CC BY
70УДК 615.015.44:615.462
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ И ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННЫХ КОСТНЫХ ИМПЛАНТАТОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
© 2017 Л.Т. Волова, Д.А. Трунин, Ю.В. Пономарева, Н.В. Попов
ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Самара
Разработка костнопластических имплантатов с учетом индивидуальных особенностей пациента, расширение показаний к имплантологическому лечению, совершенствование собственно методик имплантации с привлечением технологий 3-0 моделирования и персонифицированного прототипирования остаются важнейшими задачами современной дентальной имплантологии. Для клинико-экспериментальной оценки и анализа безопасности, качества и эффективности остеопластических материалов все чаще применяют лабораторные исследования с помощью клеточных биотехнологий, поскольку тесты с использованием культур клеток признаны наиболее этичными. Проведенное авторами исследование биосовместимости и цитотоксичности персонифицированных костных имплантатов с применением культуры хондробластов человека показало, что включение в технологию изготовления этапа фрезерной обработки не приводит к изменениям первичных свойств аллогенного биоматериала из которого они получены, кроме этого изготовленные по двум разработанным технологиям персонифицированные костные имплантаты обладают высокой биосовместимостью и отсутствием цитотоксиче-ского эффекта.
Ключевые слова: культура клеток, остеопластические материалы, персонифицированные костные имплан-таты, цифровое прототипирование, цитотоксичность.
Введение. Костная ткань и условия ее репаративной регенерации (восстановления ткани после того или иного повреждения) остаются актуальными вопросами современной челюстно-лицевой хирургии. Репаративная регенерация является по своей сути усиленной физиологической, поскольку механизмы их едины и протекают на основе общих закономерностей [1].
При наличии значительных костных дефектов для их заполнения используют костнопластические материалы. По происхождению они подразделяются на биологические (ауто- и алломатериалы, ксеноматериалы, биологически активные молекулы белковой и небелковой природы, обладающие свойствами факторов роста); искусственные (синтетические) на основе три-кальций фосфата, гидроксиапатита, различных типов керамики, сульфата кальция и др.; композиционные (композиты) - это смесь (композиция) нескольких синтетических и/или биологических материалов для придания им синергичных свойств [2, 3].
Определяющее значение для репаративной регенерации и восстановления кости имеют свойства материалов для костной пластики [4, 5, 6, 7, 8, 9].
Разработка костнопластических имплантатов с учетом индивидуальных особенностей пациента, расширение показаний к имплантологическому лечению, совершенствование собственно методик имплантации с привлечением технологий 3-0 моделирования и персонифицированного прототипирования остаются важнейшими задачами современной дентальной имплантологии [10].
Костно-пластический имплантационный материал должен отвечать следующим требованиям: идентичность химического состава и архитектоники свойствам кости (зоне предполагаемой имплантации); моделируемость; резорбируемость, продленная во времени от 3 до
12 мес.; остеокондуктивность; остеоиндуктивность; замещение органотипической костной тканью.
Подобным требованиям, по мнению И. А. Кириловой (2011), могут отвечать только костнопластические материалы на основе аллокости, подвергнутой различным видам технологической обработки [5].
В зависимости от способа предварительной химической обработки костной ткани алло-имплантат может быть трех видов: нативный, с сохраненной костной структурой и соотношением органического и минерального компонентов; деминерализованный, лишенный минерального компонента органический матрикс кости; депротеинизированный, лишенный органического компонента минеральный компонент или кристаллическая решетка гидроксиа-патита биологического происхождения.
Кроме химической обработки, фрагменты аллокости отличаются по размерам и форме, которые могут придаваться материалу в ходе моделирования.
Установлено, что наиболее выраженным остеотропным потенциалом обладают остеоре-паративные средства на основе аллогенного гидроксиапатита, полученные по технологии «Лиопласт»® [11].
Благодаря современным методикам математического моделирования и фрезеровке на станке с числовым программным управлением, эти остеопластические материалы позволяют изготавливать персонифицированные костные имплантаты высокой точности. Для клинико-экспериментальной оценки и анализа безопасности, качества и эффективности остеопласти-ческих материалов все чаще применяют лабораторные исследования с помощью клеточных биотехнологий, поскольку тесты с использованием культур клеток признаны наиболее этичными [12, 13, 14, 15].
Главное преимущество культурального метода - это возможность прижизненного наблюдения культивируемых клеток с помощью микроскопа, что позволяет оценивать в динамике на одной и той же тестовой культуре структурные характеристики клеток в монослое.
В связи с вышеизложенным нам представляется необходимым исследование биосовместимости и безопасности полученных нами образцов персонифицированных костных имплан-татов на культуре хондробластов человека.
