значительным содержанием в его составе. Штаммы Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 и Lactobacillus acidophilus 5 Дс продуцировали рацемическую (DL)-молочную кислоту, в то время как штамм Lactococcus lactis subsp. lactis продуцировал молочную кислоту с содержанием L-и-зомера 73%. Использование глюкозного сиропа в биотехнологических процессах может поспособствовать внедрению безотходного производства на соответствующих предприятиях.
Ключевые слова: молочнокислые бактерии, периодическое глубинное культивирование, молочная кислота, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactococcus lactis
Финансирование. Проект «Исследование механизмов биодеградации образцов изделий на основе полилак-тида для прогнозирования скорости биодеструкции упаковочных изделий и тары в различных климатических условиях», № 2022110309011 поддержан Красноярским краевым фондом науки.
Для цитирования: Суханова А.А., Ертилецкая Н.Л., Бояндин А.Н., Сырцов С.Н., Середа А.А., Прокопчук Ю.А., Бротт В.В. Исследование характеристик роста штаммов-продуцентов молочной кислоты с использованием глюкозного сиропа в качестве источника углерода // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2023. Т. 13. N 2. С. 245-254. https://doi.org/10.21285/2227-2925-2023-13-2-245-254. EDN: HIUHAE.
PHYSICOCHEMICAL BIOLOGY
Original article
Growth characteristics of lactic acid-producing strains using glucose syrup as a carbon source
Anna A. Sukhanova, Natalya L. Ertiletskaya®, Anatoly N. Boyandin, Sergey N. Syrtsov, Anna A. Sereda, Yulia A. Prokopchuk, Valeria V. Brott
Reshetnev Siberian State University of Science and Technology, Krasnoyarsk, Russian Federation
Abstract. This work investigates the growth and productivity characteristics of such lactic-acid producing strains, as Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 (VKPM B-2368), Lactobacillus acidophilus 5 Ds (VKPM B-2846) and Lactococcus lactis subsp. lactis (VKM B-1662) on standard MRS medium using glucose syrup as a carbon substrate. According to the results of batch cultivation of the selected strains in 5L fermenters for 72 h, the productivity was established to decrease in the Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 > Lactobacillus acidophilus 5 Ds > Lactococcus lactis subsp. lactis series. L. delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 showed the maximum lactic-acid productivity of 1.94 g/(l*h) with a glucose conversion degree of 87%. After cultivation, a
© Суханова А.А., Ертилецкая Н.Л., Бояндин А.Н., Сырцов С.Н., Середа А.А., Прокопчук Ю.А., Бротт В.В., 2023
slight decrease in the content of nitrogen, potassium and sodium in the culture liquid of the studied strains was observed. In all strains, the content of other macronutrients (phosphorus, calcium, sulphur, magnesium, barium and iron) increased in proportion to the addition of glucose syrup during cultivation, which is directly related to their significant content in its composition. The Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 and Lactobacillus acidophilus 5 Ds strains produced racemic (DL) lactic acid, whereas Lactococcus lactis subsp. lactis produced lactic acid with a 73% L-isomer content. The use of glucose syrup in biotechnological processes can contribute to the implementation of waste-free production in the respective enterprises.
Keywords: Lactic acid bacteria, batch submerged cultivation, lactic acid, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactococcus lactis
Funding. Project «Research of biodegradation mechanisms of polylactide samples for prediction of biodegradation rate of packaging materials in various climates», № 2022110309011 was supported by Krasnoyarsk Regional Fund of Science.
For citation: Sukhanova A.A., Ertiletskaya N.L., Boyandin A.N., Syrtsov S.N., Sereda A.A., Prokopchuk Yu.A., Brott V.V. Growth characteristics of lactic acid-producing strains using glucose syrup as a carbon source. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya = Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2023;13(2):245-254. (In Russian). https://doi.org/10.21285/2227-2925-2023-13-2-245-254. EDN: HIUHAE.
ВВЕДЕНИЕ
Молочная кислота (2-гидроксипропановая кислота) (МК) является важным сырьем пищевой (до 85%) и непищевой (до 15%) промышленности. В промышленных масштабах МК можно синтезировать двумя способами: химическим путем и микробной ферментацией. Второй способ наиболее предпочтителен и реализуем на производстве.
Среди продуцентов молочной кислоты выделяют бактериальные (в основном молочнокислые бактерии (МКБ) родов Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus и др.) и грибные штаммы (Rhizopus), некоторые виды дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe). Бактериальные продуценты молочной кислоты, или МКБ, отличаются тем, что имеют относительно короткую по сравнению с грибами лаг-фазу, благодаря чему продукция молочной кислоты начинается менее чем через 12 ч культивирования, а также имеют высокие показатели конверсии и меньшее время ферментации. Однако стоит учитывать необходимость строгого поддержания асептики при культивировании МКБ, т.к. бактериальные культуры чувствительны к контаминации. Анализ литературных данных показал, что из бактериальных продуцентов молочной кислоты выделяют такие виды, как Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. delbrueckii, L. paracasei, L. rhamnosus, а также Lactococcus lactis [1-3]. Производство молочной кислоты Lactobacillus основано на сбраживании ценных сахаросодержащих субстратов, что значительно отражается на себестоимости конечного продукта [4]. Среди субстратов выделяют глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, ксилозу, арабинозу, мелассу и различные гидролизаты [5-7]. Известно, что L. paracasei могут расти на питательных средах MRS, содержащих глюкозу, сахарозу и мелассу. Штамм Lactobacillus casei C-1 (B-5726) способен ферментировать лактозу, содержащуюся в молочной сыворотке [8]. Гетероферментные культуры Lactobacillus plantarum 1058 и L. bulgaricus 1332 способны использовать в качестве источников углерода простые сахара. Однако выход МК на среде с глюкозой в 1,4-2,3 раза больше, чем на средах с сахарозой, лактозой, мальтозой, ксилозой и арабинозой [9]. В случае использования комплексных субстратов (ги-
дролизатов, патоки, сиропов) выходы МК составляют от 30 до 50 г/л по разным источникам [6, 10]. Помимо редуцирующих веществ, в составе таких субстратов необходимо учитывать наличие примесей в виде макро- и микроэлементов, что также может повлиять на процесс ферментации и дальнейшую очистку молочной кислоты.
