ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НИТРОЗОДИЭТИЛАМИНА МИКРОЯДЕРНЫМ МЕТОДОМ В РАЗНЫХ ОРГАНАХ КРЫС

О.Г. Саламатова; Л.П. Сычева

О. Г. Саламатова, Л. П. Сычева

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕИОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НИТРОЗОДИЭТИЛАМИ НА МИКРОЯДЕРНЫМ МЕТОДОМ В РАЗНЫХ ОРГАНАХ КРЫС

НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва

В настоящее время одной из важных проблем генетической токсикологии и профилактической онкологии является ускорение и повышение надежности выявления потенциальных канцерогенов для человека. Основной путь решения этой проблемы — испытание веществ в краткосрочных тестах на млекопитающих и оценка эффекта в разных органах. Удобным тестом для этого является количественный анализ клеток с микроядрами (микроядерный тест). В основном он проводится на полихроматофильных эритроцитах костного мозга и очень редко — на клетках других органов. Для расширения спектра исследуемых тканей необходимы разработка и усовершенствование соответствующих методик. В представленной работе на разных органах желудочно-кишечного тракта крыс (печени, преджелудке, желудке, двенадцатиперстной, тонкой и толстой кишках» испытан микроядерный метод при действии известного мутагена нитрозодиэтиламина (НДЭА).

Проведено 2 эксперимента на белых неинбредных крысах SHK одной партии массой 250—300 г. В 1-м эксперименте ставили микроядерный тест на гепатоцитах, во 2-м — на клетках желудочно-кишечного тракта и костного мозга. Животных содержали в пластиковых клетках на стандартной диете. НДЭА (Merck Sshuchardt) в обоих экспериментах растворяли в дистиллированной 1 воде и вводили внутрижелудочно с помощью зонда. Испытывали дозы 60, 30, 12 и 2,4 мг/кг, что приблизительно соответствует 'Д, '/ю, '/25 и 1 / 12s LDso-В каждой группе было по 5—6 животных. Поскольку клетки печени относятся к медленно пролиферирующим, для стимуляции деления проводили частичную гепатэктомию по методу |6), НДЭА вводили до гепатэктомии 4-кратно с интервалом 24 ч. Препараты изолированных клеток готовили через 96 ч после гепатэктомии в соответствии с модифицированной нами методикой [2] путем получения изолированных гепатоцитов с помощью 5 % раствора сахарозы и окрашивания препаратов азур Ii-эозином после гидролиза 1 N HCl. Эпителиальные клетки желудочно-кишечного тракта и костного мозга достаточно активно делятся, их деление не нужно стимулировать. Для анализа микроядер в клетках преджелудка, желудка, двенадцатиперстной, тонкой и толстой кишок НДЭА вводили 4-кратно с интервалом 24 ч. Препараты изолированных эпителиальных клеток готовили через I сут после последнего введения вещества по методу |1|, предложенному для выявления микроядер в преджелудке, желудке и толстой кишке мышей. Этот метод был адаптирован нами для выявления микроядер в этих же органах, а также двенадцатиперстной и тонкой кишках другого вида животных — крыс. Анализ микроядер в клетках костного мозга крыс затруднен в связи с тем, что происходит дегрануляция базофильных лейкоцитов, а гранулы похожи на микроядра. Для удаления гранул проведено продавливание суспензии клеток костного мозга через специальный фильтр по методу [11).

Цитогенетический анализ проводили на зашифрованных препаратах. Мнкроядра считали в эпителиальных клетках с хорошо сохраненной цитоплазмой и отсутствием каких-либо повреждений. Анализировали по 1000 клеток на животное. В печени, кроме того, подсчитывали процент двуядерных клеток на 200 клеток. Статистический анализ проводили с помощью ранее рекомендованных методов (8).

Полученные результаты представлены в табл. I и 2. У ин-тактных крыс отмечено в среднем 1,17%о гепатоцитов с микроядрами. Частота клеток с микроядрами в печени возрастала с увеличением дозы от 2,4 до 4,2 и 13,3°/оо (соответственно при 2,4, 12 и 30 мг/кг). Введение НДЭА в дозе 60 мг/кг и дальнейшая гепатэктомия привели к гибели 4 животных из 6. У 2 оставшихся крыс отмечено 7°/оо гепатоцитов с микроядрами. В связи со значительной дисперсией данных отличия между группами достоверны только при использовании доз НДЭА. В соответствии с Кокрейн — Армитедж трендом отмеченный рост эффекта с дозой высокозначим. Процент двуядерных гепатоцитов колебался от 3,7 до 5,7. Уровень этого показателя менее 10% свидетельствует о достаточно высокой пролифератнвной активности гепатоцитов и возможности выявить в них микроядра. Частота эпителиальных клеток с микроядрами в преджелудке, желудке, двенадцатиперстной, тонкой и толстой кишках, а также в полихроматофильных эритроцитах костного мозга при всех дозах НДЭА не превышала контроля.

