CC BY
258
УДК 664.2:557.15
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА НАТИВНЫЙ КРАХМАЛ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ В ГЕТЕРОГЕННОЙ СРЕДЕ
Н.Д. ЛУКИН, доктор технических наук, зам. директора З.М. БОРОДИНА, кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник А.А. ПАПАХИН, аспирант
ВНИИ крахмалопродуктов Россельхозакадемии О.В. ШАТАЛОВА, научный сотрудник А.В. КРИВАНДИН, кандидат физико-математических наук, руководитель центра
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
E-mail: [email protected]
Резюме. При разработке технологий производства сахаристых продуктов из крахмала установлено, что скорость ферментативного гидролиза значительно возрастает в случае использования в качестве субстрата клейстеризованного крахмала. В то же время для изготовления новых видов модифицированного крахмала необходимо уточнение процесса ферментативной обработки нативного (неклейстеризованного) крахмала. В связи с этим, во ВНИИК проведены исследования по изучению действия препарата очищенной глюкоамилазы (продуцент - Aspergillus niger) на нативный крахмал различных видов в водной среде при температуре ниже начальной точки его клейстеризации. Действие фермента оценивали по накоплению растворимых сухих веществ, редуци-рующихвеществ (ГЭ), ихуглеводному составу в реакционной смеси в процессе гидролиза и виду зерен крахмала на сканирующем электронном микроскопе Tescan Mira LMU. Распределение сухих веществ крахмала различных видов при действии глюкоамилазы в процессе гидролиза в условиях опытов (t=55 С, рН=4,3, т =72 ч) свидетельствует, что зерновые крахмалы переходят в раствор на 55...58 %, картофельный - на 21 %. Растворимые сухие вещества в жидкой фракции смеси на 95.98 % представлены глюкозой, что указывает на возможность использования этого процесса при производстве глюкозы кристаллической, глюкозно-фруктозных сиропов, пищевых кислот и др. Твёрдая фракция реакционной смеси - негидролизованный крахмал, поверхность зёрен которого при сохранении формы имеет повреждения с образованием глубоких впадин (пор) и продольных канавок от центра к периметру. Полученный в результате ферментативной обработки модифицированный крахмал идентифицицирован как пористый, обладающий высокой адсорбционной способностью к различным функциональным ингредиентам.
Ключевые слова: нативный крахмал, глюкоамилаза, ферментативный гидролиз, растворимые вещества, углеводный состав, осадок, остаточный крахмал, глюкозный эквивалент.
Создание новых высокоэффективных технологий переработки растительного крахмалсодержащего сырья, обеспечивающих расширение ассортимента продукции, - одно из важнейших направлений развития крахмалопаточной отрасли.
Ежегодное производство в сельском хозяйстве разных видов крахмалоносов позволяет вырабатывать из них продукты, обладающие различными физикохимическими свойствами.
Структура и свойства крахмала могут изменяться в заданном направлении в результате физического, химического, биологического или комбинированного воздействия, что позволяет создавать на его основе большой спектр модифицированных и сахаристых продуктов, используемых в различных отраслях экономики.
Одно из основных направлений изменения свойств крахмала - его полный или частичный гидролиз с применением амилолитических ферментов в качестве катализаторов белковой природы.
В результате многочисленных исследований ферментативного гидролиза крахмала в России и за рубежом установлено, что на скорость реакции, степень гидролиза и свойства получаемых продуктов оказывают непосредственное влияние вид ферментов, их происхождение, степень очистки от сопутствующих белковых веществ, свойства и механизм действия, а также вид крахмала и его физико-химические и структурные параметры [1...3].
При изучении действия амилаз на крахмал при проведении гидролиза было установлено, что активность ферментов и, следовательно, скорость процесса резко возрастают в случае использования в качестве субстрата клейстеризованного крахмала.
Это положение легло в основу разработки технологий производства модифицированного крахмала, мальтодекстринов, патоки с различным углеводным составом, кристаллической и гранулированной глюкозы, глюкозно-фруктозного сиропа.
В последние годы возрастает интерес к изучению действия ферментов на нативный крахмал с целью расширения ассортимента крахмалопродуктов, в частности, модифицированного крахмала.
При проведении исследований было установлено, что из амилолитических ферментов наибольшее воздействие на нативный крахмал проявляет глюкоамилаза (КФ 3.2.1.3), гидролизующая а-1,4- и а-1,6-гликозидные связи путем отщепления молекул глюкозы с нередуцирующего конца молекулы крахмала [2.4].
