Исследование процесса биоконверсии нативного кукурузного крахмала с применением различных амилолитических ферментов Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

УДК 664.2:557.15

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА БИОКОНВЕРСИИ НАТИВНОГО КУКУРУЗНОГО КРАХМАЛА С ПРИМЕНЕНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Н.Д. ЛУКИН, доктор технических наук, зам. директора

З.М. БОРОДИНА, кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник

Т.В. ЛАПИДУС, зав. лабораторией И.Г. МАННОВА, старший научный сотрудник В.А. ГУЛАКОВА, старший научный сотрудник ВНИИ крахмалопродуктов Россельхозакадемии E-mail: arris@rol.ru

Резюме. Для увеличения ассортимента крахмалопродуктов, в частности модифицированных крахмалов и сахаристых продуктов проведены исследования по изучению действия известных на рынке РФ препаратов амилолитических ферментов (альфа-амилазы, бета-амилазы и глюкоамилазы) на нативный кукурузный крахмал в водной среде при температуре ниже начальной точки клейстеризации крахмала. В опытах варьировали дозировку препаратов и продолжительность инкубации смеси суспензии крахмала концентрацией 35 % сухих веществ (СВ) с ферментами в термостатируемом резервуаре с постоянным перемешиванием при температуре 50 °С и оптимальной для каждого препарата величине рН суспензии.

Действие ферментов характеризовали содержанием растворимых СВ, в том числе углеводов, в субстрате и изучением вида зёрен крахмала на световом электронном микроскопе DMLM. Динамика накопления растворимых СВ и углеводов в процессе ферментативного гидролиза нативного кукурузного крахмала была аналогичной. Следовательно, оба показателя можно использовать для контроля степени гидролиза. Бактериальная альфа-амилаза из Bac.subtilis (препаратBAN480L) при недостаточно высокой температуре опыта для этого препарата (50 °С) практически не растворяет цельные зёрна крахмала, но может действовать на повреждённые зёрна; солодовая бета-амилаза в композиции с грибной альфа-амилазой (Spezyme DBA) оказывает заметное действие на нативный крахмал при значительных дозировках (2,0 % к СВ и выше); глюкоамилаза (продуцент - Asp.niger) в композиции с грибной альфа-амилазой (продуцент - Asp.oryzae) гидролизует нативный кукурузный крахмал с наибольшей активностью при экономически приемлемых дозировках(от 0,1 до 0,5 % к СВ крахмала).

Ключевые слова: амилолитические ферменты, нативный крахмал, степень гидролиза, растворимые сухие вещества, углеводный состав.

Крахмал - природный полисахарид, который содержится в различных органах растений. В силу уникальных особенностей и свойств его вырабатывают в значительном количестве во всем мире (более 60 млн т) и используют для пищевых, фармакологических, технических и других целей.

В России крахмал производят в основном из кукурузы, картофеля и пшеницы.

Структуру и свойства крахмала можно легко изменить в заданном направлении путем физического, химического, биологического или комбинированного воздействия, что позволяет создавать на его основе большой спектр модифицированных и сахаристых продуктов.

Одно из основных направлений изменения свойств крахмала - полный или частичный гидролиз с использованием в качестве катализаторов разбавленных кислот или биологических веществ белковой природы - амилолитических ферментов.

Большое и неоспоримое достоинство амилаз перед химическими катализаторами - воздействие при атмосферном давлении, температурах от 20 до 110 оС, рН в

диапазоне от 4 до 8, а также в большинстве случаев исключительно высокая субстратная специфичность [1, 2].

В результате многочисленных исследований ферментативного гидролиза крахмала в нашей стране и за рубежом установлено, что на скорость реакции, степень гидролиза и свойства получаемых продуктов непосредственно влияют вид ферментов, их происхождение, степень очистки от сопутствующих белковых веществ, свойства и механизм действия, а также вид, физикохимические и структурные свойства крахмала.