Цель работы: провести тестирование IN VITRO и оценить биосовместимость и цито-токсичность опытных образцов персонифицированных костных имплантатов на культуре хондробластов человека.
Материалы и методы исследований. Были выделены две группы персонифицированных костных имплантатов для проведения исследования биосовместимости и безопасности, по 30 опытных образцов в каждой:
1. Опытные образцы персонифицированных костных имплантатов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание и фрезерную обработку.
2. Опытные образцы персонифицированных костных имплантатов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание, лиофилизацию и фрезерную обработку.
Культура хондробластов человека была выбрана в качестве тестовой системы.
Культуру хондробластов человека выращивали из фрагмента интактного гиалинового реберного хряща, взятого у органного донора массой 500-1000 мг. Фрагменты помещали каждый в отдельный стерильный флакон со средой 199, которые затем поступали в лабораторию культивирования клеток Института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ.
Хрящ трехкратно промывали стерильным раствором Хенкса, измельчали и на сутки помещали в стерильный флакон со средой 199. Через сутки, убедившись в стерильности образцов, начинали их обработку. До начала работы с образцами в стерильный флакон со средой 199 добавляли стерильную эмбриональную сыворотку коров. Полученные фрагменты очищали от крови стерильным раствором Хенкса с последующим центрифугированием в центрифужной пробирке в течение 5 минут при 1 500 оборотов. Фрагмент ткани извлекали из центрифужной пробирки и обрабатывали коллагеназой, а полученный осадок при центрифугировании с целью сохранения клеток наслаивали на градиент плотности на стерильный раствор фикола и повторно центрифугировали в новых стерильных цетрифужных пробирках в течение 5 минут при 1 500 тысячи оборотах. От фикола клетки промывали стерильным раствором Хенкса. Действие коллагеназы останавливали ростовой средой 199 с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой (ООО «БиолоТ», Санкт-Петербург, РФ), а полученный осадок с целью выделения клеток переносили в новую стерильную центрифужную пробирку, наслаивали на градиент плотности (стерильный раствор фикола) и повторно центрифугировали в течение 5 минут при 1 500 тысячи оборотов. Затем фрагменты тканей помещали в стерильные пластиковые культуральные флаконы («Orange Scientific», Бельгия) площадью 25 см2, дно которых обрабатывали стерильным раствором желатина. Помещали флаконы в СО2 -инкубатор в полной ростовой среде 10 % 199 до достижения монослоя со сменой ростовой среды через каждые 3 дня. Для получения чистой культуры клеток при достижении плотного монослоя клетки пассировали, используя стерильный раствор Версена.
Контрольная группа культуры хондробластов человека имела следующие морфофунк-циональные характеристики.
Хондробласты нативной культуры в основном имели вытянутую форму и 3-5 отростков. Отростки были разветвлены, обеспечивая соединение с соседними клетками. Цитоплазма содержала много вакуолей в периферической зоне клетки. Границы клеток четкие. Ядро овальной формы располагалось, как правило, в центре, содержало 1-3 ядрышка. У клеток хорошо была выражена адгезия к культуральному пластику: через 2 часа после пересева большая часть хондробластов приставала ко дну культуральной посуды и распластывалась по нему. Через сутки подавляющее количество клеток приставала ко дну культурального флакона и приобретала удлиненную форму с вытянутыми отростками (рис. 1).
Рис. 1. Нативная культура хондробластов человека, 4 пассаж. Первые сутки после пересева. Инвертированный микроскоп. Увеличение 100
На третьи сутки также отмечали увеличение количества клеток с более вытянутой формой (рис. 2). На 7 сутки образовывался полный монослой, без характерного направления (рис. 3). Способность к клонообразованию у клеток данной культуры отсутствовала.
Рис. 2. Нативная культура хондробластов Рис. 3. Нативная культура хондробластов
человека, 4 пассаж. Третьи сутки после пересева. человека, 4 пассаж. Седьмые сутки после пересева.
Инвертированный микроскоп. Увеличение 100 Инвертированный микроскоп. Увеличение 100
При обзорных окрасках через 7 суток после пересева можно заметить появление полигональных клеток. Цитолемма хондробластов в культуре ровная, цитоплазма с вакуолями, слабо оксифильна. Ядра правильной округлой формы с гладкой оболочкой, располагались преимущественно в центре. Хроматин в виде мелкой зернистости расположен в ядрах диффузно. При окраске гематоксилин + судан IV нейтральный жир не обнаруживали (рис. 4).