Цель нашей работы - исследование процесса биоконверсии нативного крахмала различных видов с применением глюкоамилазы для разработки технологии производства новых видов крахмалопродуктов: ферментативно модифицированного крахмала и глюкозного концентрата с ГЭ 97,5-98,5.
Условия, материалы и методы. Объект исследований - промышленные образцы крахмала: кукурузный, картофельный, пшеничный и кукурузный амилопектиновый (табл. 1).
Таблица 1. Характеристика испытуемых образцов крахмала
Наименование Содержание
сухих веществ, % белка, % к СВ растворимых веществ, % к СВ
Кукурузный ами-
лопектиновый 89,20 0,22 0,23
Картофельный 90,20 0,10 0,21
Кукурузный 87,80 0,48 0,23
Пшеничный 90,60 0,43 0,36
В качестве катализатора гидролиза нативного крахмала использовали концентрированный препарат очищенной глюкоамилазы (продуцент - Aspergillus niger) Optidex L-400 (США).
Методика проведения опытов по ферменативному гидролизу испытуемых образцов крахмала включала следующие операции:
приготовление водной суспензии крахмала с концентрацией сухих веществ (СВ) 35 %, рН 4,3;
внесение раствора препарата глюкоамилазы (1:50) в количестве 15 ед. ГлС/г СВ крахмала;
Таблица 2. Результаты опытов по биоконверсии нативного крахмала раз-
личных видов с применением препарата глюкоамилазы Optidex L-400
Характеристика жидкой фракции
Наименова- ние CQ С% инкубация, ч углеводный состав, % к СВ РВ
глюкоза маль- тоза ВМС* % к СВ % к СВ фильтрата
Кукурузный 16,9 8 97,74 1,38 0,88 98,58 16,66
амилопекти- 21,3 24 96,53 2,78 0,69 98,22 20,92
новый 22,3 32 96,16 3,18 0,65 98,10 21,88
23,9 48 95,18 4,21 0,61 97,7 23,35
25,5 72 94,3 5,02 0,68 97,3 24,81
Картофель- 6,0 8 95,03 1,13 3,84 95,70 5,74
ный 8,0 24 95,04 1,92 3,04 96,20 7,70
8,4 32 95,06 2,70 1,62 96,70 8,12
9,9 48 95,00 2,73 2,30 96,60 9,56
11,6 72 94,40 3,20 2,41 96,30 11,17
Кукурузный 15,9 8 97,67 1,49 0,84 95,70 15,22
20,3 24 96,37 3,09 0,54 98,20 19,93
21,5 32 95,80 3,68 0,53 98,00 21,07
23,1 48 95,62 4,38 0,00 98,30 22,71
24,7 72 94,00 6,07 0,00 97,50 24,08
Пшеничный 16,2 8 98,31 1,70 0,00 99,3 16,09
19,6 24 95,80 4,23 0,00 98,35 19,28
20,5 32 95,00 5,04 0,00 98,03 20,10
21,8 48 94,75 5,25 0,00 98,00 21,36
23,9 72 92,60 7,42 0,00 97,10 23,21
*ВМС - высокомолекулярные сахариды
инкубация смеси на перемешивающем устройстве при 100 колебаниях в минуту в течение 72 ч при температуре 1=55±1°С (ниже начальной точки клейстеризации крахмала);
разделение смеси путем вакуум-фильтрования на осадок и фильтрат с последующей промывкой осадка водопроводной водой;
высушивание осадка при температуре 45.50 °С и измельчение на лабораторной мельнице ЛЗМ.
В процессе инкубации через определенный промежуток времени отбирали пробы гидролизата и фильтровали. В фильтрате определяли содержание сухих веществ (СВ), растворимых углеводов (углеводный состав и ВЭЖХ) и редуцирующих веществ (ГЭ, % к СВ).
Во влажном и сухом осадках (негидролизованный крахмал) определяли содержание сухих и растворимых веществ.
В работе применяли следующие методы и приборы: определение количества и углеводного состава растворимых сухих веществ в фильтратах - жидкостная хроматография на анализаторе углеводов с рефрактометрическим датчиком фирмы Bischoff, модель 8120 и рефрактометр ИРФ-454Б2М;
определение формы и вида зерен остаточного крахмала (осадка) - на микроскопе DMLM и сканирующем электронном микроскопе марки Tescan Mira LMU;
определение количества растворимых веществ в осадке методом ШОХа; определение показателей величины рН, сухого вещества, белка и др. - по принятым в крахмалопаточном производстве методикам.
