CC BY
6
Таблица 2
Частота клеток с микроядрами в разных органах крыс после 4-кратного внутрижелудочного введения НДЭА
Орган Контроль 2.4 мг/кг 12 мг/кг 60 мг/кг
частота клеток с микроядрами на 1000
Преджелудок Желудок
Двенадцатиперстная
кишка Тонкая кишка Толстая кишка Костный мозг
0,34±0.21 0.83±0.31
0,67±0,33 0,67±0,49 0,67±0,33 0.33±0,21
0,83±0,48 0,50±0,50
0,17±0,17 0,67±0,49 0,17±0,17 0,67±0,33
0,67±0,33 0,83±0,31
0,67±0,21 0.67±0,33 0,67 ±0,33 1,00±0,26
0,33±0,21 1,33±0,71
0,33±0,21 0,50±0,50 1,17±0,65 0,83±0,31
сических и тем более потенциальных канцерогенных свойствах вещества недостаточно изучения его эффекта только в одном из органов.
Цитогенетические исследования НДЭА в печени — основном метаболизирующем органе — проведены A. Tates и соавт. |12] с помощью разработанного ими микроядерного метода на препаратах изолированных гепатоцитов. Частота гепатоцитов с микроядрами у крыс Вистар при внутрибрюшинном введении 50 мг/кг НДЭА составила 19,3°/оо при 2,5%о в контроле, что хорошо согласуется с нашими результатами: 13.3°/оо при пероральном введении НДЭА в дозе 30 мг/кг. Это позволяет рекомендовать применение методики в нашей модификации, так как она проще и не требует дорогостоящих реактивов. В частности A. Tates и соавт. применяют для изоляции гепатоцитов среду, состоящую из 15 компонентов, в том числе коллагеназы Sigma типа I, и окрашивают препараты по Фельгену с докраской нафтоловым желтым S. Мы же для диссоциации клеток применяли 5 % раствор сахарозы и окрашивали препараты азур I [-эозином с предварительным гидролизом 1 N HCl.
Цитогенетический эффект НДЭА в других органах крыс не исследован. Однако проведено сравнение способности этого вещества индуцировать однонитевые разрывы и щелочела-бильные сайты ДНК. Максимальный эффект при внутрибрюшинном введении НДЭА крысам в дозе 40—80 мг/кг выявлен в печени, слабый — в почках и двенадцатиперстной кишке; в легком, тимусе и мозге эффект не обнаружен [10]. В нашем эксперименте выявлен значимый эффект НДЭА в печени, но в двенадцатиперстной кишке, а также в других органах желудочно-кишечного тракта он не превышал спонтанного уровня. В этом плане наши результаты лучше соответствуют данным по органной специфичности канцерогенного действия НДЭА, который индуцирует у крыс опухоли печени, почек и пищевода, но не двенадцатиперстной киш-
и |7).
Таким образом, установлен цитогенетический эффект НДЭА в ¡епатоцитах и отсутствие такого эффекта в преджелудке, желудке, двенадцатиперстной, тонкой и толстой кишках и клетках костного мозга крыс, что согласуется с локализацией опухолей, индуцированных этим канцерогеном. Проведенное исследование показало применимость микроядерного теста для
оценки генотоксических, а также прогноза канцерогенных
свойств химических веществ в разных органах после обработки
in vivo.
Литература
1. Выскубенко И. Ф.. Фельдт Е. Г.. Журков В. С., Шерене-шева Н. И. // Методологические вопросы генетики.— Томск, 1990,—С. 107—113.
2. Сычева Л. П.. Беляева Н. Н. // Объем и методы гено-токсической оценки и побочных эффектов биологически активных веществ.— Л., 1989.— С. 90.
3. Bayer Y. // Mutat. Res.— 1978.— Vol. 56.— P. 305—309.
4. Chourolinkov J. Progress Report Environmental Research Programme of the comission of the European Communities.— Brussels, 1978.
5. Engelse L. den. Float В G. J.. Brij R.-J. de. Tales A. D. // Mutat. Res.— 1983.—Vol. 107, N 1,— P. 153-166.
6. Higgins G. M., Anderson R. M. // Arch. Path.— 1931. — Vol. 12, N 2,— P. 186—202.
7. JARC Monograph on the Evaluation of the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans.— Lyon, 1978.—Vol. 17.— P. 83—124.
