CC BY
13
с наличием (colV+) и отсутствием (colV-) N-концевого участка. Мы получили коллаген V типа из плаценты человека методом ферментативной экстракции методом минимизирующим его деградацию. Методом ионообменной жидкостной хроматографии осуществляли очистку и разделение коллагена V типа на фракции colV+ и colV-. Целостность белка оценивали методом имуноблоттинга. Из коллагена I и V типа создавали композитные матрицы colV+ и colV-. Методом сканирующей электронной микроскопии оценивали диаметр фибрилл. С помощью МТТ-теста, световой и флуоресцентной микроскопии, а также обработки изображений при помощи программного обеспечения ImageJ изучили адгезию и пролиферацию клеток и оценили их морфологию на композитных матрицах.
Показано уменьшение диаметра гибридных фибрилл в присутствии коллагена V типа. Для клеток роговицы линии SIRC показано, что матрицы colV+ оказывает отрицательное влияние на адгезию, образцы colV- не оказывают существенного влияния на адгезию. Для матриц colV- показано увеличение пролиферативной активности клеток с максимумом в матрицах с процентным содержанием коллагена V типа 30%. Также показано, что матрицы colV+ способствовали распластанности клеток, напротив colV-отрицательно влияли на распластанность. Коллаген V типа без коллагена I типа оказывает отрицательное влияние на пролиферацию для клеток SIRC и мезенхимных стволовых клеток. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Научного Фонда (Проект № 21-74-20120).
Литература:
1. Adachi E., Hayashi T. Connect Tissue Res. 1986. V.14. № 4. P.
257-266.
РАЗРАБОТКА БЕСФЕРМЕНТНЫХ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ОСТРОВКОВОЙ ТКАНИ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Г.Н. Скалецкая, Н.Н. Скалецкий, Г.Н. Бубенцова, В.В. Ильницкий, В.И. Севастьянов
ФГБУ НМИЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: кролики, поджелудочная железа, инкубация, культуры, инсулин.
Успешность аллотрансплантации островков поджелудочной железы (ПЖ) больным сахарным диабетом 1 типа зависит, главным образом, от количества и качества островков, изолируемых из ПЖ посмертных доноров с помощью ферментных препаратов, прежде всего коллагеназы [1]. При этом происходит протеолитическое разрушение внеклеточного матрикса, что приводит к морфофункциональной дезорганизации островковых клеток и значительному снижению конечного антидиабетического эффекта трансплантации островков. В связи с этим актуален поиск способов получения островковой ткани, минимизирующих интенсивность ферментной обработки ПЖ. В настоящей работе изучена возможность неприменения ферментных препаратов при выделении островковой ткани из ПЖ кроликов.
В качестве доноров использовали 60 новорожденных (1-2-дневных) и 12 одномесячных кроликов. После очистки ПЖ от видимых соединительно-тканных сосудистых структур и сосудов панкреатическую ткань измельчали глазными ножницами в течение нескольких минут, после
чего полученные микрофрагменты тщательно промывали холодным раствором Хенкса. Образовавшуюся суспензию инкубировали в среде RPMI при 37°С. Наблюдения за культурами проводили с помощью инвертированного микроскопа, и их образцы на разных сроках инкубации подвергали морфологическому исследованию. Определяли инсулинпродуцирующую активность культур (ИФА). Микроскопический контроль выявил спонтанную гибель и элиминацию экзокринной ткани в инкубируемых микрофрагментах ПЖ новорожденных кроликов и формирование шарообразных или овоидных свободно плавающих структур, в которых при иммуногистохимическом анализе были выявлены эпителиальные клетки с инсулин-позитивными гранулами. Эти данные позволили назвать их флотирующими островковоподобными культурами (ФОК). Применение описанной технологии для получения культур из ПЖ одномесячных кроликов не позволило получить островковоподобные культуры из-за невозможности избавиться от экзокринной ткани, доля которой у одномесячных кроликов на порядок превышает таковую в неонатальной ПЖ. В связи с этим впервые нами был применен гипертермический режим инкубации (38°С), который привел к быстрой гибели экзокринной ткани. В результате из ПЖ одномесячных кроликов удалось получить ФОК, аналогичные тем, которые были получены из ПЖ новорожденных кроликов. Анализ проб культуральной жидкости, взятых при инкубации ФОК, подтвердил наличие активной секреции инсулина. Таким образом, показана возможность получения островковой ткани из поджелудочной железы кроликов без применения экзогенных ферментов.