анализ надмолекулярной структуры крахмала - на рентгеновском дифрактометре с линейным позиционночувствительным детектором (излучение CuKa, Х=1,542 А). Результаты и обсуждение. Результаты изучения динамики накопления растворимых сухих веществ, в том числе углеводов, в жидкой фракции в процессе биоконверсии нативного крахмала различных видов при температуре ниже начальной точки их клейстеризации (55 °С) с применением препарата очищенной глюкоамилазы из Asp. niger Optidex L-400 согласуются с аналогичными данными зарубежных исследователей [5.7].
При сравнении динамики накопления растворимых сухих веществ в жидкой фракции видно, что из зерновых крахмалов заметно большей атакуемостью ферментом при заданных условиях исследований отличается кукурузный амилопектиновый крахмал, что, вероятно, можно объяснить его структурными свойствами.
Из литературных источников известно, что из клубневых крахмалов большей устойчивостью к действию амилолитических ферментов на неклейстеризованный (нативный) крахмал обладает картофельный крахмал, что и подтверждается результатами наших опытов.
Анализ углеводного состава растворимых сухих веществ показывает, что максимальное содержание глюкозы в них наблюдается на начальной стадии биоконверсии (8 ч). При этом доля мальтозы для
ж
SEM HV: 1.0 kV View field: 50.0 pm
WD: 6.81 mm | |
Det: SE 10 pm
Рис. 1. Микрофотографии исходного (а) кукурузного крахмала и модифицированного (б) путем биоконверсии в присутствии глюкоамилазы ОрМех 1-400 в течение 72 ч.
Таблица 3. Распределение сухих веществ крахмала различных видов при действии глюкоамилазы в течение 72 ч
Наименование Масса СВ в пробе, г Растворимые сухие вещества СВ твердой фракции
фильтрат, г про-мои, г осадок, г % к СВ пробы* осадок, г % к СВ пробы*
Амилопектиновый 47,95 15,81 10,18 2,02 58,40 19,96 41,60
Картофельный 51,1 7,31 3,20 0,35 21,25 40,25 78,74
Кукурузный 46,2 14,82 10,00 1,24 56,40 20,15 43,6
Пшеничный 50,75 19,84 7,40 1,07 55,72 22,47 44,27
* % к СВ пробы - выход СВ крахмала в процессе биоконверсии
зерновых крахмалов составляет %, для карто-
фельного - 1,13 %, а высокомолекулярных сахаридов (ВМС) - 0,88.0,84 и 3,84 % соответственно. В растворимой фракции пшеничного крахмала ВМС в течение гидролиза не обнаружены. При увеличении продолжительности инкубации содержание мальтозы в жидкой фракции увеличивается, глюкозы и ВМС - уменьшается (табл. 2).
Концентрация редуцирующих сахаров в жидкой фракции из зерновых крахмалов составляет 97.99 %, что указывает на возможность ее использования в производстве сахаристых продуктов: патоки, глюкозы, ГФС.
На основании полученных результатов мы рассчитали распределение сухих веществ испытуемых крахмалов на растворимую и твердую фракции в процессе биоконверсии (табл. 3). Переход сухих веществ нативных зерновых крахмалов в растворимое состояние (степень гидролиза) в процессе биоконверсии составляет 55.58 %, при этом в осадке остается 42.45 % СВ. Нативный картофельный крахмал в заданных условиях опыта гидролизуется только на 21 %, в осадке остается 79 %.
Особый интерес представляет осадок негидролизованного крахмала, полученный при разделении.
Микроскопирование его образцов на сканирующем электронном микроскопе (рис. 1) показало, что зерна крахмала имеют поврежденную поверхность с образованием пор. Наблюдаются также некоторые изменения формы зерна при увеличении длительности процесса, что свидетельствует о возможном изменении свойств крахмала, то есть его модификации.
Полученные дифрактограммы показывают, что модифицированный крахмал, так же, как нативный, характеризуется А-типом х-лучевой дифракции с большей кристалличностью (рис. 2), что свидетельствует о более эффективном воздействии глюкоамилазы на аморфные участки гранулы крахмала.
Наши результаты подтверждают сведения зарубежных исследователей [8.10] по проблеме получения ферментативно модифицированного крахмала, обладающего
Литература.
1. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов, М.: «Элевар», 2000. С. 190.
2. Leach H.W., Schoch T.J. Structure of the starch granule II: Action of various amylases on granular starches // Cereal Chem. 1961. 38.
