Исследование биологической совместимости биопластического материала «Гиаматрикс» на культуре дермальных фибробластов

Гильмутдинова Ильмира Ринатовна; Россинская Виктория Викторовна; Болтовская Виолетта Викторовна; Кулагина Лариса Николаевна

УДК 57.085.23

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ СОВМЕСТИМОСТИ БИОПЛАСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА «ГИАМАТРИКС» НА КУЛЬТУРЕ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ

1 Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна 2 Самарский государственный медицинский университет

Поступила в редакцию 20.03.2015

В данной статье представлены результаты исследования биосовместимости биопластического материала «Гиаматрикс» in vitro на культуре дермальных фибробластов человека. Ключевые слова: эксперименты in vitro, культура клеток

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время имеется целый ряд искусственных и биогенной природы материалов, применяемых в современной комбустиологии для лечения поверхностных ран и ожогов [1]. Ведутся разработки по созданию биодегради-руемых матриксов для решения задач тканевой скаффолд-инженерии, в частности, для создания протезов кожи для лечения поверхностных ожогов и ран [2; 3]. Наиболее перспективным направлением считается использование для лечения ожоговых ран таких биополимеров как коллаген, желатин, гиалуроновая кислота и др. [4].

В последние годы уделяется большое внимание именно гиалуроновой кислоте (ГК), которая представляет собой естественный компонент межклеточного вещества различных тканей.

Матриксы для использования в регенеративной медицине и создания биоискусственных тканей должны характеризоваться:

- многофункциональностью (одновременно выполнять роль каркаса, подложки и питательной среды для клеточных культур);

- механической прочностью и эластичностью, достаточной для хирургических манипуляций;

- биосовместимостью на белковом и клеточном уровнях;

- способностью стимулировать пролиферацию и дифференциацию клеток;

- пористостью, обеспечивая процессы не-оваскуляризации;

- возможностью стерилизации стандартными

Гильмутдинова Ильмира Ринатовна, врач-трансфузи-олог. E-mail: [email protected]

Россинская Виктория Викторовна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник ИЭМБ. E-mail: [email protected]

Болтовская Виолетта Викторовна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник ИЭМБ. E-mail: [email protected] Кулагина Лариса Николаевна, инженер ИЭМБ. E-mail: [email protected]

способами без изменения медико-технических свойств [5].

Целью нашего исследования явилась оценка цитотоксичности биопластического материала «Гиаматрикс» и его влияния на функциональную и пролиферативную активность дермальных фибробластов человека. Фибробласты играют одну из главных ролей в регенерации кожи. Они представляют собой наиболее многочисленную популяцию клеток дермы, функция которых состоит в построении межклеточного вещества соединительной ткани.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для тестирования на биосовместимость были представлены стерильные образцы биопластического материала «Гиаматрикс», полученного с помощью метода фотохимического нанострук-турирования гидроколлоида ГК (патент РФ № 2367476 от 21.03.2008) в виде пленок толщиной 1 мм. В качестве тест-системы была использована культура дермальных фибробластов человека 7 пассажа, выращенных из кожи доноров.

Исследование осуществляли методом прямого контакта в культуральных чашках Петри диаметром 3,5 см («Orange Баепййс», Бельгия) в условиях СО2-инкубатора (Sanyo MCO-18AC, Япония) при t 37°С, содержании СО2 5% и постоянной влажности в полной ростовой среде (среда 199 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки). В работе использованы реактивы ООО «Биолот», Россия. Все манипуляции с культурой проводили в ламинарном боксе БАВп-01 «Ламинар С» (ЗАО «Ламинарные системы», Миасс, РФ).

Для оценки цитотоксичности материала (1 серия) применяли ЛДГ-тест. Фибробласты снимали со дна культурального флакона стандартным способом (при помощи 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена) и пересевали в куль-туральный 24-луночный планшет в дозе 30 тыс. клеток на лунку. Через 24 часа на сформированный монослой помещали образцы материала

размером 3х3 мм. Фибробласты в присутствии материала культивировали 48 часов. Активность ЛДГ определяли в культуральной среде и в клетках монослоя по убыли ЫЛБИ в ходе реакции превращения пирувата в лактат.

Количество поврежденных клеток выражали как процентное отношение активности ЛДГ в среде к суммарной активности ЛДГ в лизате и в ростовой среде.