8. Margolin В. H., Risko J. K. // Ashby J. et al. Evaluation of Short-Term Tests for Carcinogens.— Geneva, 1988.— Vol. 1,— P. I—29—1.42.
9. Natarajan А. Т.. van Buul P. P. W., Raposa Т. 11 Evans H. J., Lloga D. C. Mutageninduced Chromosome Damage in Man.— Edinburgh, 1978.— P. 73—79.
10. Retzold G. L„ Swenberg J. A. // Cancer Res. 1978 — Vol. 38, N 6,- O. 1589-1591.
11. Romagna F. Ц Mutat. Res.— 1988,—Vol. 206,— P. 307— 309.
12. Tates A. D., Neuteboom /., Hofker M., Engelse L. den. // Ibid.— 1980,-Vol. 74, N 1,— P. 11-20.
13. Tales A. D., Neuteboom I., de Vogel N.. den Engelse L. Ц Ibid.- 1983.-Vol. 107, N 1 —P. 131-151.
14. Trzos R. J.. Petzold G. L., Brunden M. N.. Swenberg I. А. Ц Ibid.- 1978,-Vol. 58.- P. 79-86.
15. Wild D. Ц Ibid.-Vol. 56.— P. 319—327.
Поступила 16.07.91
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1992" УДК 614.72-07:616.155.33-008.6
3. М. Гасимова, В. И. Казачков, Е. В. Логинова
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К МОРФОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
системы в целом. СМФ, играющая важную роль в обеспечении неспецифической резистентности организма, представляет собой единую клеточную линию в процессе дифференциров-ки от моноцитарных предшественников костного мозга (МПКМ) до тканевых макрофагов [3, 17]. При этом состояние МПКМ в значительной степени определяет функциональные возможности и потенциал эффекторных клеток системы — тканевых макрофагов [14]. Это обусловливает важность изучения взаимосвязи изменений состояния клеток различных
В современных гигиенических исследованиях в качестве ^спериментальной модели для изучения токсического дей-^вия химических и биологических загрязнений окружающей среды широко используются отдельные клеточные "оиуляцни системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ), в основном макрофаги легких и перитонеальной полости [И, 14|. Однако до настоящего времени не разработан *°милекс экспериментально обоснованных показателей, ха-Рактеризующих состояние мононуклеарных фагоцитов как
звеньев СМФ (центрального — МПКМ, транзнторного — моноцитов крови, периферического — тканевых макрофагов).
Согласно исследованиям М. Cline [16], моноциты, покидающие кровяное русло, распределяются во внесосуднстом пуле следующим образом: 56,4 % идут в печень, 14,9 % — в легкие, 7,6% — в перитонеальную полость н 21,1% — в другие органы и ткани. Биологическая целесообразность распределения основного количества внесосудистого пула моноцитов в печени и легких, вероятно, обусловлена тем, что эти органы, являясь основными системами детокСи-кацни организма, в наибольшей степени нуждаются в усилении защитных реакций, опосредованных макрофагами, на действие различных экзо- и эндогенных факторов, нарушающих их гомеостаз. Следует отметить, что нарушение функциональной активности мононуклеарных фагоцитов вызывает у экспериментальных животных образование хронических очагов воспаления в разных органах, наиболее выраженное в легких и печени [18|.
В последние десятилетня повсеместно наблюдается увеличение числа хронических неспецифических заболеваний данных органов, что обусловливает необходимость системного исследования истоков формирования заболеваний легких и печени .и разработки мер их предупреждения [8|. Установлена корреляция между повреждением этих органов и загрязнением окружающей среды химическими соединениями [211. В связи с этим становится очевидной важность изучения действия неблагоприятных факторов, в том числе химических загрязнений, на структурно-функциональное состояние тканевых макрофагов и в первую очередь макрофагов легких и печени, а также СМФ в целом.