Кроме источника углерода, немаловажными факторами являются источники азота, рН, температура и способ культивирования, которые могут влиять на количество культуры и ее продуктивность. Среди азотсодержащих органических веществ выделяют растительные, животные, дрожжевые гидролизаты и экстракты - необходимые компоненты комплексных питательных сред для культивирования МКБ. Lactobacillus весьма требовательные к составу среды, наличию аминокислот, витаминов и других факторов роста, ограниченное количество которых способно снижать исходную активность бактерий.
Ввиду широкого круга сфер использования МК, особое значение имеет ее энантиомерная чистота и понимание соотношения L- и D-изомеров, что в дальнейшем определяет ее применение. В пищевой промышленности применение рацематов нежелательно из-за плохой усвояемости D-молочной кислоты организмом, а в полимерной промышленности использование рацемата затрудняет получение кристаллического полилактида [11, 12]. Соотношение изомеров в МК напрямую зависит от штамма-продуцента и обусловлено его ферментативной системой [13].
Целью данного исследования было сравнение продуктивности штаммов-продуцентов молочной кислоты Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 (ВКПМ В-2368), Lactobacillus acidophilus 5 Дс (ВКПМ В-2846) и Lactococcus lactis subsp. lactis (ВКМ В-1662) при периодическом глубинном культивировании с использованием глюкозного сиропа в качестве углеродного субстрата. Данный субстрат перспективен, т.к. является продуктом гидролиза растительного крахмалосодержащего сырья.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве объектов исследования проанализированы 3 штамма-продуцента молочной кислоты: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
19-11 (ВКПМ В-2368) (далее - L. delbrueckii), Lactobacillus acidophilus 5 Дс (ВКПМ В-2846) (далее -L. acidophilus) и Lactococcus lactis subsp. lactis (ВКМ В-1662) (далее - L. lactis). Штаммы L. delbrueckii и L. acidophilus 5 Дс приобретены во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Штамм L. lactis был предоставлен коллегами из Университета ИТМО. Для культивирования бактерий использовали стандартную питательную среду MRS [14] следующего состава: дрожжевой экстракт - 4 г/л, мясной экстракт/пептон - 10 г/л, гидролизат казеина
- 10 г/л, цитрат аммония (двузамещенный) - 2 г/л, ацетат натрия - 5 г/л, K2HPO4 - 2 г/л, MgSO4 х 7 H2O
- 0,20 г/л, MnSO4 х 4 H2O - 0,0 5 г/л, углеводы - 20 г/л. Готовую среду стерилизовали в паровом стерилизаторе ВК-75 (АО «Тюменский завод медицинского оборудования и инструментов», Россия) при 0,5 атм 30 мин.
В качестве источника углеводов использовали глю-козный сироп (ГС), получаемый из крахмала АО «Ами-носиб» (г. Ишим, Тюменская область, Россия). Входной контроль сырья включал определение декстрозного эквивалента ГС по методике, описанной в ГОСТ Р 50549931, и исследование элементного состава ГС с помощью эмиссионного спектрометра с индуктивно-связанной плазмой iCAP 6300 Duo (Thermo Scientific, США) согласно EPA. По данным производителя, ГС содержал сухого вещества от 30-32%, декстрозный эквивалент 95%, глюкозу 95%, высшие сахара макс. 5%.
Инокулят для каждого продуцента получали в асептических условиях из 3-х пробирок с рабочей культурой, выращенной на полужидкой среде MRS, и предварительно культивировали в колбах с 500 мл жидкой стерильной питательной среды MRS на шей-кере-инкубаторе ES-20 (Biosan, Латвия) в течение 12 ч. Полученный инокулят с концентрацией клеток порядка 107 КОЕ/л асептически переносили в ферментер объемом 5 л Sartorius Biostat Aplus (Biostat, Германия) с 2,8 л стерильной жидкой среды MRS. Концентрацию клеток определяли путем прямого подсчета клеток в камере Горяева 0,1 мл инокуля-та с последующими расчетами. Культивирование проводили в течение 72 ч при температуре 40 (для L. delbrueckii и L. acidophilus) или 32 °С (для L. lactis) и оборотах мешалки 150 об/мин. рН поддерживали на уровне 4,0-6,5 путем добавления карбоната кальция в качестве нейтрализующего агента в количестве 4% на этапе приготовления питательной среды для ферментера, а также добавлением его в процессе культивирования по мере необходимости. Для поддержания оптимальной концентрации глюкозы 20 г/л при ее снижении периодически добавляли ГС. Далее сразу после загрузки инокулята в ферментер и в дальнейшем через каждые 4 ч асептически проводили отбор проб культуральной жидкости для определения оптической плотности, концентрации клеток (через каждые 12 ч), концентрации глюкозы и молочной кислоты. По окончании культивирования определяли элементный состав культуральной жид-
кости, а также использовали ее для определения сте-реоизомера молочной кислоты.