Рис. 4. Культура хондробластов человека 4 пассаж. Монослой, 7 суток после пересева. Окраска гематоксилин + судан IV. Увеличение 200
Методы исследования. При ежедневном наблюдении в инвертированном микроскопе «Биолам П - 2-1» за нативной культурой проводили ее изучение, морфометрирование и фотографирование. Визуально оценивали целостность монослоя, наличие слущенных клеток в культуральной жидкости, форму и размеры клеток, структуру клеток (состояние цитолеммы, состояние цитоплазмы - наличие вакуолей, зернистости, наличие и состояние отростков, структуру ядра и ядрышек, положение ядра в клетке, количество ядер и ядрышек в клетках).
Плотность клеток на единицу площади и количество поврежденных клеток (на 200 клеток) определяли с помощью окулярной сетки Автандилова, а количество слущенных клеток в культуральной жидкости и соотношение живых и мертвых клеток (при пересеве) - с помощью камеры Горяева. По окончании эксперимента ростовую среду из чашек удаляли, а клетки окрашивали гематоксилином и суданом IV.
Хондробласты снимали со дна культурального флакона стандартным способом (при помощи 0,25 % раствора трипсина и 0,02 % раствора Версена), отмывали клетки центрифугированием в стерильной центрифужной пробирке в ростовой среде, содержащей 5 % сыворотки плодов коровы в течение 5 минут при 1500 оборотов. Считали количество клеток в камере Горяева, еще раз центрифугировали, а затем ресуспендировали осадок в ростовой среде, и переносили полученную суспензию на тестируемый образец (размерами 3*3*5 мм), помещенный в чашку Петри Вели ежедневное наблюдение за культурой клеток в течение 7 дней.
Результаты и обсуждение. Результаты тестирования опытных образцов персонифицированных костных имплантатов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание и фрезерную обработку (1 группа).
В первые сутки эксперимента клетки начинали проявлять способность к адгезии как ко дну культурального флакона, так и к поверхности помещенного образца. Клетки при этом сохраняли свою округлую форму, 3-5 отростков, анастомозирующих с отростками соседних клеток. Контуры клеток четко очерчены, цитоплазма более светлая по периферии и более темная в центральных зонах вокруг ядер (рис. 5). На 3 сутки эксперимента клетки постепенно увеличивались в количестве, при этом сохраняли форму и размеры (рис. 6).
Рис. 5. Нативная культура хондробластов человека, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. Первые сутки эксперимента. Увеличение 100
Рис. 6. Нативная культура хондробластов человека, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. Третьи сутки эксперимента. Увеличение 100
К 7 суткам клетки сохраняли свою форму и размеры. Рост клеток незначительный. Монослой к этому сроку не сформирован. Отмечали появление двухъядерных клеток, что характерно для растущей культуры (в рис. 7).
Рис. 7. Нативная культура хондробластов человека, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. Седьмые сутки эксперимента. Увеличение 100
При обзорных окрасках судан ГУ+ гематоксилин на 7 сутки эксперимента клетки полигональной формы. Цитоплазма с вакуолями, оксифильна. Ядра правильной округлой формы с гладкой оболочкой, располагались преимущественно в центре. Хроматин в виде мелкой зернистости расположен в ядрах диффузно. При окраске гематоксилин + судан IV нейтральный жир не обнаруживали (рис. 8).
% V # »
Рис. 8. Культура хондробластов человека вблизи имплантата. Семь суток эксперимента. Окраска гематоксилин + судан IV. Увеличение 200
Результаты тестирования опытных образцов персонифицированных костных имплан-татов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание, лиофилиза-цию и фрезерную обработку (2 группа).
В первые сутки эксперимента клетки начинали приставать как ко дну культурального флакона, так и к поверхности помещенного образца, единичные нерасправленные клетки имели округлую форму. Прикрепленные к пластику клетки сохраняли форму и размер 3-4 отростка (рис. 9).
На 3 день отмечали незначительное увеличение клеток. Клетки сохраняли свою форму и размер как в непосредственной близости от образца, так и в отдаленных от него участках. Имелись единичные округлые неприкрепленные клетки. Цитоплазма гомогенная, границы клеток хорошо очерчены. Отростки хорошо просматривались (рис. 10).
Рис. 9. Нативная культура хондробластов человека, нанесенных в суспензии имплантат. Инвертированный микроскоп. Первые сутки эксперимента. Увеличение 100
Рис. 10. Нативная культура хондробластов человека, нанесенных в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. Третьи сутки эксперимента. Увеличение 100
На 7 день эксперимента клетки незначительно увеличивались в количестве. Клетки сохраняли свою форму и размер как в непосредственной близости от образца, так и в отдаленных от него участках. Имелись единичные округлые неприкрепленные клетки. Цитоплазма гомогенная, границы клеток хорошо очерчены. Отростки хорошо просматривались (рис. 11).