Нами проведен морфологический анализ состояния клеток разных звеньев СМФ неинбредных крыс (МПКМ бедренной кости, моноцитов периферической крови, альвеолярных макрофагов легких — АМЛ, макрофагов печени) на ранних стадиях проявления неблагоприятных эффектов перорального действия этанола и одного из основных канцерогенных нитрозо-соединений — нитрозодиметиламина. Изучали также роль перорального воздействия бензола и нитрата свинца в реализации эмбриотоксического эффекта хлорида кадмия [1, 2, 4—7]. Полученные результаты позволили разработать комплекс морфофункцнональных показателей состояния СМФ, который может быть использован в экспериментальных исследованиях для оценки биологического действия химических соединений.
Чтобы оценить состояние СМФ, рекомендуется изучить структурно-функциональные показатели, характеризующие, согласно [10, 14], уровень неспецифической активации ее отдельных популяций: количество клеток в популяциях; активность в мононуклеарных фагоцитах маркерного фермента а-нафтилацетатэстеразы, а также пероксидазы, кислой фосфатазы и содержание липидов в моноцитах и макрофагах; размеры, форму, поверхностную архитектонику, фагоцитарную и адгезивную активность моноцитов крови и тканевых макрофагов при их краткосрочном культивировании на стеклянной поверхности.
Для определения числа МПКМ в бедренной кости экспериментальных животных подсчитывают общее число миело-кариоцитов. Идентификацию моноцитарных предшественников в популяции миелокариоцитов проводят по выявлению активности а-нафтилацетатэстеразы. Для определения относительного числа МПКМ в 500—1000 клетках костного мозга высчитывают число клеток с положительной реакцией на эстеразу (исключая мегакариоциты) и вычисляют абсолютное содержание данных клеток с учетом общего числа миелокариоцитов.
Абсолютное число моноцитов в крови подсчитывают исходя из общего содержания лейкоцитов и лейкоцитограммы.
Для определения абсолютного числа АМЛ в камере Горяева подсчитывают общее количество клеток, вымытых из легких в процессе бронхоальвеолярного лаважа, по методу Q. Myrvic н соавт. [19] в модификации Р. В. Мер-курьевой и соавт. |11] и на мазках, окрашенных азур-эозином, учитывают их относительное число.
Количественное содержание макрофагов печени устанавливают на криостатных срезах в 50 полях зрения при увеличении 10 X 20, определяя число клеток, проявляющих активность пероксидазы [9]. Учитывая, что положительная реакция на пероксидазу свойственна также тучным клеткам, для их идентификации и исключения из числа макрофагов на параллельных криостатных срезах проводят гистохимическую реакцию на выявление РНК или окрашивание толуиднновым синим.
Анализ поверхностной архитектоники, фагоцитарной и адгезивной активности проводится методом электронно-микроскопического сканирования клеточных монослоев, получен-
ных на покровных стеклах при культивировании по методу Ю. А. Ровенского [13]. Длительность культивирова ння при 37 "С для АМЛ 30 мин, для моноцитов крови I ч, для макрофагов печени 2 ч.
Для формирования монослойных культур моноцитов используется фракция мононуклеарных . клеток периферической крови [15|. При получении макрофагов из печени рекомендуется использовать метод выделения синусоидальных клеток печени |20| и модифицированный способ перфузии печеночных тканей с помощью перистальтического насоса.
Показателем адгезивной активности мононуклеарных фагоцитов служит предложенный нами средний индекс адгезивной активности (СИА), определяемый по формуле:
СИА=
1ХЛ+2ХЙ 100
где А — относительное содержание частично распластывающихся при культивировании на стекле клеток (1-я степень адгезивной активности); В — относительное содержание полностью распластанных по стеклу клеток (2-я степень адгезивной активности). Степень адгезивной активности макрофагов, не распластывающихся по стеклу при культивировании и сохраняющих шаровидную форму, принимали за 0 [4].
Для оценки функционального состояния популяции АМЛ (фагоцитарной активности и степени участия в элиминации альвеолярного сурфактанта) рекомендуется изучить на полутонких (2 мкм) срезах клеток, вымытых из легких и залитых в эпон-аралдитовые смолы, гетерогенность АМЛ по развитию лизосомально-вакуолярного аппарата и наличию в цитоплазме липидных включений [12].