Ранее было установлено, что активность ферментов и соответственно скорость гидролиза резко возрастают при использовании в качестве субстрата клейстеризованного крахмала. Это легло в основу разработки технологий производства таких продуктов, как мальтодекстрины, патока различного углеводного состава, глюкоза и глюкозно-фруктозные сиропы.

В последние годы вырос интерес к изучению влияния ферментов на нативный (неклейстеризованный) крахмал для дальнейшего увеличения ассортимента крахмалопродуктов, в частности, модифицированных крахмалов.

Цель нашей работы - исследование процесса биоконверсии нативного кукурузного крахмала с применением препаратов различных амилолитических ферментов.

Условия, материалы и методы. В качестве сырья для исследований использовали кукурузный крахмал (ГОСТ 51985-2002) с массовой долей влаги 11,2 %, растворимых веществ - 0,18 % от сухого вещества (СВ). В работе применяли имеющиеся на рынке РФ концентрированные препараты ферментов различного происхождения: бактериальной альфа-амилазы BAN480L (продуцент - Bac.subtilis);

солодовой бета-амилазы и грибной амилазы (продуцент - Asp. oryzae) Spezyme DBA;

глюкоамилазы (продуцент - Asp. niger) и грибной амилазы (продуцент - Asp. oryzae) Stargen 001.

Методика проведения опытов по ферментативному гидролизу нативного крахмала включала следующие операции:

приготовление смеси водной суспензии крахмала с требуемыми величинами рН, концентрации сухих веществ и испытуемых ферментных препаратов;

инкубация в жидкостном термостате с перемешивающим устройством при температуре ниже точки начала клейстеризации крахмала;

разделение смеси путём вакуум-фильтрования на осадок (твёрдая фракция) и фильтрат (жидкая фракция) с последующей промывкой осадка водой или без неё;

высушивание осадка при температуре не более 55 оС с последующей термообработкой при температуре 100...130 оС в течение 40...60 мин для инактивации ферментов;

измельчение осадка на лабораторной мельнице ЛЗМ-1М.

Суспензию крахмала с концентрацией сухих веществ 35 % готовили путём разведения навески в рассчитанном объёме воды. Величину рН суспензии до значения, оптимального для действия испытуемого ферментного препарата, доводили раствором HCl. Сосуд с суспензией взвешивали, помещали в жидкостной термостат, нагрева__ Достижения науки и техники АПК, №12-2011

ли при постоянном перемешивании до температуры 50 оС и вносили расчётное количество испытуемого ферментного препарата. В опытах варьировали вид и дозировку фермента, температуру и продолжительность инкубации. В процессе инкубации через определённый промежуток времени отбирали пробы гидролизата, взвешивали, определяли массовую долю сухих веществ и фильтровали под вакуумом до прекращения выделения фильтрата. Фильтрат взвешивали и определяли содержание сухих веществ и растворимых углеводов методом ВЭЖХ, редуцирующих веществ - методом Лейна-Эйнона. Полученный при разделении осадок - модифицированный нативный крахмал анализировали. Микрофотографирование зёрен крахмала осуществляли на световом электронном микроскопе DМLМ. Опыты проводили в 3-х повторностях, в работе приведены средние величины.

На основании анализа литературных источников и ранее проведённых ВНИИ крахмалопродуктов работ в области ферментативного гидролиза и модификации крахмала [3, 4] научный и практический интерес представляло изучение влияния препарата бактериальной альфа-амилазы-эндоамилазы, действие которой на крахмал приводит к быстрому уменьшению молекулярной массы субстрата и его вязкости, что важно для оценки технологических показателей процесса переработки крахмала и свойств получаемых продуктов. Исследования проводили при инкубации суспензии (рН 6,3) с препаратом BAN480L (дозировка 1,0 % к СВ) в течение 6 ч.

На следующем этапе работы были поставлены сравнительные эксперименты по изучению влияния на нативный крахмал испытуемых ферментных препаратов в дозе 1 % от СВ крахмала и оптимальной величине рН суспензии.