Для оценки пролиферативной активности фибробластов в присутствии биоматериала «Ги-аматрикс» (2 серия) клетки высевали в культу-ральные чашки Петри диаметром 3,5 см («Ога^е БаепйАс», Бельгия). Посевная доза составляла 5 тыс. клеток/см2 (1х104). Через 24 ч на образовавшийся монослой фибробластов помещали образцы материала размером 5x5 мм.

С целью выяснения влияния биоматериала «Гиаматрикс» на адгезивную способность дер-мальных фибробластов (3 серия), на дно чашек сначала помещали образцы материала, а затем высевали клетки. Посевная доза составляла 10 тыс. клеток/см2 (1 х104).

Контролем во всех сериях служили чашки или лунки с культурой фибробластов без образцов материала, которые пассировали и наблюдали одновременно с экспериментальными. Продолжительность наблюдения во 2 и 3 сериях - 7 суток.

Нативные культуры изучали, фотографировали и морфометрировали с помощью инвертированного микроскопа «Биолам-П2-1» при увеличении 63 и 100 (окуляры - 6,3 и 10, объектив - 10). Оценивали целостность монослоя, наличие слущенных клеток в культуральной жидкости, форму и размеры клеток, структуру клеток. Плотность клеток монослоя на единицу площади определяли с помощью окулярной сетки Автандилова, а количество слущенных клеток в культуральной жидкости и соотношение живых и мертвых клеток (при пересеве) - с помощью камеры Горяева. На основании данных о плотности монослоя рассчитывали индекс адгезии, время удвоения культур, индекс пролиферации по формулам:

Время удвоения культуры

где Ь - время инкубации (ч);

Ы0- начальная доза клеток на пластике;

Ы1- количество клеток выросших за время Ь;

Количество удвоений

Кол-во удвоений = - / где Ы1- количество клеток, выросших за время Ь;

Ы0 - начальная доза клеток на пластике;

Индекс адгезии

Считают через 24 ч после посадки клеток ИА = N^100 / где N - посевная доза;

Ы2 - кол-во клеток на пластике через 24 ч после посева.

По окончании каждого срока эксперимента готовили гистологические препараты клеточных культур. Препараты, окрашенные по Романовскому, гематоксилином Майера, трипановым синим изучали и фотографировали с помощью автоматизированной аналитической системы, включающей микроскоп «Olympus ВХ 41», цифровую фотокамеру Prog RCF системный блок на базе процессора Intel Pentium 4. Для анализа изображений использовали программу «Видеотест Морфология 5.2». В окрашенных препаратах также считали количество клеток на единицу площади. Всего изучено 64 препарата.

Статистическая обработка данных выполнена с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 с учетом современных требований к предъявлению результатов статистического анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение пролиферативной активности

дермальных фибробластов при культивировании их в присутствии биоматериала «Гиаматрикс»

Через 1 сутки после помещения на монослой образца материала каких-либо изменений проли-феративной активности дермальных фибробла-стов по сравнению с контролем не наблюдалось. Клетки располагались по дну культурального пластика неравномерно. Большинство клеток имело характерную веретенообразную форму. Вместе с тем дермальные фибробласты четко контурировали, крупные ядра были расположены ближе к периферии, имели овальную форму и ровные границы оболочки (рис. 1).

Рис 1. Опыт. Культура фибробластов человека в присутствии материала «Гиаматрикс». 1 сутки эксперимента. Клетки в непосредственной близости от образца. Нативный препарат. Инвертированный микроскоп. Увеличение 100

В течение 2 и 3 суток эксперимента наблюдалось увеличение количества клеток,

локализующихся вокруг образца. Фибробласты располагались плотно друг к другу, формируя тяжи. Отмечалось большое количество делящихся клеток. Однако, по сравнению с контролем их пролиферативная способность была снижена, о чем свидетельствовала меньшая площадь монослоя в присутствии биоматериала. Морфологически клетки не отличались от контрольной группы. Каждая клетка имела по два-четыре отростка разной длины, с помощью которых соседние клетки соединялись между собой, в результате чего формировался равномерный монослой. На периферии отмечались единичные клетки с пикнотичными ядрами и вакуолизированной цитоплазмой. Однако в последующие сроки активная пролиферация фибробластов как вблизи образца, так и в отдаленных от него зонах восстанавливалась, за счет чего через 5 суток индекс пролиферации был выше, а время удвоения - короче, чем в контроле. Такое же соотношение этих показателей отмечалось по окончании эксперимента, в результате чего плотность монослоя через 7 суток в контроле и опыте была практически одинаковой (рис. 2, 3).