Литература:
1. Barton F.B., Rickels M.R., Alejandro R. et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 2012; 35:1436-1445.
АКТИВНОСТЬ ДЫХАТЕЛЬНОГО КОМПЛЕКСА I МИТОХОНДРИИ НЕОБХОДИМА ДЛЯ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ КЛЕТОК В ПЛЮРИПОТЕНТНОЕ СОСТОЯНИЕ: ФУНКЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ АФК ПРИ РЕПРОГРАММИРОВАНИИ
Е.В. Скворцова, И.Б. Назаров, Н.Д. Аксенов, А.Н. Томилин, С.А. Синенко
Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия. e-mail: [email protected]
Ключевые слова: Комплекс I ЭТЦ, NDUFS1, NDUFB10, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), активные формы кислорода (АФК), ротенон, антиоксиданты, супероксид-анион.
В процессе репрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) происходят существенные изменения клеточного метаболизма и сигналинга вызванного изменениями сопутствующих окислительно-восстановительных процессов [1, 2]. Мы исследовали роль комплекса-1 (К1) электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий в процессе репрограммирования фибробластов мыши в плюрипо-тентное состояние. Инактивация основной субъединицы К-1 — NADH-убихиноноксидоредуктазы S1 (NDUFS1) или вспомогательной субъединицы B10 (NDUFB10) вызывала увеличение продукции АФК в соматических и эмбриональных стволовых клетках мыши. Блокирование функций данных NADH-дегидрогеназ также приводит
к подавлению окислительного фосфорилирования и активации гликолиза [3, 4]. Ингибирование К1 с помощью shRNA к NDUFS1 или NDUFB10, или ротенона в течение всего процесса репрограммирования приводит к значительному снижению эффективности репрограммирования. Нами установлено, что уровни АФК сильно коррелируют с количеством митохондрий в процессе репрограммирования. Данные показатели достигают пика к 3-му дню, и резко снижаются к 6-му дню процесса. Снижение антиоксидантами избытка АФК в первые 3 дня репрограммирования значительно повышает эффективность репрограммирования. Однако удаление АФК в течение всего процесса или после 3-го дня репрограммирова-ния значительно подавляет процесс репрограммирования. Мы установили, что снижение уровня АФК в предшественниках ИПСК, имеющих дефицит К1, не восстанавливает, а, напротив подавляет их репрограммирование. Таким образом, сниженный уровень АФК и подавленное окислительное фосфорилирование существенно препятствует репрограммированию. Повышенный уровень АФК в клетках с нарушенной функцией К-1 не является фактором, обуславливающим снижение эффективности ре-программирования. Наши данные указывают на множественные функции АФК в процессе репрограммирования. Повышенные уровни АФК необходимы на начальном этапе, а их оптимальные уровни необходимы на последующих этапах репрограммирования. Полученные результаты также указывают, что окислительное фосфорилирование необходимо на каждой стадии данного процесса.
Благодарности: Мы благодарим В.В. Зенина и А.Н Шатрову за помощь в проведении цитофотоме-трических анализов и Банк клеточных культур ИНЦ РАН за предоставление клеток STO и МСК. Работа поддержана грантом РНФ № 20-14-00242.
Литература:
1. Folmes C.D., Nelson T.J., Martinez-Fernandez A., et al. Cell
Metab. 2011. V. 14. № 2. P. 264-71.