Изменение биомассы клеток в процессе развития культуры регистрировали оптическими показателями культуры. 1 мл культуральной жидкости разводили 5 мл дистиллированной воды и перемешивали. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 440 нм против воды, определяя абсолютное значение по калибровочному графику2. Концентрацию глюкозы в культуральной жидкости устанавливали фотометрическим методом с использованием готового набора «Глюкоза ФКД» (ООО «Фармацевтика и клиническая диагностика», Россия) согласно инструкции. Концентрацию молочной кислоты определяли фотометрическим методом по методике, описанной Борщевской и др. [15]. Для калибровки использовали водные растворы молочной кислоты с известной концентрацией. Концентрацию биомассы определяли весовым методом, высушивая отмытые клетки навески при температуре 105 °С до постоянной массы.
Сравнительные показатели роста штаммов-продуцентов молочной кислоты определяли по следующим формулам:
1) продуктивность культуры за промежуток времени dt (в г/(лхч):
Yp = dP/dt , (1)
где dP - концентрация молочной кислоты (г/л) в момент времени t (в г/(лхч);
2) скорость потребления субстрата культурой в данный момент:
Ys = dS/dt , (2)
где dS - количество потребленной глюкозы в пересчете на объем культуральной среды (в г/л) в момент времени t;
3) степень конверсии субстрата (в %):
Cs = AS/AP х 100% , (3)
где AS и AP - потребление субстрата и продуктивность за все время культивирования соответственно.
Содержание микро- и макроэлементов в исходной питательной среде и конечных культуральных жидкостях определяли так же, как и для ГС. Для анализа пробы разводили в 100 раз и подкисляли соляной кислотой (ООО «Сигма Тэк», Россия) в соотношении 1:100. Калибровка прибора выполнена с использованием многоэлементных стандартов Merck (Германия) и Fluka (Швейцария), одноэлементных стандартов фосфора (CGP10) и магния (CGMG10) Inorganic ventures (США), а также CaO и Na2SO4 (ос.ч.). В качестве внутреннего стандарта использовали скандий (5 мг/л) (Fluka, Швейцария).
Соотношение L- и D-изомеров молочной кислоты в конечной культуральной жидкости определяли по
1 ГОСТ Р 50549-93. Продукты гидролиза крахмала. Определение восстанавливающей способности и эквивалента глюкозы. Метод постоянного титра Лейна и Эйнона. М.: Госстандарт России, 1993. 11 с.
2 Волова Т.Г., Шишацкая Е.И., Сински Э.Дж. Современные аппаратура и методы исследования биологических систем.
Большой практикум: учеб. пособие. Красноярск: Сиб. федер. ун-т, 2013.
модифицированной методике, описанной в [16], после дериватизации а-ментолом.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
По результатам культивирования 3-х штаммов-продуцентов молочной кислоты на ГС в ферментере объемом 5 л установлены различия в потреблении субстрата и продуктивности МКБ (табл. 1). Определенный декстрозный эквивалент использованного ГС составил 98,4%, что несколько превысило паспортные данные, также отмечено повышенное по сравнению с другими элементами содержание (от 0,5 до 2,5%) таких микроэлементов, как сера, натрий, фосфор, кальций, калий и магний (данные не приведены).
Исследования основных характеристик роста в лаг-фазе при культивировании штаммов-продуцентов показали, что у МКБ L. lactis она практически отсутствует по сравнению с L. delbrueckii и L. acidophilus. Стоит отметить, что при одинаковой скорости потребления субстрата в данной фазе продуктивность L. delbrueckii и L. аcidophilus различалась в 3,4 раза, что, скорее всего, связано со способностью L. delbrueckii быстрее адаптироваться к условиям культивирования.
При сравнении штаммов-продуцентов в экспоненциальной фазе отмечено, что для L. delbrueckii она составляет 12 ч и менее длительна, чем для других продуцентов. Максимальная скорость потребления субстрата зарегистрирована для L. acidophilus (5,77 г/(лхч)), тогда как у L. delbrueckii и L. lactis аналогичный показатель составил 3,53 и 2,31 г/(лхч) соответственно. По продукции МК L. acidophilus и L. delbrueckii были сопоставимы (5,80 г/(лхч)) и в 4 раза превышали данный показатель у L. lactis.
Длительность стационарной фазы L. lactis составила 52 ч, L. delbrueckii и L. acidophilus - 48 и 40 ч соответственно. Скорость потребления субстрата в данной фазе значительно снизилась, так же как и продуктивность МК, которая составила 1,07; 0,75 и 0,49 г/л соответственно для L. lactis, L. delbrueckii и L. аcidophilus.
По окончании культивирования общее потребление глюкозы за 72 ч для L. acidophilus составило 189,9 г/л, для L. delbrueckii - 151,7 г/л, для L. lactis - 64,7 г/л. Степень конверсии для данных продуцентов находилась в пределах от 67 до 87%. Несмотря на выход МК 51,6 г/л для L. lactis, что в 2,4 раза меньше других продуцентов, его степень конверсии была выше, чем у L. аcidophilus. Данный показатель может оказать определенное влияние при масштабировании процессов культивирования. Среди исследованных продуцентов максимальной производительностью обладает L. delbrueckii с выходом МК до 132 г/л.