В заключение мы изучили действие различных доз препаратов Бреіуте DBA (1, 2 и 2,5 % от СВ крахмала) и Біагдеп 001 (0,1, 0,25 и 1 % от СВ крахмала) на нативный кукурузный крахмал в зависимости от продолжительности инкубации смеси.

Результаты и обсуждение. Полученные результаты свидетельствуют о незначительном воздействии бактериальной альфа-амилазы на нативные зёрна крахмала.

При накоплении растворимых сухих веществ в суспензии при инкубации с препаратом BAN480L в течение 6 ч от 0,18 до 2,8 % к СВ, содержание растворимых углеводов составляет всего 1,3 % (табл.

1). Микроскопирование полученных осадков не показало заметных изменений формы и вида поверхности цельных зёрен крахмала.

Достижения науки и техники АПК, №12-2011

Полученные результаты сопоставимы с литературными [3, 5] и могут быть связаны как с происхождением и свойствами фермента, так и со свойствами крахмала.

Сравнительное изучение действия испытуемых препаратов (рис. 1) подтвердило выводы зарубежных

50

и

2. 0 2 4 6 8

Продолжительность гидролиза,ч

Рис.1. Динамика накопления растворимых сухих веществ в гидролизатах при действии различных амилолитических ферментов на нативный крахмал. Дозировка препарата 1 %

от СВ крахмала: —-ВАЫ4801_; -о- -БрегутеОВА; -*-------

51агдеп 001

исследователей о наиболее эффективном воздействии на нативный крахмал глюкоамилазы грибного происхождения как в чистом виде, так и в композиции с грибной альфа-амилазой [6]. Накопление растворимых углеводов в гидролизатах происходило аналогично накоплению растворимых СВ.

Углеводный состав фильтратов, образовавшихся при биоконверсии нативного крахмала под влиянием испытуемых ферментов (табл.

2), аналогичен получаемым при их действии на клей-стеризованный кукурузный крахмал. Для обоснования присутствия фруктозы необходимо проведение дополнительных исследованиях. Возможно, ее используют в качестве консерванта-наполнителя при производстве концентрированных ферментных препаратов.

Микроскопирование осадков крахмала показало, что при действии препарата Бре2уте DBA происходят некоторые изменения поверхности особо крупных зёрен (в

центре и по направлению к периметру), а под влиянием Таблица 2. Углеводный состав фильтратов в процессе биоконверсии на-

тивного кукурузного крахмала

Наименование Продол- Углеводный состав % от СВ

1 а* а!.? 383

фермента (препарата) жительность, ч фруктоза глюкоза мальтоза мальто- триоза

Бактериальная 2 4,87 7,94 11,47 18,66 57,06

альфа-амилаза 4 4,07 7,77 13,63 19,28 55,25

(ВАЫ480Ц 6 3,12 6,78 14,42 20,55 55,13

Солодовая бета- 2 - - - - -

амилаза + грибная 4 2,70 0,0 64,40 16,85 16,08

альфа-амилаза (Spezyme DBA) 6 2,56 0,0 70,05 11,76 15,64

Глюкоамилаза + 1 0,00 97,70 0,93 0,00 1,37

грибная альфа- 3 0,00 97,80 1,35 0,00 0,85

амилаза 5 0,00 97,11 2,23 0,00 0,67

^агдеп 001) 7 0,00 96,70 2,70 0,00 0,61

75

Таблица 1. Результаты опытов по биоконверсии нативного кукурузного крахмала с применением препарата BAN480L

Продолжительность инкубации, ч Характеристика продуктов

гидролизат осадок фильтрат

С г , растворимые, % к СВ крахмал СВ, % углеводы, % к СВ

СВ углеводы общий, % к СВ с попр., % к СВ [сС^20

0 35,0 0,18 - 99,2 99,2 184,4 — —

2 35,1 2,0 0,8 98,7 98,4 183,2 2,0 42,9

4 35,2 2,4 1,1 98,2 98,0 181,9 2,7 44,8

6 35,3 2,8 1,3 96,0 95,0 177,0 3,2 44,8

СВг- сухие вещества гидролизата

препарата Б1агдеп 001 на большинстве зёрен образуются впадины и радиальные канавки на их поверхности.

