CC BY
6
нейропротекторного действия ВВ в моделях ЧМТ и гипоксии-ишемии новорожденных (ГИ), а также в моделях in vitro с использованием первичной культуры нейроглии.
МСК выделяли из послеродовой плаценты человека, кондиционную среду подвергали дифференциальному центрифугированию (10000g, 108000g) и конечный осадок ВВ ресуспендировали в фосфатном буфере.
Курсовое интраназальное введение ВВ значимо снижало объем повреждения головного мозга в двух экспериментальных моделях, что сопровождалось восстановлением сенсомоторынх функций, что свидетельствует о влияние на нейропластичность ВВ. В модели кислородно-глюкозной депривации (КГД) in vitro ВВ предотвращали кальцивею перегрузку как нейронов, так и астроцитов и последующую гибель клеток. В смешанной культуре нейроглии ВВ индуцировали опосредованные рецептором инозитол трифосфата (IP3) осцилляцию Ca2+ в астроцитах, связанную с адаптацией к перегрузке кальцием не только в астроцитах, но и в совместно культивируемых нейронах, демонстрируя межклеточные положительные взаимодействия между данными клетками. Было показано, что ингибиторы PI3K вортманнин и LY-294002 полностью отменяли защитный эффект ВВ в модели КГД. Это означает, что передача сигналов PI3K/AKT является одним из основных путей опосредованной ВВ защиты нервных клеток, подвергшихся ише-мическому воздействию. Компоненты этого сигнального пути были идентифицированы среди наиболее обогащенных категорий в протеоме ВВ. Работа поддержана грантом РФФИ № 20-015-00414.
Литература:
1. Reed SL, Escayg A. Neurobiology of Disease. 2021. V. 157. P.
105445
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ ПЛЕНОК С ДОБАВЛЕНИЕМ ОЛИГОПЕПТИДОВ И ГЛИКОПРОТЕИНОВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК
Д.В. Силин, Г.А. Власова, Е.В. Скорб, С.А. Уласевич
Университет ИТМО, Санкт-Петербург, Россия e-mail: silin@infochemistry.ru
Ключевые слова: муцин, полиэлектролитные слои, биосовместимость, клеточная пролиферация.
Одна из основных проблем в регенеративной медицине и биотехнологии — скорость заживления внутренних повреждений (например, при операциях на сосудах). Для её решения используются различные подходы от хирургического вмешательства, до использования материалов на основе синтетических и природных материалов [1-3].
В связи с этим, целью исследования является разработка биосовместимых материалов на основе полиэлектролитов и природного муцина улитки Helix pomatia для ускорения регенерации. Основу материалов планируется создать из послойно осажденных полиэлектролитов, в которые для повышения их биосовместимости вводится муцин.
Последовательное осаждение полиэлектролитов проводили на подложке из предварительно обезжиренного стекла. В качестве первого слоя наносили поли-этиленимин (PEI) с последующим осаждением на него полистирол сульфоната (PSS). Каждый слой осаждали в течение 15 мин с последующим промыванием в дистиллированной воде. Муцин улитки Helix pomatia добавляли в раствор полимера в концентрации 0,2 мг/мл. Для
дополнительного увеличения биосовместимости слой муцина в некоторых образцах осаждался дополнительно. Биосовместимость клеток исследовали с помощью постнатальных фибробластов человека (ПФЧ) и линии С2С12. (мышечная ткань мыши)
Предварительные тесты показали, что введение в ростовую среду приготовленного муцина в концентрации
0.2.мг/мл способствует увеличению скорости пролиферации постнатальных фибробластов человека в 1,3 раза по сравнению с контролем. По результатам МТТ-теста наибольший прирост жизнеспособности клеток ПФЧ наблюдали для образцов, к которым добавляли 10 мкл раствора муцина с концентрацией 0,2 мг/мл на 1,5 мл среды роста клеток.
Таким образом, полученные материалы перспективны для разработки ранозаживляющих покрытий, а также могут использоваться в биосовместимых покрытиях на перевязочных материалах для стимуляции остеогенеза. Работа выполнена в рамках проекта РНФ № 19-79-10244.