При сравнении полученных данных с опубликованными исследованиями обнаружены различия в показателях. В работе Бочковой и др. [17] при молочнокислом брожении L. delbrueckii ВКПМ В-8744 на среды с концентрацией сахара 120-130 г/л общая продуктивность процесса составила 2,92-2,96 г/(лхч), выход молочной кислоты на стадии брожения -94-95%, коэффициент биоконверсии сахара - 0,96. Это в 1,5 раза выше, чем показатели Lactobacillus delbrueckii на ГС. Однако в работе Шавыркиной и др. (2021) при культивировании Lactobacillus delbruеckii subsp. bulgaricus 21В на нативном ферментативном водном гидролизате технической целлюлозы плодовых оболочек овса выход молочной кислоты составил 76,7%, что более чем на 10% меньше, чем при культивировании L. delbrueckii на глюкозном сиропе [18].
Полученные показатели роста L. acidophilus на ГС были несколько выше, чем в исследовании Шипо-вской и др. [2] при культивировании L. acidophilus на молочной сыворотке. Зарегистрированная скорость образования и выхода целевого продукта составили 0,78 г/(лхч) и 79,96% соответственно.
По данным исследования Илушки и соавторов [3], при сравнении штаммов МКБ L. lactis СН5, Lactobacillus helveticus B-4040 и L. delbrueckii Л 20 на стандартной MRS с глюкозой наиболее перспективным продуцентом МК стал штамм L. lactis СН5, про-
Таблица 1. Сравнительные показатели роста штаммов-продуцентов молочной кислоты Table 1. Comparative growth rates of lactic acid-producing strains
Наименование показателя Штаммы-продуценты
L. delbrueckii L. acidophilus L. lactis
Продолжительность лаг-фазы, ч 12 12 4
Скорость потребления субстрата в лаг-фазе, г/(лхч) 0,34 0,35 -
Продуктивность в лаг-фазе, г/(лхч) 1,31 0,38 -
Продолжительность экспоненциальной фазы, ч 12 20 20
Скорость потребления субстрата в экспоненциальной фазе, г/(лхч) 3,53 5,77 2,31
Продуктивность в экспоненциальной фазе, г/(лхч) 5,77 5,80 1,45
Продолжительность стационарной фазы, ч 48 40 52
Скорость потребления субстрата в стационарной фазе, г/(лхч) 2,39 1,98 0,39
Продуктивность в стационарной фазе, г/(лхч) 1,07 0,75 0,49
Потребление глюкозы, г/л 151,7 189,9 64,7
Концентрация биомассы, г/л 3,62 2,0 0,95
Выход молочной кислоты, г/л 132,0 127,3 51,6
Продуктивность, г/(лхч) 1,94 1,87 0,76
Степень конверсии, % 87,0 67,0 79,7
дуктивность которого оказалась в 2 раза выше, чем у использованных в работе лактобацилл, - до 90 г/л, при этом количество потребляемой глюкозы составило 115 г/л, что в принципе коррелирует с приведенными в данной статье показателями.
Для понимания влияния макро- и микроэлементов, содержащихся в среде и в ГС, используемом для подпитки, на рост МКБ были проанализированы образцы культуральной жидкости до и после культивирования (табл. 2).
По данным табл. 2, после 72 ч культивирования отмечено незначительное снижение содержания азота, калия и натрия в культуральной жидкости исследуемых штаммов-продуцентов. Содержание остальных макроэлементов (фосфора, кальция, серы, магния, бария и железа) для всех штаммов повысилось пропорционально добавлению ГС в ходе культивирования, что непосредственно связано с их значительным содержанием в составе ГС.
Увеличение кальция было обусловлено включением его значительного содержания в состав ГС и непосредственным внесением карбоната кальция во время культивирования для нейтрализации рН. Данные табл. 2 коррелируют с данными, представленными в табл. 1. Известно, что одна молекула Са2+ с молекулярной массой 40 г/л используется на нейтрализацию 2-х молекул МК (СН3-СНОН-СОО)2 с молекулярной массой 178 г/л. На примере L. delbrueckii количество кальция в культуральной жидкости по окончании ферментации составило порядка 20 г/л, тогда как МК должно быть не менее 89 г/л.
Результаты хроматографического анализа менти-ловых эфиров молочной кислоты, содержавшейся в культуральной жидкости исследованных штаммов, показаны на рисунке. Установлено, что L. delbrueckii производит рацемат молочной кислоты, доля L-изомера в котором варьировалась в пределах 44,92-48,75%. L. acidophilus также продуцирует рацемат молочной
Элемент Содержание в исходной среде, мг/л Содержание в культуральной жидкости после 72 ч культивирования, мг/л
L. delbrueckii L. acidophilus L. lactis
Азот общий 3495 2675 2550 2580
Натрий 1276,6 1223,1 1233,2 1235,2
Калий 1019,1 922,7 886,6 846,1
Фосфор 345,8 369,1 351,8 324,7
Кальций 200,2 19422,3 16362 8428,4
Сера 118,4 192,7 176,5 178,3
Магний 29,7 153,9 49,8 71,1
Марганец 12,6 17,4 12,6 12,7
Железо 3,9 9,8 3,9 1,2
Цинк 0,68 1,16 1,4 2,83
Бор 0,4 0,17 0,33 0,28
Алюминий 0,4 7,1 0,83 0,57
Индий 0,37 0,55 0,06 0
Мышьяк 0,22 0,45 0,34 0,06
Стронций 0,19 8,55 5,65 5,44
Титан 0,18 0,21 0,59 0
Селен 0,14 0,1 0,04 0
Медь 0,049 0 0,13 0,071
Никель 0,043 0 0 0
Барий 0,031 0,535 0,1 0,162
Кобальт 0,029 0,02 0,04 0,01
Хром 0,023 0,09 0,05 0,01
Ванадий 0,02 0 0,04 0,03
Свинец 0,01 0,09 0,02 0
Висмут 0,01 0 0 0,04
Литий 0,01 0,06 0,04 0,03
Галлий 0,002 0,01 0,03 0,01
Сурьма 0,002 0,061 0,08 0
Таблица 2. Изменение элементного состава культуральной жидкости после 72 ч ферментации 3-х штаммов молочнокислых бактерий на среде MRS
Table 2. Changes in the elemental composition of the culture liquid after 72 h of fermentation of 3 strains of lactic acid bacteria on MRS medium
кислоты с содержанием L-молочной кислоты в пределах 49,35-52,11%. В отличие от них L. lactis показал количественное преобладание доли L-молочной кислоты с примесью D-изомера 27%.