3. Лукин Н.Д. Бородина З.М. и др. Исследование процесса биоконверсии нативного кукурузного крахмала с применением различных амилолитических ферментов// Достижения науки и техники АПК. 2011. № 12. С .74-76.
4. KimuraA., Robyt J.F. Reaction of enzymes with starch granules. Kinetics and products of the reaction with glucoamylase//Carbohydr. Res. 1995. 222. 87-104.
5.Celia M.L. Franco at all. Studies on the Susceptibility of Granular Cassava and Corn Starches to Enzymatic Attack. Part I // Starch/Starke. 1987. 39. № 12. 432.
6. Whistler R.L., Microporous Granular Starch Matrix Compositions// U.S. Patent4,985,082(1991)
7. Smith J.S., Lineback D.R. Hydrolysis of Native Wheat and Corn Starch Granules by Glucoamylase from Aspergillus niger and Rhzopus niveus // Die Starke. 1976. 38. № 7. 243.
8. Yun Wu, Xianfeng Du at all. Preparation of microporous starch by glucoamilase and ultrasound //Starch/Starke. 2011. 63. 217-225.
9. Tetsuya Yamada at all. Components of the Porous Maize Starch Granule Prepared by Amylase Treatment// Starch/Starke. 1995. 46. № 9. 358-361.
10. Yao Wei Rong. Yao Hui Yuan. Adsorbent Characteristics of Porous Starch // Starch/Starke. 2002. 54. 260-263.
RESEARCH OF AMYLOLITIC ENZYMES ACTION UPON DIFFERENT KINDS OF NATIVE STARCH
IN HETEROGENOUS MEDIUM N.D. Lukin, Z.M. Borodina, A.A. Papakhin, O.V.Shatalova, V.A.Krivandin
Summary. Developing the technology of starch sweeteners, modified starches it was established that velocity of enzymatic hydrolysis is increased using substrate of pregelatinized starch. At the same time during production of new kinds of modified starches it is necessary to clarify the process of enzymatic treatment of native (not gelatinized) starch. Therefore, the researches are carried out in All-Russia Research Institute for Starch Products to study action of clarified glucoamylase (producent - Aspergillus niger) upon native starch of different kinds in aqueous medium at temperature below the initial point of its gelatinization. Action of enzyme was estimated by accumulation of soluble dry substances, reducing substances (DE), their carbohydrate content in reaction mixture during hydrolysis and studying the shape of starch grains at scanning electronic microscope Tescan Mira LMU. The data on distribution of dry substances of different starches under action of glucoamylase during hydrolysis in experimental conditions (t = 55 “С, рН = 4,3, т =72 h) has shown, that cereal starches turn into solution at 55-58%, potato starch - at 21%. Soluble dry substances in liquid fraction consist of glucose for 95-98%, which opens the possibility to use this process in production of crystalline glucose, glucose-fructose syrups, food acids, etc. Solid fraction of reaction mixture - non-hydrolyzed starch, the surface of its grains saving the shape has some damage with formation of deep cavities (pores) and longitudinal grooves from center to perimeter. Modified starch produced using enzymatic treatment is identified as porous starch with high adsorption ability to different functional ingredients.
Key words: native starch, glucoamylase, enzymatic hydrolysis, soluble, carbohydrate content, sediment, sedimented starch, dextrose equivalent.
о. j ГГс? ГГ51 2Г01 2З з.о'
Sr l/nm
•Starch modyfied (num.2) 06221012.dgl x 1/lnK
larch nat 1 '-'e \ num ■ 41 и 1 ^ ■ dq 1 x 1 1 nK
Рис. 2. Дифрактограммы модифицированного (1) и нативного (2) кукурузного крахмала.
значительной адсорбционной способностью (пористого крахмала) путем биоконверсии нативного крахмала с применением амилолитических ферментов при температуре ниже начальной точки клейстеризации.
Выводы. В результате проведенных исследований установлено, что при действии глюкоамилазы на крахмал в нативном состоянии в водной среде при температуре ниже начальной точки клейстеризации наибольшей атакуемостью обладают зерновые крахмалы (амилопектиновый, обычный кукурузный, пшеничный), наименьшей - картофельный. Так, переход сухого вещества зерновых крахмалов в растворимое состояние (степень гидролиза) в процессе биоконверсии составляет 55.58 %, а картофельного - 20.21 %.
При разделении реакционной смеси получена жидкая фракция, сухие вещества которой на 96.98 % представлены глюкозой, и твердая фракция - оставшийся нерастворенным крахмал, обладающий высокой пористостью, что свидетельствует о возможном изменении его свойств, то есть о модификации.