Литература:
1. Adikwu M.U., Alozie B.U. Sci. Res. Essays. 2007. V. 2. № . 6. С. 195-198.
2. Nishiyama K. et al. Biosci. Biotech. Biochem. 2015. - V. 79. № . 2. С. 271-279.
3. Allaw M. et al. Nanomedicine. 2020. - V. 15. - № . 17. - С. 1671-1685.
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ
МАТРИЦ НА ОСНОВЕ ГИБРИДНЫХ ФИБРИЛЛ
КОЛЛАГЕНОВ I И V ТИПА
М.Ю. Сироткина1, А.К. Зенкова1,
С.В. Шабельников1, А.В. Нащекин2,
Ю.А. Нащекина1
1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: m.s.778321@yandex.ru
Ключевые слова: тканевая инженерия, коллаген i типа, коллаген v типа, гибридные фибриллы, диаметр фибрилл.
Коллаген I типа основной белок внеклеточного матрикса (ВКМ). Он широко применяется в качестве материала для создания тканеинженерных матриц. Усовершенствование характеристик матрицы с сохранением её биомиметичности возможно осуществить путем изменения её микроструктуры. Диаметр кол-лагеновых фибрилл оказывает влияние на свойства ткани, например, на механические свойства в коже и сухожилиях и уменьшение светорассеяния в строме роговицы. Также существует зависимость пролиферации и адгезии клеток от диаметра фибрилл. In vivo диаметр фибрилл коллагена I типа регулируется компонентами ВКМ, среди которых коллаген V типа, который встраивается в фибриллы коллагена I типа, образуя гибридные фибриллы. Молекула коллагена V типа имеет N-концевой участок, который препятствует присоединению к фибрилле новых молекул коллагена I типа и её росту. Однако исследования показывают, что коллаген V типа, лишенный N-концевого участка, хотя и в меньшей степени, ограничивает рост фибрилл [1].
Целью работы является исследование влияния на адгезию, пролиферацию и морфологию клеток композитных матриц на основе коллагена I типа и V типа
с наличием (colV+) и отсутствием (colV-) N-концевого участка. Мы получили коллаген V типа из плаценты человека методом ферментативной экстракции методом минимизирующим его деградацию. Методом ионообменной жидкостной хроматографии осуществляли очистку и разделение коллагена V типа на фракции colV+ и colV-. Целостность белка оценивали методом имуноблоттинга. Из коллагена I и V типа создавали композитные матрицы colV+ и colV-. Методом сканирующей электронной микроскопии оценивали диаметр фибрилл. С помощью МТТ-теста, световой и флуоресцентной микроскопии, а также обработки изображений при помощи программного обеспечения ImageJ изучили адгезию и пролиферацию клеток и оценили их морфологию на композитных матрицах.
Показано уменьшение диаметра гибридных фибрилл в присутствии коллагена V типа. Для клеток роговицы линии SIRC показано, что матрицы colV+ оказывает отрицательное влияние на адгезию, образцы colV- не оказывают существенного влияния на адгезию. Для матриц colV- показано увеличение пролиферативной активности клеток с максимумом в матрицах с процентным содержанием коллагена V типа 30%. Также показано, что матрицы colV+ способствовали распластанности клеток, напротив colV-отрицательно влияли на распластанность. Коллаген V типа без коллагена I типа оказывает отрицательное влияние на пролиферацию для клеток SIRC и мезенхимных стволовых клеток. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Научного Фонда (Проект № 21-74-20120).
Литература:
1. Adachi E., Hayashi T. Connect Tissue Res. 1986. V.14. № 4. P.
257-266.
РАЗРАБОТКА БЕСФЕРМЕНТНЫХ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ОСТРОВКОВОЙ ТКАНИ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Г.Н. Скалецкая, Н.Н. Скалецкий, Г.Н. Бубенцова, В.В. Ильницкий, В.И. Севастьянов
ФГБУ НМИЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: skalink@mail.ru
Ключевые слова: кролики, поджелудочная железа, инкубация, культуры, инсулин.