При дозе препарата Бре2уте DBA 1 % от СВ крахмала за 6 ч инкубации в гидролизате накапливается всего 1,87 % растворимых СВ, в случае ее увеличения до 2,0 % накопление растворимых сухих веществ достигает уже 10,1 % от СВ крахмала, а при 2,5 % - превышает 11 % (рис. 2).

Рис. 2. Динамика накопления растворимых сухих веществ в гидролизатах при действии препарата Брегуте РВА в за-висимостиотдозировки(%отСВкрахмала): —— 1,0; —■—

Накопление растворимых углеводов протекает аналогично. Уже через 4 ч инкубации скорость перехода СВ крахмала в растворимое состояние (скорость гидролиза) значительно снижается. Для объяснения полученных данных можно рассматривать влияние известных факторов на скорость ферментативного гидролиза нативного крахмала в присутствии солодовой бета-амилазы и грибной альфа-амилазы.

Сравнение действия комплексного препарата глюкоамилазы с альфа-амилазой Б1агдеп 001 на накопление растворимых СВ крахмала и углеводов в гидролизате нативного крахмала с результатами влияния препарата бета-амилазы с грибной альфа-амилазой Бре2уте DBA свидетельствует, что глюкоамилаза проявляет более высокую активность. Так, при самой низкой из изученных доз препарата Б1агдеп 001 (0,1 % от СВ крахмала) содержание растворимых СВ в гидролизате, представленных в основном растворимыми углеводами, за 6 часов инкубации составило соответственно 8,5 % (рис. 3) и 8,4 % от СВ гидролизата, а с препаратом Бре2уте DBA в дозе 1 % от СВ крахмала - только 1,87 (см. рис. 2) и 1,13 %.

Характер кривых накопления растворимых сухих веществ и углеводов в процессе ферментативного гидролиза нативного кукурузного крахмала был аналогичен.

Рис. 3. Динамика накопления растворимых сухих веществ в гидролизате при действии препарата Б1агдеп 001 в зависимости от дозировки (% от СВ крахмала): —-0,1; -

Следовательно, оба показателя можно использовать для контроля степени гидролиза.

На микрофотографиях образцов осадка, полученного при действии препарата Б1агдеп 001 в течении 6 часов в дозе 0,1 % от СВ крахмала, наблюдаются некоторые изменения формы зёрен крахмала и повреждённость их поверхности с образованием впадин и продольных канавок от центра к периметру.

Полученные результаты, характеризующие действие основных амилолитических ферментов в процессе гидролиза на нативный крахмал при температуре ниже начальной точки его клейстеризации, хорошо согласуются с аналогичными сведениями зарубежных исследователей [3, 5].

Выводы. Исследования процесса биоконверсии нативного крахмала с применением амилолитических ферментов показали, что бактериальная альфа-амилаза из Ваа.виЫШв (препарат BAN480L) практически не действует на цельные зёрна крахмала. Незначительное накопление растворимых сухих веществ во время инкубации можно объяснить недостаточной для этого препарата температурой окружающей среды при проведении опыта (50 0С, при оптимальной 80...85 0С), а также наличием примесей крахмала и повреждённых зёрен, доступных для действия фермента.

Солодовая бета-амилаза в композиции с грибной альфа-амилазой (препарат Бре2уте DBA) оказывает заметное действие на нативный крахмал при значительных дозах (2,0 % от СВ и выше);

Глюкоамилаза в композиции с грибной альфа-амилазой гидролизует нативный кукурузный крахмал при экономически приемлемых дозах от 0,1 до 0,5 % от СВ крахмала.

Литература.

1. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. - М.: Наука, 1986. - Гл.5,6.

2. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - М.: НПО «Элевар», 2000. - С.190.

3. Xia Li at al. Granule structural, crystalline, and thermal changes in native Chinese yam starch after hydrolysis with two different enzymes -a-amylase andgluco-amylase//Starch/Starke. - 63(2011).- S.75-82.

4. Celia M.L.Franco, Sao lose do Rio Preto and C.F.Ciacco. Studies on the Susceptibility of Granular Cassava and Corn Starches to Enzymatic Attack. Part 1 // Starch/Starke. - 39 (1987).- № 12.- S.432.

5. Celia M.L.Franco, Sao lose do Rio Preto and C.F.Ciacco. Studies on the Susceptibility of Granular Cassava and Corn Starches to Enzymatic Attack. Part 2// Starch/Starke. - 40 (1988).-№ 1.-S.29.

6. Arasaratham V. and Balasubramaniam K. Synergistic Action of a-Amylase and Glucoamylase on Raw Corn // Starch/Starke. -45 (1993). - № 6.- S.226.

STUDY OF BIOCONVERSION OF NATIVE CORN STARCH USING DIFFERENT AMYLOLYTIC

ENZYMES

N.D. Lukin, Z.M. Borodina, T.V. Lapidus, I.G. Mannova, V.A. Gulakova

Summary. In order to increase the variety of starch products, particularly, modified starches and starch sweeteners for further substitution of import the researches were carried out to study the action of known at Russian market enzymes (alpha-amylase, beta-amylase and glucoamylase) into native corn starch in aquous medium at temperature lower than initial point of starch gelatinization. The dosage of 76 ----------------------------------------- ____________ Достижения науки и техники АПК, №12-2011

enzymes was varied and duration of incubation of mixture of starch slurry with 35% DS content with enzymes in ternostated capacity with constant mixing at temperature of 50 oC and optimal for each enzyme pH of slurry.

Action of enzymes was characterized by content of soluble dry substances, including carbohydrates in substrate and studying of starch grain shape by light electronic microscope DMLV by Leica.

As experiments showed, the dynamics of soluble dS and carbohydrates accumulation in process of enzymatic hydrolysis of native corn starch is similar. Therefore, both parameters could be used to control the degree of hydrolysis. The studies of bioconversion of native starch using amylolitic enzymes showed, that bacterial alpha-amylase from Bac.subtilis (bAn 480L by Novozymes) at sufficiently high temperature for this enzyme (500C) does not dissolve whole grains of starch, but can affect on damaged grains; malt beta-amylase in composition with fungal alpha-amylase (Spezyme DBA by Genencor) has a significant effect on native starch at large dosages (2,0% to DS and higher); glucoamylase (producer - Asp.niger) in composition with fungal amylase (producer - Asp.oryzae) hydrolyzes native corn starch with the most activity at economically efficient dosages (from 0,1 to 0,5% to DS of starch).

Key words: amylolytic enzymes, native starch, level of hydrolysis, soluble dry substances, carbohydrate content.

УДK 664.162:557.15

ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО РАЗЖИЖЕНИЯ КРАХМАЛА

В.В. АНАНСКИХ, кандидат технических наук, зав. лабораторией

Л.Д. ШЛЕИНА, ведущий научный сотрудник Л.Ю. ВОРОНОВА, младший научный сотрудник ВНИИ крахмалопродуктов Россельхозакадемии E-mail: arris@rol.ru