Количество поврежденных фибробластов в монослое в течение первых трех суток эксперимента было несколько больше в опытной серии, что можно связать с незначительным повреждающим действием образца на прикрепленные к пластику клетки.

Морфофункциональные характеристики культуры фибробластов при культивировании в присутствии биоматериала «Гиаматрикс» представлены в табл. 1.

Результаты ЛДГ-теста показали, что доля поврежденных клеток в присутствии материала не отличается от таковой в контрольной культуре (7,22% и 7,47%), что говорит об отсутствии цито-токсичности «Гиаматрикса».

Рис. 2. Контроль. Культура фибробластов человека. 7 суток эксперимента. Клетки веретенообразной формы с отростками разной длины. Окраска гематоксилином и суданом IV. Увеличение 200

БИОСОВМЕСТИМОСТЬ МАТЕРИАЛА «ГИАМАТРИКС» ПРИ ОДНОВРЕМЕННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ФИБРОБЛАСТОВ

Через сутки после постановки эксперимента фибробласты как в контроле, так и в опыте равномерно были распределены по дну культуральных чашек. Индекс пролиферации (90% и 90%) и соотношение живых и поврежденных клеток также были одинаковы. Клетки имели типичную для фибробластов вытянутую веретенообразную, продолговатую и звездчатую форму с гомогенной цитоплазмой и ядром овальной формы. В ядре хроматин распределялся диффузно. Данная морфология характерна для молодых активных фибробластов. Все это свидетельствует об отсутствии изменений адгезивной способности дермальных фибробластов в присутствии биоматериала «Гиаматрикс».

К 3 суткам при наблюдении в инвертируемый микроскоп количество клеток увеличивалось, однако плотность монослоя была меньше, чем в контроле. На поверхности материала было заметно незначительное количество прикрепленных к нему клеток. В непосредственной близости от Гиаматрикса отмечалось наличие делящихся фи-бробластов. Основное количество фибробластов локализовалось ближе к материалу. По периферии плотность клеток была меньше, наблюдались единичные клетки с нарушением структурной организации (цитоплазматические включения в виде вакуолей, пикноз ядра).

В более поздние сроки рост культуры фибробластов в присутствии биоматериала «Гиама-трикс» подчинялся той же закономерности, что и при помещении материала на монослой.

Морфометрические показатели морфофунк-циональной активности дермальных фибробла-стов представлены в табл. 2.

Рис. 3. Опыт. Культура фибробластов человека в присутствии материала «Гиаматрикс».

7 суток эксперимента. Клетки сохраняют обычную структуру. Окраска гематоксилином и суданом IV. Увеличение 400

Таблица 1. Характеристики культур фибробластов при помещении. Гиаматрикса на монослой

Показатели Исходные 1 сут 3 сут 5 сут 7 сут

данные

M±m M±m M±m M±m M±m

Конт- Опыт Конт- Опыт Конт- Опыт Конт- Опыт Конт- Опыт

роль роль роль роль роль

Плотность 4,7± 4,7± 9,1±1,5 9,2± 36,5± 29,8± 151,7± 136,6± 352± 387,8±

монослоя, 0,4 0,4 2,0 6,1 4,5** 19,6 7,4** 6,5 6,2

кл/0,1 мм2

Индекс 1,8± 1,76± 2,1± 1,6± 2,1±0,2 2,3± 1,1± 2,9±

пролифера- - - 0,15 0,2 0,3 0,5* 0,2* 0,1 0,1**

ции, отн.

ед.

Время 29,72± 29,24± 22,1± 28,6± 23,4± 21,8± 35,1± 28,8±

удвоения, ч - - 4,6 4,7 4,5 2,6*** 1,6 1,5** 0,2 2,6

Живые 91,4± 81,6± 95,0± 89,0± 94,6± 92,2± 91,9± 89,9±

// - - 0,5 1,0 0,8 0,8 0,8 1,4 0,8 1,0

поврежден- // // // // // // // //

ные клетки, 8,6± 18,4± 5,0± 11,0± 5,4±0,8 7,8± 8,1± 10,1±

% 0,5 1,2 0,8 0,8 1,4 0,9 1,0

Примечание: различия достоверны по сравнению с соответствующими значениями в контрольной группе при: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001