Из литературных источников известно, что L-изомер способны продуцировать МКБ родов Streptococcus,
^SOQOnc) ■HXKJLXMJ ЗГ5ООПОП ЗОООООО zrioonoo
лпппппп
ипппппп
c
Результаты хроматографического анализа ментиловых эфиров молочной кислоты, содержащихся в конечной культуральной жидкости Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 (а), Lactobacillus acidophilus 5 Дс (b) и Lactococcus lactis subsp. lactis (c)
Results of the chromatographic analysis of menthyl lactates contained in the final culture liquid of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 (a), Lactobacillus acidophilus 5 Ds (b) and Lactococcus lactis subsp. lactis (c)
Pediococcus, Lactococcus и Lactobacillus. D-изомер могут продуцировать только отдельные штаммы рода Lactobacillus [19], смесь 2-х стереоизомеров обычно продуцируется гомоферментативными бактериями. Среди кокковых форм рода Lactococcus молочную кислоту в D-конфигурации продуцируют виды Streptococcus cremoris, S. lactis, Lactobacillus bulgaricus, L. lactis, виды рода Pediococcus образуют МК в DL-конфигурации. Применение реконструктивных технологий позволяет получить виды бактерий, продуцирующие отдельные изомеры L- и D-молочной кислоты. У некоторых микроорганизмов, таких как Corynebacteriumglutamicum,Escherichiacoli и дрожжей Schizosaccharomyces pombe, отсутствует активность пируватформиатлиазы и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), и эти гены могут быть вставлены через генные источники L-/D-LDH из молочнокислых бактерий, крупного рогатого скота и грибов для экспрессии гена D(-)-LDH из молочнокислых бактерий с получением энантимер-ных изомеров в минимальной среде с оптической чистотой >99,9% [20]. Стоит отметить, что существует необходимость понимания количественного соотношения L- и D-изомеров МК, т.к. включения D-изоме-ров до 15% могут приводить к получению биоразлага-емых полимеров с полукристаллической структурой, а не рацемата [21].
По результатам данной работы установлено, что штаммы L. delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 и L. acidophilus 5 Дс обладают высокими показателями продуктивности по МК, однако продуцируют ее рацематы, что ограничивает сферы их использования в промышленности. Для получения биоразрушаемого полимера полилактида из исследуемых продуцентов наиболее предпочтителен Lactococcus lactis, т.к. он производит смесь молочной кислоты с более высоким содержанием L-изомера, в связи с его более высокой стереочистотой, что является важным показателем при производстве кристаллического полилактида.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По результатам периодического глубинного культивирования штаммов МКБ Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11 (ВКПМ В-2368), Lactobacillus acidophilus 5 Дс (ВКПМ В-2846) и Lactococcus lactis subsp. lactis (ВКМ В-1662) наиболее продуктивным из выбранных оказался штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 19-11, который позволяет получать до 1,94 г/(лхч) молочной кислоты с конечным ее выходом 132,0 г/л за 72 ч культивирования. Lactobacillus acidophilus 5 Дс и Lactococcus lactis subsp. lactis продемонстрировали продуктивность 1,87 и 0,76 г/(лхч) соответственно. Все исследованные штаммы продуцировали рацематы молочной кислоты.
a
b
СПИСОК
1. Solval K.M., Chouljenko A., Chotiko A., Sathivel S. Growth kinetics and lactic acid production of Lactobacillus plantarum NRRL B-4496, L. acidophilus NRRL B-4495, and L. reuteri B-14171 in media containing egg white hydrolysates // LWT. 2019. Vol. 105. P. 393-399. https://doi.org/10.1016/jJwt.2019.01.058.
2. Shipovskaya E.A., Eveleva V.V., Cherpalova T.M.
Biosynthetic activity study of Lactobacillus acidophilus lactic acid bacteria in the lactose fermentation of whey // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2019. T. 9. N 4. С. 635-642. https:// doi.org/10.21285/2227-2925-2019-9-4-635-642.
3. Илушка И.В., Доценко С.П. Влияние основных факторов процесса культивирования на кислото-
образующую способность продуцента молочной кислоты Lactococcus lactis СН5 // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2012. N 82. С. 48-57.
4. Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Еремец В.И., Шин-карев С.М., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А. [и др.]. Тенденции развития производства молочной кислоты // Вестник технологического университета. 2017. Т. 20. N 1. С. 162-166.