Основной целью исследования была оценка генотоксическо-го эффекта НДЭА в разных органах крыс и сопоставление ее с локализацией опухолей, по данным литературы. Установлено, что НДЭА вызывает выраженный дозозависимьж эффект в клетках печени и не индуцирует цитогенетических повреждений в других органах желудочно-кишечного тракта и костном мозге. Основная причина такой органоспецифич-ности, по-видимому, определяется местом метаболизма НДЭА. Показано, что токсические, мутагенные и канцерогенные эффекты НДЭА обусловлены не самим веществом, а его метаболитами, которые образуются преимущественно в печени в процессе окислительного гидроксилирования с участием системы микросомальных монооксигеназ. Активные метаболиты ал-килируют нуклеиновые кислоты с образованием 7-этилгуанина, О6 — этилгуанина, 3 — этиладенина и этнлфосфотриэфнров, которые выявляются в основном в печени, а также в почках [5, 7).

НДЭА - известный мутаген непрямого действия и прокан-цероген. Он индуцирует мутации у Salmonella typhimuriuin, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, а также в культуре клеток китайского хомячка только при добавлении микросом печени, что также свидетельствует о роли метаболизма этого вещества в органотропном проявлении генотоксических свойств

(Л-

Органная специфичность генотоксического эффекта НДЭА на млекопитающих in vivo изучена недостаточно. В основном его эффект, как и эффект большинства других мутагенов, оценивали в клетках костного мозга и крови. Он не ннду-цировал хромосомных аберраций и микроядер в костном мозге мышей [12, 15], мнкроядер в костном мозге крыс [Г4|, хромосомных аберраций и сестринских хроматндных обменов в лимфоцитах периферической крови [9]. При действии высоких доз НДЭА определено повышение частоты сестринских хроматид-ных обменов в костном мозге мышей [4| н китайских хомячков [3], а также в лимфоцитах периферической крови крыс [13]. Наши результаты, показавшие отсутствие эффекта НДЭА в костном мозге, соответствуют данным литературы и подтверждают мнение о том, что для заключения о геноток-

Таблица I

Частота гепатоцитов с микроядрами (Af±m) у гепатэктомированных животных при 4-кратном внутрижелудочном введении НДЭА

Доза, мг/кг Число крыс Число исследованных клеток Частота гепатоцитов с микроядрами на 1000 клеток Количество двуядерных гепатоцитов на 200 клеток, %

Контроль 6 6000 1,17±0,48 4,83±0,74

2,4 12 30

5000 5000 6000

2,40±1,31 4,20± 1,56 13,3±2,03*

5,70±0,90 3,70±0.97 4,83 ±0,53

Примечание. Звездочка — сравнение с контролем, р<0,001.

Таблица 2

Частота клеток с микроядрами в разных органах крыс после 4-кратного внутрижелудочного введения НДЭА

Орган Контроль 2.4 мг/кг 12 мг/кг 60 мг/кг

частота клеток с микроядрами на 1000

Преджелудок Желудок

Двенадцатиперстная

кишка Тонкая кишка Толстая кишка Костный мозг

0,34±0.21 0.83±0.31

0,67±0,33 0,67±0,49 0,67±0,33 0.33±0,21

0,83±0,48 0,50±0,50

0,17±0,17 0,67±0,49 0,17±0,17 0,67±0,33

0,67±0,33 0,83±0,31

0,67±0,21 0.67±0,33 0,67 ±0,33 1,00±0,26

0,33±0,21 1,33±0,71

0,33±0,21 0,50±0,50 1,17±0,65 0,83±0,31

сических и тем более потенциальных канцерогенных свойствах вещества недостаточно изучения его эффекта только в одном из органов.

Цитогенетические исследования НДЭА в печени — основном метаболизирующем органе — проведены A. Tates и соавт. |12] с помощью разработанного ими микроядерного метода на препаратах изолированных гепатоцитов. Частота гепатоцитов с микроядрами у крыс Вистар при внутрибрюшинном введении 50 мг/кг НДЭА составила 19,3°/оо при 2,5%о в контроле, что хорошо согласуется с нашими результатами: 13.3°/оо при пероральном введении НДЭА в дозе 30 мг/кг. Это позволяет рекомендовать применение методики в нашей модификации, так как она проще и не требует дорогостоящих реактивов. В частности A. Tates и соавт. применяют для изоляции гепатоцитов среду, состоящую из 15 компонентов, в том числе коллагеназы Sigma типа I, и окрашивают препараты по Фельгену с докраской нафтоловым желтым S. Мы же для диссоциации клеток применяли 5 % раствор сахарозы и окрашивали препараты азур I [-эозином с предварительным гидролизом 1 N HCl.