Таблица 2. Характеристики культур фибробластов при одновременном культивировании

Показатели 1 сут 3 сут 5 сут 7 сут

M±m M±m M±m M±m

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Плотность 9,0 ± 9,1± 38,0± 26,8± 150± 126,6± 352± 344,6±

монослоя, 1,5 1,35 0,4 0,8*** 0,4 1,0 6,5 4,6

кл/0,1 мм2 *** ***

Индекс - - 2,1± 1,5±0,1** 2,1±0,2 2,4±0,1 1,13±0,1 1,4±0,05

пролифера- 0,3 * *** ***

ции, отн.ед.

Время - - 22,1± 28,6± 23,4±1,6 21,2±0,4 35,1±0,2 33,3±0,4

удвоения, ч 4,5 1,4***

Живые 91,4± 90,6± 95,0± 89,6± 94,6±0,8 92,9±0,7 91,9±0,8 86,5 ±0,5

// 0,5 0,5 0,8 0,5 // // // //

поврежден- // // // // 5,4±0,8 7,1±0,7 8,1±0,9 13,5± 0,5

ные клетки, 8,6±0,5 9,4±0,5 5,0±0,8 10,4±

% 0,5

Примечание: *** - различия достоверны (при р<0,001) относительно соответствующего значения в контрольной группе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Результаты проведенного нами с помощью морфологических и биохимических методов исследования биосовместимости биопластического материала «Гиаматрикс» in vitro показали, что данный материал не оказывает цитотоксического действия на культуру дермальных фибробластов человека и не влияет на адгезивную способность этих клеток. Вместе с тем при культивировании дермальных фибробластов в присутствии образ-

цов «Гиаматрикса» происходит волнообразное изменение пролиферативной активности клеток тест-системы, которое выражается в уменьшении этого показателя в ранние сроки эксперимента (до конца третьих суток) и в последующем нарастании его вплоть до окончания исследования. Все это свидетельствует о биосовместимости данного материала и является предпосылкой к использованию его для лечения ожогов и впоследствии - к разработке тканеинженерных конструкций на его основе для использования в клинической практике.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аганина Е.Н., Ведерникова О.Л. Новые технологии местного лечения ожоговых ран у детей // Вопросы травматологии и ортопедии. 2012. № 2 (3). С.28-41.

2. БодунР.Д., ОстровскийН.В., Шиповская А.Б., Чернова Р.К., Белянина И.Б., Моисеенко Д.С. На пути к созданию живого дермального эквивалента // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. 2008. № 1. С.37-38.

3. Адельшин А.И. Нативные матриксы для создания

живого эквивалента кожи // Морфологические ведомости. 2003. № 3. С. 4-8.

4. Севастьянов В.И. Биоматериалы, системы доставки лекарственных веществ и биоинженерия //Вестник травматологии и искусственных органов. 2009. Т IX. № 3. С. 14-24.

5. Рахматуллин Р.Р. Биопластический материал на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и пептидного комплекса для восстановительной и реконструктивной хирургии: дисс. ... докт. биол. наук. М., 2014.

RESEARCH OF BIOLOGICAL COMPATIBILITY OF BIOPLASTIC MATERIAL «HYAMATRIX» IN DERMAL FIBROBLAST CULTURE

1 Federal Medical Biophysical Center named after A.I. Burnazyan 2 Samara State Medical University

In this article we described the results of the research of biological compatibility of bioplastic material Hyamatrix in vitro in human dermal fibroblast culture. Key words: experiments in vitro, cell culture.

Ilmira Gilmutdinova, Transfusiologist. E-mail: [email protected]

Victoria Rossinskaya, Candidate of Medicine, Leading Staff

Scientist of IEMB SSMU. E-mail: [email protected]

Victoria Boltovskaya, Candidate of Medicine, Senior Staff

Scientist of IEMB SSMU.

E-mail: [email protected]

Larisa Kulagina, Engineer of IEMB SSMU.

E-mail: [email protected]

RESEARCH OF BIOLOGICAL COMPATIBILITY OF BIOPLASTIC MATERIAL «HYAMATRIX» IN DERMAL FIBROBLAST CULTURE

Текст научной работы на тему «Исследование биологической совместимости биопластического материала «Гиаматрикс» на культуре дермальных фибробластов»