Успешность аллотрансплантации островков поджелудочной железы (ПЖ) больным сахарным диабетом 1 типа зависит, главным образом, от количества и качества островков, изолируемых из ПЖ посмертных доноров с помощью ферментных препаратов, прежде всего коллагеназы [1]. При этом происходит протеолитическое разрушение внеклеточного матрикса, что приводит к морфофункциональной дезорганизации островковых клеток и значительному снижению конечного антидиабетического эффекта трансплантации островков. В связи с этим актуален поиск способов получения островковой ткани, минимизирующих интенсивность ферментной обработки ПЖ. В настоящей работе изучена возможность неприменения ферментных препаратов при выделении островковой ткани из ПЖ кроликов.
В качестве доноров использовали 60 новорожденных (1-2-дневных) и 12 одномесячных кроликов. После очистки ПЖ от видимых соединительно-тканных сосудистых структур и сосудов панкреатическую ткань измельчали глазными ножницами в течение нескольких минут, после
чего полученные микрофрагменты тщательно промывали холодным раствором Хенкса. Образовавшуюся суспензию инкубировали в среде RPMI при 37°С. Наблюдения за культурами проводили с помощью инвертированного микроскопа, и их образцы на разных сроках инкубации подвергали морфологическому исследованию. Определяли инсулинпродуцирующую активность культур (ИФА). Микроскопический контроль выявил спонтанную гибель и элиминацию экзокринной ткани в инкубируемых микрофрагментах ПЖ новорожденных кроликов и формирование шарообразных или овоидных свободно плавающих структур, в которых при иммуногистохимическом анализе были выявлены эпителиальные клетки с инсулин-позитивными гранулами. Эти данные позволили назвать их флотирующими островковоподобными культурами (ФОК). Применение описанной технологии для получения культур из ПЖ одномесячных кроликов не позволило получить островковоподобные культуры из-за невозможности избавиться от экзокринной ткани, доля которой у одномесячных кроликов на порядок превышает таковую в неонатальной ПЖ. В связи с этим впервые нами был применен гипертермический режим инкубации (38°С), который привел к быстрой гибели экзокринной ткани. В результате из ПЖ одномесячных кроликов удалось получить ФОК, аналогичные тем, которые были получены из ПЖ новорожденных кроликов. Анализ проб культуральной жидкости, взятых при инкубации ФОК, подтвердил наличие активной секреции инсулина. Таким образом, показана возможность получения островковой ткани из поджелудочной железы кроликов без применения экзогенных ферментов.
Литература:
1. Barton F.B., Rickels M.R., Alejandro R. et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 2012; 35:1436-1445.
АКТИВНОСТЬ ДЫХАТЕЛЬНОГО КОМПЛЕКСА I МИТОХОНДРИИ НЕОБХОДИМА ДЛЯ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ КЛЕТОК В ПЛЮРИПОТЕНТНОЕ СОСТОЯНИЕ: ФУНКЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ АФК ПРИ РЕПРОГРАММИРОВАНИИ
Е.В. Скворцова, И.Б. Назаров, Н.Д. Аксенов, А.Н. Томилин, С.А. Синенко
Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия. e-mail: e.skvortsova@incras.ru
Ключевые слова: Комплекс I ЭТЦ, NDUFS1, NDUFB10, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), активные формы кислорода (АФК), ротенон, антиоксиданты, супероксид-анион.
В процессе репрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) происходят существенные изменения клеточного метаболизма и сигналинга вызванного изменениями сопутствующих окислительно-восстановительных процессов [1, 2]. Мы исследовали роль комплекса-1 (К1) электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий в процессе репрограммирования фибробластов мыши в плюрипо-тентное состояние. Инактивация основной субъединицы К-1 — NADH-убихиноноксидоредуктазы S1 (NDUFS1) или вспомогательной субъединицы B10 (NDUFB10) вызывала увеличение продукции АФК в соматических и эмбриональных стволовых клетках мыши. Блокирование функций данных NADH-дегидрогеназ также приводит