5. Шинкарев С.М., Самуйленко А.Я., Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Павленко И.В., Рубцова Г.Н. [и др.]. Совершенствование микробиологического синтеза молочной кислоты // Вестник технологического университета. 2017. Т. 20. N 18. С. 165-170.
6. Евелева В.В., Коршунова Н.А., Баракова Н.В. Перспективные сырьевые источники для производства молочной кислоты // Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке: IX Международная научно-техническая конференция (г. Санкт-Петербург, 13-15 ноября 2019 г.). СПб.: Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики, 2019. Т. 2. С. 74-78.
7. Wang J., Wang Q., Xu Z., Zhang W., Xiang, J. Effect of fermentation conditions on L-lactic acid production from soybean straw hydrolysate // Journal of Microbiology and Biotechnology. 2015. Vol. 25, no. 1. P. 26-32. https://doi.org/10.4014/jmb.1405.05025.
8. Бондарева О.В., Толкачева А.А., Некрасова Н.А., Шуваева Г.П., Черенков Д.А., Корнеева О.С. Подбор оптимальных условий биосинтеза молочной кислоты // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. 2022. Т. 84. N 1. С. 112-117. https://doi.org/10.20914/2310-1202-2022-1-112-117.
9. Саламатзадех А.А., Ганбаров Х.Г., Кафшдар-джалал А.М. Влияние условий культивирования на продуцирование молочной кислоты у бактерий рода Lactobacillus // Вестник Московского государственного областного университета. Серия: Естественные науки. 2011. N 2. С. 73-77.
10. Мингазова Л.А., Канарский А.В., Крякуно-ва Е.В., Канарская З.А. Синтез молочной кислоты грибом Rhizopus oryzae F-1030 на питательных средах из сульфитных щелоков // Известия высших учебных заведений. Лесной журнал. 2020. N 2. С. 146-158. https://doi.org/10.37482/0536-1036-2020-2-146-158.
11. Kawai Y., Saito T., Konno T., Itoh T. Compositional characteristics of lactic acids produced by Lactobacil-
lus acidophilus group lactic acid bacteria // Animal Science and Technology. 1996. Vol. 67, no. 7. P. 621-629.
12. Shibata K., Flores D.M., Kobayashi G., Sono-moto K. Direct l-lactic acid fermentation with sago starch by a novel amylolytic lactic acid bacterium, En-terococcus faecium // Enzyme and Microbial Technology. 2007. Vol. 41, no. 1-2. P. 149-155. https://doi. org/10.1016/j.enzmictec.2006.12.020.
13. Колеснов А.Ю., Володина Е.М., Альперо-вич Е.Д. Ферментативный анализ изомеров молочной кислоты в молочных продуктах и сырье // Пищевая промышленность. 1997. N 3.
14. De Man J.C., Rogosa M., Sharpe M.E. A medium for the cultivation of lactobacilli // Journal of Applied Bacteriology. 1960. Vol. 23, no. 1. P. 130-135. https:// doi.org/10.1111/j.1365-2672.1960.tb00188.x.
15. Борщевская Л.Н., Гордеева Т.Л., Калинина А.Н., Синеокий С.П. Спектрофотометрическое определение молочной кислоты // Журнал аналитической химии. 2016. Т. 71. N 8. С. 787-790. https:// doi.org/10.7868/S004445021608003X.
16. Ding X., Lin Sh., Weng H., Liang J. Separation and determination of the enantiomers of lactic acid and 2-hy-droxyglutaric acid by chiral derivatization combined with gas chromatography and mass spectrometry // Journal of Separation Science. 2018. Vol. 41, no. 12. P. 25762584. https://doi.org/10.1002/jssc.201701555.
17. Бочкова А.П., Евелева В.В. Технология молочной кислоты с использованием селекционированного штамма молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii ВКПМ в-8744 // Успехи современного естествознания. 2005. N 9. С. 68-68.
18. Шавыркина Н.А., Скиба Е.А. Получение молочной кислоты из шелухи овса // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2021. Т. 11. N 1. С. 99-106. https://doi.org/10.21285/2227-2925-2021-11-1-99-106.
19. Carr F.J., Chill D., Maida N. The lactic acid bacteria: a literature survey // Critical Reviews in Microbiology. 2002. Vol. 28, no. 4. P. 281-370. https://doi. org/10.1080/1040-840291046759.
20. Abedi E., Hashemi S.M.B. Lactic acid production-producing microorganisms and substrates sources-state of art // Heliyon. 2020. Vol. 6, no. 10. P. e04974. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2020.e04974.
21. Annunziata M., Nastri L., Cecoro G., Guida L. The use of Poly-d, l-lactic acid (PDLLA) devices for bone augmentation techniques: a systematic review // Molecules. 2017. Vol. 22, no. 12. P. 2214. https://doi. org/10.3390/molecules22122214.
REFERENCES
1. Solval K.M., Chouljenko A., Chotiko A., Sathi-vel S. Growth kinetics and lactic acid production of Lactobacillus plantarum NRRL B-4496, L. acidophilus NRRL B-4495, and L. reuteri B-14171 in media containing egg white hydrolysates. LWT. 2019;105:393-399. https://doi.org/10.1016/jJwt.2019.01.058.
2. Shipovskaya E.A., Eveleva V.V., Cherpalova T.M. Biosynthetic activity study of Lactobacillus acidophilus lactic acid bacteria in the lactose fermentation of whey. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologi-ya = Proceedings of Universities. Applied Chemistry
and Biotechnology. 2019;9(4):635-642. https://doi. org/10.21285/2227-2925-2019-9-4-635-642.