Комплексное изучение клеточных популяций различных звеньев СМФ целесообразно проводить на фоне анализа гистоструктуры основных органов детоксикации организма, лейкоцитограммы крови и цитограммы бронхоальвеолярных смывов. Это позволяет более обоснованно судить о механизмах и закономерностях взаимодействия организма с экзогенными факторами и способствует определению уровня резистентности организма, а также прогнозу вероятности развития неблагоприятных эффектов.
Проведенный нами анализ состояния клеток СМФ у нн тактных неинбредных крыс показал, что у половозрелых животных обоего пола в возрасте от 2 до 12 мес число МПКМ в бедренной кости в среднем составляет 1—2-Ю6, а моноцитов в периферической крови — 0,1—0,5 • 103/мкл. Число вымываемых из легких альвеолярных макрофагов варьирует в пределах 1,5—2,0-10б у самцов и 0,7—3,0-106 у самок, а среднее содержание макрофагов на срезах печени в одном поле зрения при увеличении 10X20 составляет 2—7 у самцов и 1,5—6 у самок. При этом с увеличением возраста у половозрелых крыс отмечается независимое от пола снижение числа моноцитов крови. Кроме того, у самцов наблюдается возрастное снижение содержания МПКМ и макрофагов печени при неизменном числе АМЛ, а у самок — снижение числа АМЛ на фоне увеличения числа макрофагов печени
Наиболее высокие средние цитохимические коэффициенты активности неспецифической эстеразы и кислой фосфатазы у крыс обоего пола выявляются в АМЛ, пероксидазы в макрофагах печени (у самцов 2—2,35; 1,5—2,0; 1,2—1,7, у самок 1,4—2,2; 1,3—1,9 и 2,0—2,8 соответственно). В макрофагах печени, моноцитах крови и моноцитарных предшественниках активность неспецифической эстеразы варьирует независимо от пола в пределах 1,0—1,6; 1,1 — 1,9 и 1.3—1,8 соответственно, а активность пероксидазы в АМЛ - 1,0— 1,4 усл. ед.
Действие изученных химических соединений (этанола, нитрозодиметиламина, хлорида кадмия, бензола и нитрата свинца) вызывало у крыс нарушение регуляторной функции МПКМ, изменение количественного содержания моноцитов и макрофагов, угнетение их взаимодействия с лимфоцитами и нейтрофилами, повреждение поверхностной архитектоники фагоцитов и компенсаторную активацию их отдельных функций. При этом установлено, что зависимое от уровня и длительности воздействия химических соединений нарастание структурных изменений органов обусловлено как прямым неблагоприятным действием токсикантов, так и изменением структурно-функционального состояния СМФ
Результаты проведенных исследовании позволили заключить, что разработанный комплекс показателей морфофунк-ционального состояния СМФ может быть использован в качестве едкого из чувствительных тестов для гигиенической регламентации химических загрязнений окружающей среды.
Литература
1. Гасимова 3. М.. Литвинов Н. Н.. Беляева Н. Н. и яр. // Охрана окружающей среды и здоровье населения.— Тарту, 1990,— С. 34—35.
2. Казачков В. И.. Гасимпва 3. М. Методология фундаментальных исследований в гигиене окружающей среды.— М„ 1989,— С. 130—137.
3. Кузьник Б. И., Васильев Н. В., Цыбиков Н. Н. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма.— М„ 1989.
4. Литвинов Н. П., Казачков В. И., Гасимова 3. М. // Арх. анат,— 1990,— № I,— С. 60—67.
5. Литвинов Н. П., Гасимова 3. М. // Там же.— № 9.— С. 78-84.
6. Литвинов Н. Н., Г асимова 3. М., Беляева Н. Н. // Карцерогенные Г^-нитрозосоединения и их предшественники — образование и определение в окружающей среде.— Таллинн, 1990,— С. 82—83.
7. Литвинов Н. Н., Г асимова 3. М.. Вепринцев Д. Б., Логинова Е. В. // Бюл. экспер. биол.— 1991.— № 4.— С. 425-427.