При обзорных окрасках судан ГУ+ гематоксилин на 7 сутки эксперимента клетки вытянутой формы. Цитоплазма вакуолизирована, слабо оксифильна. Клетки соединялись между собой. Отростки хорошо видны. Ядра правильной округлой формы с гладкой оболочкой, располагались преимущественно в центре. Хроматин в виде мелкой зернистости расположен в ядрах диффузно. При окраске гематоксилин + судан IV нейтральный жир не обнаруживали (рис. 12).
Рис. 11. Нативная культура хондробластов человека, нанесенных в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп, седьмые сутки эксперимента. Увеличение 100
Рис. 12. Культура хондробластов человека, вблизи имплантата. Семь суток эксперимента. Окраска гематоксилин + судан IV. Увеличение 200
Заключение. Проведенное исследование с применением культуры хондробластов человека показало, что включение в технологию изготовления персонифицированного костного имплантата этапа фрезерной обработки не приводит к изменениям первичных свойств алло-генного биоматериала, из которого они получены. Изготовленные по двум разработанным технологиям персонифицированные костные имплантаты обладают высокой биосовместимостью и отсутствием цитотоксического эффекта.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Пикалюк В.С., Мостовой С.О. Современные представления о биологии и функции костной ткани // Таврический медико-биологический вестник. - 2006. - № 9 (3:1). - С. 186-194.
2 Ардашев И.П., Подорожная В.Т., Кирилова И.А. и др. Передний спондилодез в эксперименте // Хирургия позвоночника. - 2008. - № 1. - С. 66-73.
3 Гинцбург А.Л., Карягина A.C., Лунин В.Г., Семихин A.C. Разработка препаратов нового поколения для эффективной регенерации костной ткани // Лечение и профилактика. - 2011. - № 1. - С. 78-81.
4 Берченко Г.Н., Кесян Г.А. Сравнительное экспериментально-морфологическое исследование влияния некоторых используемых в травматолого-ортопедической практике кальцийфосфатных материалов на активизацию репаративного остеогенеза // Бюл. Восточно-Сибирского науч. центра СО РАМН. - 2006. - № 4. -С. 327-332.
5 Кирилова И.А., Фомичев Н.Г., Подорожная В.Т. и др. Новые виды материалов для костной пластики в свете современных представлений о костных трансплантатах // Хирургия позвоночника. - 2007. - № 2. - С. 66-70.
6 Турин А.Н. Сравнительная оценка влияния различных остеопластических материалов на основе фосфатов кальция на заживление костных дефектов : автореф. дисс. ... канд. мед. наук / А.Н. Турин. - Москва, 2009. -26 с.
7 Finkemeier, C.G. Bone-grafting and bone-graft substitutes // J. Bone Joint Surgery. - Am. 2002. - Vol. 84. -P. 454-464.
8 Breine U. Reconstruction of alveolar jaw bone / U. Breine, P.L. Branemark // Scand. J. Plast. Reconstr. Surg. -2004. - Vol. 14. - P. 23-48.
9 De Long, W.G., Bone grafts and bone graft substitutes in orthopaedic trauma surgery. A critical analysis / W.G. De Long, T.A. Einhorn, K. Koval, et al./ / J. Bone Joint Surg. - Am. 2007. - Vol. 89. - P. 649-658.
10 Лясников В.Н., Лепилин А.В., Протасова Н.В. Проблемы создания современных имплантационных систем и пути их решения // Современные проблемы имплантологии. Материалы 5-й Международной конференции 22-25 мая 2000 г. - Саратов, 2000. - С. 10-11.
11 Долгалев А. А. Обоснование дифференцированного применения имплантационных материалов в стоматологии : автореф дисс. ... докт. мед. наук / А.А. Долгалев. - Москва, 2009. - 28 с.
12 Иванов, С.Ю., Базикян Э.А., Бизяев А.Ф. Стоматологическая имплантология. - М., 2004. - 295 с.
13 Берченко Г.Н., Кесян Г.А. Сравнительное экспериментально-морфологическое исследование влияния некоторых используемых в травматолого-ортопедической практике кальцийфосфатных материалов на активизацию репаративного остеогенеза // Бюл. Восточно-Сибирского науч. центра СО РАМН. - 2006. - № 4. -С. 327-332.
14 Волова Л.Т. Биологическая система оценки качества биоимплантатов с помощью клеточных технологий // Успехи современного естествознания. - 2008. - № 5. - С. 86-88.
15 Михалев П.Н. Экспериментально-клиническое обоснование выбора остеопластических материалов при различных методах аугментации альвеолярных отростков челюстей : автореф. дисс. ... канд. мед. наук / П.Н. Михалев. - Казань, 2012. - 19 с.
Рукопись получена: 10 сентября 2017 г. Принята к публикации: 21 сентября 2017 г.