3. Ilushka I.V., Dotsenko S.P. The influence of glucose and yeast autolysate concentration and the method of cultivation on productivity of lactic acid producer Lactococcus lactis CH5. Politematicheskii setevoi elektronnyi nauchnyi zhurnal Kubanskogo gosudarst-vennogo agrarnogo universiteta = Polythematic Online Scientific Journal of Kuban State Agrarian University. 2012;(82):48-57. (In Russian).
4. Samuilenko A.Ya., Grin' S.A., Eremets V.I.,
Shinkarev S.M., Neminushchaya L.A., Skotnikova T.A., et al. Lactic acid production development trends. Vest-nik tekhnologicheskogo universiteta = Herald of Technological University. 2017;20(1):162-166. (In Russian).
5. Shinkarev S.M., Samuilenko A.Ya., Neminushchaya L.A., Skotnikova T.A., Pavlenko I.V., Rubtsova G.N., et al. Improving the microbiological synthesis of lactic acid. Vestnik tekhnologicheskogo universiteta = Herald of Technological University. 2017;20(18):165-170. (In Russian).
6. Eveleva V.V., Korshunova N.A., Barakova N.V. Promising raw materials for the production of lactic acid. In: Nizkotemperaturnye i pishchevye tekhnologii v XXI veke: IX Mezhdunarodnaya nauchno-tekhnicheskaya konfer-entsiya = Low temperature and food technologies in the 21st century: IX International Scientific and Technical Conference. 13-15 November 2019, Saint Petersburg. Saint Petersburg; 2019, vol. 2, p. 74-78. (In Russian).
7. Wang J., Wang Q., Xu Z., Zhang W., Xiang, J. Effect of fermentation conditions on L-lactic acid production from soybean straw hydrolysate. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2015;25(1):26-32. https://doi. org/10.4014/jmb.1405.05025.
8. Bondareva O.V., Tolkacheva A.A., Nekraso-va N.A., Shuvaeva G.P., Cherenkov D.A., Korneeva O.S. Selection of optimal conditions for the lactic acid biosynthesis. Vestnik Voronezhskogo gosudarstvennogo universiteta inzhenernykh tekhnologii = Proceedings of the Voronezh State University of Engineering Technologies. 2022;84(1): 112-117. (In Russian). https://doi. org/10.20914/2310-1202-2022-1-112-117.
9. Salamatzadekh A.A., Ganbarov Kh.G., Kafsh-dardzhalal A.M. Influence of culture conditions on the production of lactic acid in bacteria of the genus Lac-tobacillus. Vestnik Moskovskogo gosudarstvennogo oblastnogo universiteta. Seriya: Estestvennye nau-ki = Bulletin of the MSRU. Series: Natural Sciences. 2011;(2):73-77. (In Russian).
10. Mingazova L.A., Kanarsky A.V., Kryakunova E.V., Kanarskaya Z.A. Lactic acid synthesis by fungus Rhizo-pus oryzae F-1030 on growth media based on sulphite liquors. Izvestiya vysshikh uchebnykh zavedenii. Lesnoi zhurnal = Bulletin of Higher Educational Institutions. Russian Forestry Journal. 2020;(2):146-158. (In Russian). https://doi.org/10.37482/0536-1036-2020-2-146-158.
11. Kawai Y., Saito T., Konno T., Itoh T. Compositional characteristics of lactic acids produced by Lactobacillus acidophilus group lactic acid bacteria. Animal Science and Technology. 1996;67(7):621-629.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ
Суханова Анна Алексеевна,
к.б.н., старший научный сотрудник,
начальник ОБПМ РЦ «КАС»,
Сибирский государственный университет науки
и технологий им. М.Ф. Решетнева,
660037, г. Красноярск, пр-т им. газеты
Красноярский рабочий, 31,
Российская Федерация,
https://orcid.org/0000-0002-5830-1450
12. Shibata K., Flores D.M., Kobayashi G., Sono-moto K. Direct l-lactic acid fermentation with sago starch by a novel amylolytic lactic acid bacterium, En-terococcus faecium. Enzyme and Microbial Technology. 2007;41(1-2): 149-155. https://doi.org/10.1016/j. enzmictec.2006.12.020.
13. Kolesnov A.Yu., Volodina E.M., Al'perovich E.D. Enzymatic analysis of lactic acid isomers in dairy products and raw materials. Pishchevaya promyshlennost' = Food Industry. 1997;(3). (In Russian).
14. De Man J.C., Rogosa M., Sharpe M.E. A medium for the cultivation of lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology. 1960;23(1):130-135. https://doi. org/10.1111/j.1365-2672.1960.tb00188.x.
15. Borshchevskaya L.N., Gordeeva T.L., Kalinina A.N., Sineokii S.P. Spectrophotometry determination of lactic acid. Zhurnal analiticheskoi khimii = Journal of Analytical Chemistry. 2016;71(8):787-790. (In Russian). https://doi.org/10.7868/S004445021608003X.
16. Ding X., Lin Sh., Weng H., Liang J. Separation and determination of the enantiomers of lactic acid and 2-hydroxyglutaric acid by chiral derivatization combined with gas chromatography and mass spectrometry. Journal of Separation Science. 2018;41(12):2576-2584. https://doi.org/10.1002/jssc.201701555.