Цитогенетический эффект НДЭА в других органах крыс не исследован. Однако проведено сравнение способности этого вещества индуцировать однонитевые разрывы и щелочела-бильные сайты ДНК. Максимальный эффект при внутрибрюшинном введении НДЭА крысам в дозе 40—80 мг/кг выявлен в печени, слабый — в почках и двенадцатиперстной кишке; в легком, тимусе и мозге эффект не обнаружен [10]. В нашем эксперименте выявлен значимый эффект НДЭА в печени, но в двенадцатиперстной кишке, а также в других органах желудочно-кишечного тракта он не превышал спонтанного уровня. В этом плане наши результаты лучше соответствуют данным по органной специфичности канцерогенного действия НДЭА, который индуцирует у крыс опухоли печени, почек и пищевода, но не двенадцатиперстной киш-

и |7).

Таким образом, установлен цитогенетический эффект НДЭА в ¡епатоцитах и отсутствие такого эффекта в преджелудке, желудке, двенадцатиперстной, тонкой и толстой кишках и клетках костного мозга крыс, что согласуется с локализацией опухолей, индуцированных этим канцерогеном. Проведенное исследование показало применимость микроядерного теста для

оценки генотоксических, а также прогноза канцерогенных

свойств химических веществ в разных органах после обработки

in vivo.

Литература

1. Выскубенко И. Ф.. Фельдт Е. Г.. Журков В. С., Шерене-шева Н. И. // Методологические вопросы генетики.— Томск, 1990,—С. 107—113.

2. Сычева Л. П.. Беляева Н. Н. // Объем и методы гено-токсической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ.— Л., 1989.— С. 90.

3. Bayer Y. // Mutat. Res.— 1978.— Vol. 56.— P. 305—309.

4. Chourolinkov J. Progress Report Environmental Research Programme of the comission of the European Communities.— Brussels, 1978.

5. Engelse L. den. Float В G. J.. Brij R.-J. de. Tales A. D. // Mutat. Res.— 1983.—Vol. 107, N 1,— P. 153-166.

6. Higgins G. M., Anderson R. M. // Arch. Path.— 1931. — Vol. 12, N 2,— P. 186—202.

7. JARC Monograph on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans.— Lyon, 1978.—Vol. 17.— P. 83—124.

8. Margolin В. H., Risko J. K. // Ashby J. et al. Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens.— Geneva, 1988.— Vol. 1,— P. I—29—1.42.

9. Natarajan А. Т.. van Buul P. P. W., Raposa Т. 11 Evans H. J., Lloga D. C. Mutageninduced Chromosome Damage in Man.— Edinburgh, 1978.— P. 73—79.

10. Retzold G. L„ Swenberg J. A. // Cancer Res. 1978 — Vol. 38, N 6,- O. 1589-1591.

11. Romagna F. Ц Mutat. Res.— 1988,—Vol. 206,— P. 307— 309.

12. Tates A. D., Neuteboom /., Hofker M., Engelse L. den. // Ibid.— 1980,-Vol. 74, N 1,— P. 11-20.

13. Tales A. D., Neuteboom I., de Vogel N.. den Engelse L. Ц Ibid.- 1983.-Vol. 107, N 1 —P. 131-151.

14. Trzos R. J.. Petzold G. L., Brunden M. N.. Swenberg I. А. Ц Ibid.- 1978,-Vol. 58.- P. 79-86.

15. Wild D. Ц Ibid.-Vol. 56.— P. 319—327.

Поступила 16.07.91

3. М. Гасимова, В. И. Казачков, Е. В. Логинова

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К МОРФОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва

системы в целом. СМФ, играющая важную роль в обеспечении неспецифической резистентности организма, представляет собой единую клеточную линию в процессе дифференциров-ки от моноцитарных предшественников костного мозга (МПКМ) до тканевых макрофагов [3, 17]. При этом состояние МПКМ в значительной степени определяет функциональные возможности и потенциал эффекторных клеток системы — тканевых макрофагов [14]. Это обусловливает важность изучения взаимосвязи изменений состояния клеток различных

В современных гигиенических исследованиях в качестве ^спериментальной модели для изучения токсического дей-^вия химических и биологических загрязнений окружающей среды широко используются отдельные клеточные "оиуляцни системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ), в основном макрофаги легких и перитонеальной полости [И, 14|. Однако до настоящего времени не разработан *°милекс экспериментально обоснованных показателей, ха-Рактеризующих состояние мононуклеарных фагоцитов как

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — О.Г. Саламатова, Л.П. Сычева

Текст научной работы на тему «ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НИТРОЗОДИЭТИЛАМИНА МИКРОЯДЕРНЫМ МЕТОДОМ В РАЗНЫХ ОРГАНАХ КРЫС»