Резюме. В работе представлены результаты изучения ферментативного гидролиза крахмала при оптимизации условий работы трубчатого выдерживателя непрерывного осахарива-теля крахмала (НОК). Созданная во ВНИИК пилотная установка позволила провести испытания НОК с выдерживателями диаметром (Ду) 15, 25 и 56 мм. Концентрация крахмальной суспензии, направляемой на разжижение в разварникпри непрерывном смешивании с потоком водяного пара, составляла 35 %, температура разваривания - 110 оС, температура разжижения - 95 оС. Оценивали глюкозный эквивалент(ГЭ) и вязкость полученных гидролизатов. По результатам испытаний НОКпо-строены графические зависимости изменения ГЭ и вязкости гидролизатов от дозировки a-амилазы (от 0,2до 0,6 ед.АС/г), диаметра трубопровода выдерживателя и продолжительности разжижения (от 5 до 120 мин). Анализ полученных результатов показывает, что ГЭ гидролизата увеличивается с повышением дозировки ферментного препарата и продолжительности разжижения. Кроме того, он возрастает с увеличением скорости движения продукта в выдерживателе, то есть с уменьшением диаметра трубопровода. Так, в выдерживателе с Ду 25 при дозировке a-амилазы 0,2 ед.АС/г значения ГЭ в 1,2 раза больше, чем при дозировке a-амилазы 0,6 ед.АС/г в выдерживателе Ду 56. Изменение значений вязкости носит противоположный характер: чем меньше диаметр трубопровода выдерживателя, тем меньше вязкость гидролизата. При разваривании крахмала в выдерживателях разного диаметра основные изменения качественных характеристик гидролизата наблюдались при температуре 110 оС в течение первых 5 мин. Дальнейшее разжижение при температуре 95 оС в течение 120 мин имело примерно одинаковый затухающий характер. Подтверждено предположение о том, что с уменьшением диаметра трубопровода и увеличением скорости движения продукта в выдерживателе можно значительно снизить расход ферментного препарата на разжижение крахмала. Результаты испытаний учтены при подборе и расчёте конструктивных и технологических параметров и изготовлении промышленной установки НОК.

Ключевые слова: крахмал, разварник, клейстер, ферментативное разжижение, выдерживатель, диаметр трубопровода.

Ферментативный гидролиз крахмала в процессе получения сахаристых веществ проводится в две стадии - ферментативное разжижение и ферментативное осахаривание разжиженного крахмала.

Достижения науки и техники АПК, №12-2011 __

Разжижение крахмала можно также условно разбить на два этапа: клейстеризация и разжижение. Температурная клейстеризация почти всегда совмещена с частичным разжижением, когда под действием катализатора длинные цепочки молекул, образующие высоковязкий клейстер, разрываются на более короткие [1]. При этом вязкость клейстера снижается в несколько раз - крахмал разжижается. Процесс разжижения оказывает большое влияние на качество конечного продукта. Неполностью клейстеризованный крахмал при разжижении снижает выход продукта и ухудшает фильтрационную способность гидролизата.

Течение ферментативной реакции зависит от многих факторов - температуры, рН среды, наличия ингибиторов и активаторов, концентрации фермента и крахмальной суспензии, интенсивности межмоле-кулярного взаимодействия. Реакционная способность при увеличении температуры растет, но после превышения ее оптимальной величины происходит необратимая денатурация ферментов.

Разваривание крахмала с использованием ферментного препарата термостабильной а-амилазы проводится при температуре не более 107.110 оС. При разжижении крахмала в начале разваривания, во время контакта его суспензии с потоком водяного пара, вязкость продукта резко возрастает, а взаимодействие с ферментным препаратом ухудшается, в связи с чем необходимо увеличивать дозировку а-амилазы.

Технологическая схема установки непрерывного осахаривания крахмала на участке его ферментативного разжижения включает последовательно соединенные трубопроводами отдельные агрегаты: сборники для подготовки крахмальной суспензии, узел разваривания, выдерживатель, регулятор давления, испаритель и реакторы разжижения.

Основной элемент разжижающей установки - раз-варник. В нем происходит непрерывное смешивание крахмальной суспензии с водяным паром. При этом крахмал переходит в растворимое состояние - клейсте-ризуется и в таком виде подается в выдерживатель.

Выдерживатель предназначен для окончательного перехода мелких зерен крахмала в клейстеризован-ное состояние с последующим началом стадии разжижения. При этом вязкость продукта снижается, что

-------------------------------------------- 77