2. Sinenko S.A., Starkova T.Y., Kuzmin A.A., Tomilin A.N. Front.
Cell. Dev. Biol. 2021. V. 9. P. 714370.
3. Rafikov, R., Sun, X., Rafikova, O. Redox. Biol. 201 5. V. 6. P.
278-286.
4. Ni, Y., Hagras, M. A., Konstantopoulou, V. Cells. 2019. V. 8.
№ 10. P. 1149.
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (МСК) С ЦЕЛЬЮ УЛУЧШЕНИЯ НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ ИХ СЕКРЕТОМА
М.Н. Скрябина1, С.С. Джауари1, А.Л. Примак1, Н.А. Басалова1, 2, М.А. Кулебякина1, 2, В.С. Попов1, 2, А.Ю. Ефименко1, 2, А.Я. Величко1, В.А. Ткачук1, 2, М.Н. Карагяур1, 2
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт Регенеративной медицины, Медицинский научно-образовательный центр, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: МСК, секретом, генетическая модификация, редактирование генома
Применение продуктов секреции стволовых клеток для стимуляции процессов обновления и регенерации ткани является перспективным терапевтическим подходом
в регенеративной медицине. Стволовые клетки, в частности, МСК секретируют широкий спектр протективных и прорегенераторных молекул и, благодаря этому, способны обеспечивать выживание поврежденных клеток, подавлять воспаление в очаге повреждения и активировать тка-неспецифичные стволовые клетки. В то же время состав секретома клеток (в том числе и МСК) лабилен и зависит от клеточного пассажа, возраста, здоровья и физиологических особенностей донора. Более того, в состав клеточного секретома зачастую могут входить факторы, обладающие противоположной активностью, что может снижать или нейтрализовать терапевтическую активность секретома.
Применение технологий геномной модификации для усиления экспрессии целевых белков и/или микроРНК и подавления экспрессии «нежелательных» молекул с целью усиления терапевтической активности клеточного секретома выглядит перспективным подходом. Генетическая модификация клеток-продуцентов позволяет решить вопросы низкой продуктивности и стандартизации получаемого бесклеточного биомедицинского продукта, приближая момент его практического использования. При этом подход достаточно безопасен, поскольку используются не сами модифицированные клетки, а лишь продукты их секреции.
Интересным побочным эффектом генетической модификации клеток является более высокая продукция такими клетками мРНК рекомбинантных белков и/ или микроРНК в составе внеклеточных везикул (аналог мРНК генной терапии), что позволяет оказывать не только немедленный терапевтический эффект на поврежденную ткань за счет воздействия белков, но и отсроченный эффект через модификацию работы генетической программы целевых клеток.
В нашей работе была осуществлена генетическая модификация мезенхимных стволовых клеток жировой ткани человека с помощью технологий генной терапии ex vivo и редактирования генома, что позволило добиться повышения количества ключевых нейротрофических, антиапоп-тотических и проангиогенных белков и микроРНК в составе секретома МСК. Мы предполагаем, что секретом таких генетически модифицированных МСК может обладать более выраженным нейропротективным эффектом в моделях in vivo, что в настоящее время изучается на модели экспериментальной интрацеребральной гематомы у крыс.
Аналогичным образом генетическая модификация клеток-продуцентов может быть применена для получения секретомов с другими терапевтическими модальностями, например, для стимуляции остеогенеза, заживления раневых дефектов и т. д.
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕПРОГРАММИРОВАНЫХ CD8+ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ЛЕЧЕНИИ МЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО
Е.Г. Скурихин1, М.А. Жукова1, А.М. Дыгайг 2
1 НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга ФГБНУ Томский национальный исследовательский медицинский центр РАН, Томск, Россия
2 ФГБНУ НИИ общей патологии и патофизиологии, Москва, Россия
e-mail: [email protected], [email protected]
Ключевые слова: мелкоклеточный рак легкого, стволовые опухолевые клетки, опухолевые клетки, репрограммирова-ные CD8+ Т-лимфоциты, клеточная терапия.