17. Bochkova A.P., Eveleva V.V. Lactic acid technology using a selected strain of lactic acid bacteria Lactobacillus delbrueckii VKPM v-8744. Uspekhi sovremen-nogo estestvoznaniya. 2005;(9):68-68. (In Russian).
18. Shavyrkina N.A., Skiba E.A. Obtaining lactic acid from oat husks. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya = Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology. 2021;11(1):99-106. (In Russian). https://doi.org/10.21285/2227-2925-2021-11-1-99-106.
19. Carr F.J., Chill D., Maida N. The lactic acid bacteria: a literature survey. Critical Reviews in Microbiology. 2002;28(4):281-370. https://doi.org/10.1080/1040-840291046759.
20. Abedi E., Hashemi S.M.B. Lactic acid production-producing microorganisms and substrates sources-state of art. Heliyon. 2020;6(10):e04974. https:// doi.org/10.1016/j.heliyon.2020.e04974.
21. Annunziata M., Nastri L., Cecoro G., Guida L. The use of Poly-d, l-lactic acid (PDLLA) devices for bone augmentation techniques: a systematic review. Molecules. 2017;22(12):2214. https://doi.org/10.3390/ molecules22122214.
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Anna A. Sukhanova,
Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher,
Head of DBPM RC "SAS",
Reshetnev Siberian State University
of Science and Technology,
31, Gazeta Krasnoyarski Rabochii Ave.,
Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation,
https://orcid.org/0000-0002-5830-1450
Ертилецкая Наталья Леонидовна,
младший научный сотрудник ОБПМ РЦ «КАС», Сибирский государственный университет науки и технологий им. М.Ф. Решетнева, 660037, г. Красноярск, пр-т им. газеты Красноярский рабочий, 31, Российская Федерация, [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2626-893X
Бояндин Анатолий Николаевич,
к.б.н., старший научный сотрудник ОБПМ РЦ «КАС»,
Сибирский государственный университет науки
и технологий им. М.Ф. Решетнева,
660037, г. Красноярск, пр-т им. газеты
Красноярский рабочий, 31,
Российская Федерация,
https://orcid.org/0000-0002-9190-2792
Сырцов Сергей Николаевич,
научный сотрудник ОБПМ РЦ «КАС»,
Сибирский государственный университет науки
и технологий им. М.Ф. Решетнева,
660037, г. Красноярск, пр-т им. газеты
Красноярский рабочий, 31,
Российская Федерация,
https://orcid.org/0009-0001-6308-0031
Середа Анна Алексеевна,
лаборант-исследователь ОБПМ РЦ «КАС», Сибирский государственный университет науки и технологий им. М.Ф. Решетнева, 660037, г. Красноярск, пр-т им. газеты Красноярский рабочий, 31, Российская Федерация, [email protected] https://orcid.org/0009-0007-1891-4846
Прокопчук Юлия Александровна,
лаборант-исследователь ОБПМ РЦ «КАС», Сибирский государственный университет науки и технологий им. М.Ф. Решетнева, 660037, г. Красноярск, пр-т им. газеты Красноярский рабочий, 31, Российская Федерация, [email protected] https://orcid.org/0009-0005-4653-0319
Бротт Валерия Викторовна,
лаборант-исследователь ОБПМ РЦ «КАС»,
Сибирский государственный университет науки
и технологий им. М.Ф. Решетнева,
660037, г. Красноярск, пр-т им. газеты
Красноярский рабочий, 31,
Российская Федерация,
https://orcid.org/0009-0009-5819-119X
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Natalya L. Ertiletskaya,
Junior Researcher, DBPM RC "SAS",
Reshetnev Siberian State University
of Science and Technology,
31, Gazeta Krasnoyarski Rabochii Ave.,
Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation,
https://orcid.org/0000-0003-2626-893X
Anatoly N. Boyandin,
Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher, DBPM RC "SAS",
Reshetnev Siberian State University
of Science and Technology,
31, Gazeta Krasnoyarski Rabochii Ave.,
Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation,
https://orcid.org/0000-0002-9190-2792
Sergey N. Syrtsov,
Researcher, DBPM RC "SAS",
Reshetnev Siberian State University
of Science and Technology,
31, Gazeta Krasnoyarski Rabochii Ave.,
Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation,
https://orcid.org/0009-0001-6308-0031
Anna A. Sereda,
Lab-assistant, DBPM RC "SAS",
Reshetnev Siberian State University
of Science and Technology,
31, Gazeta Krasnoyarski Rabochii Ave.,
Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation,
https://orcid.org/0009-0007-1891-4846
Yulia A. Prokopchuk,
Lab-assistant, DBPM RC "SAS",
Reshetnev Siberian State University
of Science and Technology,
31, Gazeta Krasnoyarski Rabochii Ave.,
Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation,
https://orcid.org/0009-0005-4653-0319
Valeria V. Brott,
Lab-assistant, DBPM RC "SAS",
Reshetnev Siberian State University
of Science and Technology,
31, Gazeta Krasnoyarski Rabochii Ave.,
Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation,
https://orcid.org/0009-0009-5819-119X
Contribution of the authors
The authors contributed equally to this article.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.
Информация о статье
Поступила в редакцию 05.04.2023. Одобрена после рецензирования 26.04.2023. Принята к публикации 30.05.2023.
Conflict interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
The final manuscript has been read and approved by all the co-authors.
Information about the article
The article was submitted 05.04.2023. Approved after reviewing 26.04.2023. Accepted for publication 30.05.2023.