8. Логинов А. С., Блок Ю. Е. Хронические гепатиты и циррозы печени.— М., 1987.
9. Маянский Д. Н. "Клетки Купфера v система моконукле- ' арных фагоцитов.— Новосибирск, 1981.
10. Маянский А. Н., Маянский Д. Н. Очерки о иейтрофиле и макрофаге.— Новосибирск, 1983.
11. Меркурьева Р. В.. Литвинов H. Н.. Аулика Б. В. и др. // Бюл. экспер. биол,— 1982,— № 4.— С. 41 —44.
12. Методические рекомендации к морфологическому изучению влияния химических факторов окружающей среды на дыхательную систему.— M., 1984.
13. Ровенский Ю. А. Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток.— М., 1979.
14. Фрейдлин И. С. Система мононуклеарных фагоцитов.— М„ 1984.
15. Воуит А. // Tissue Antigens.— 1974,— N 4.— P. 269.
16. Cline M. J. The White Cell.— Cambridge, 1975.
17. Furth P. Ц Immunobiology.— 1982,— Vol. 161, N3—4,— P. 178-185.
18. Horst A. Molekularne podstawy Patogenezy chorob.— Warszawa, 1979.
19. Myrvic Q.. Leake E S., Farris В // J. Immunol.— 1961.— Vol. 86,— P. 128—132.
20. Rous P.. Beard J. W. // J. exp. Med.— 1934.— Vol. 59 — P. 577—591.
21. Tabacova S. // Nutr. Res.— 1985.— Suppl. I.— P. 670—673.
Поступила 16.07.91
© А. С. СПАССКИЙ. 1992 УДК 614.777:613.471
А. С. Спасский
МЕТОДИКА ОЦЕНКИ РАЗДРАЖАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
НА ПЕРЕДНИЙ ОТДЕЛ ГЛАЗА
НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
В настоящее время при разработке гигиенических нормативов для оценки качества воды плавательных бассейнов, водоемов рекреационного назначения, горячей воды особое значение приобретает обязательный учет возможного раздражения органа зрения реагентами (стабилизаторы, антикоррозийные препараты), дезинфектантами, а также различными химическими веществами антропогенного характера. Изучению же неблагоприятного влияния подобных соединений на зрение не уделяется должного внимания как гигиенистами, так и офтальмологами [2| из-за отсутствия методической схемы проведения экспериментов.
Из литературы известно, что для оценки раздражающего действия на орган зрения различных химических «еществ достаточно широко используются методы, основан-
1
кс. 1. Установление пороговой концентрации ТЭА-соли при однократном воздействии на передний отдел глаза кроликов через 3 сут после инсталляции. Действие на роговицу и радужку.
По оси абсцисс — концентрации вещества (в %); по оси ординат—^ эффекта (в баллах). Кружки с черным пятном — степень интенсивности помутнения роговицы; I — усредненный .результат этого изменения. Свеллые кружки — площадь поражения рого* вицы; 2 — усредненный результат. Кружки с крестиком — степень изменения радужки: 3 — усредненный результат.
ные на балльной системе [3— 6]. Однако эти методы могут быть использованы либо для решения задач гигиены труда, связанных с применением средств индивидуальной защиты кожи (мази, пасты, кремы), либо для оценки внедряемых для массового потребления косметических составов. Анализ материалов по гигиеническому нормированию химических веществ в воде показал, что лишь в отдельных работах по обоснованию ПДК делались попытки определить пороги раздражающего действия с использованием упрощенной методики Дранза.
Цель нашей работы — разработка доступной при проведении токсиколого-гигиенических экспериментов методики изучения раздражающего действия химических средств при попадании их в глаз, позволяющей не только субъектив-
Рис. 2. Установление пороговой концентрации ТЭА-соли при однократном воздействии на передний отдел глаза кроликов через 3 сут после инстилляции. Действие на конъюнктиву.
По оси абсцисс — концентрации вещества (в %); по оси ординат — эффекта (в баллах). Кружки с черным пятном — степень покраснения конъюнктивы; /— усредненный результат это-о явления Светлые кружки — отечность; 2 — усредненный результ«т. Кружки с крестиком — выделения; 3 — усредненный результат.
