CC BY
22УДК 615.015.44:615.462
ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОПЫТНЫХ ОБРАЗЦОВ
ПЕРСОНИФИЦИРОВАННЫХ КОСТНЫХ ИМПЛАНТАТОВ НА КУЛЬТУРЕ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА
© 2017 Н.В. Попов, А.В. Колсанов, Л.Т. Волова, Ю.В. Пономарева
ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Самара
Для восстановления частичного дефекта костной ткани при изготовлении персонифицированных биоим-плантатов могут быть использованы остеопластические материалы на основе биологических полимеров алло-генного происхождения, изготовленные по технологии «Лиопласт»®. Данные остеопластические материалы для придания индивидуальных параметров реципиента должны быть подвергнуты механической фрезерной обработке на станке с числовым программным управлением по предварительно созданной математической (цифровой) модели, что приводит к изменению технологии изготовления. В связи с этим, авторами были проведены доклинические исследования в двух группах опытных образцов персонифицированных костных им-плантатов, при изготовлении которых была использована фрезерная обработка, были проанализированы результаты и сделаны выводы о высокой биосовместимости и отсутствии цитотоксического эффекта у полученных образцов.
Ключевые слова: персонифицированные костные имплантаты, цифровое прототипирование, цитотоксич-ность, культура клеток, остеопластические материалы.
Введение. Одним из приоритетных направлений современной персонифицированной медицины является разработка новых материалов и технологий изготовления из них изделий для регенерации или замены тканей и органов [1].
В челюстно-лицевой хирургии актуальной проблемой остается восстановление деструктивно-дистрофических дефектов альвеолярных отростков (гребней) верхней и нижней челюстей при помощи персонифицированных биоимплантатов [2].
Для восстановления частичного дефекта костной ткани при изготовлении персонифицированных биоимплантатов могут быть использованы остеопластические материалы на основе биологических полимеров аллогенного происхождения (деминерализованный костный матрикс, частично деминерализованный костный матрикс, деминерализованный лиофилизи-рованный костный матрикс и др.), изготовленные по технологии «Лиопласт»® [3, 4, 5]. Данные остеопластические материалы для придания индивидуальных параметров реципиента должны быть подвергнуты механической фрезерной обработке на станке с числовым программным управлением по предварительно созданной математической (цифровой) модели. Персонифицированный костный имплантат, полученный по данной технологии, должен быть нетоксичным, изготовлен из биосовместимого материала, должен обеспечивать репарацию костного дефекта и иметь большую площадь поверхности, контактирующую с костью, поэтому очень важно обеспечить максимально точное соответствие имплантата дефекту в области повреждения [6].
Согласно результатам ранее проведенных исследований было показано, что материалы, изготовленные по технологии «Лиопласт», эффективны, биосовместимы и нетоксичны [4, 5]. В случае изготовления персонифицированного костного имплантата технология «Лиопласт» расширена за счет применения фрезерной обработки.
В связи с этим было решено провести оценку биосовместимости и безопасности полученных образцов персонифицированного костного имплантата на культуре дермальных фиб-робластов человека. Р. Адамс еще в 1983 году указывал на ряд существенных преимуществ культур клеток как тест-систем по сравнению с животными [7]. Это быстрое получение результата и возможность постановки эксперимента на большом количестве однородных объектов. Кроме того, клетки в культуре легко доступны для различных манипуляций, при этом может быть достигнут непосредственный контакт тестируемого фактора или объекта с культивируемыми клетками, причем в течение заданного периода времени [8].
Цель работы: провести доклинические исследования опытных образцов персонифицированных костных имплантатов и оценить их биосовместимость и безопасность на культурах дермальных фибробластов человека IN VITRO.
Материалы и методы исследований. Для проведения тестирования биосовместимости и безопасности персонифицированных костных имплантатов были выделены две группы исследования, по 30 опытных образцов в каждой:
1. Опытные образцы персонифицированных костных имплантатов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание и фрезерную обработку.
2. Опытные образцы персонифицированных костных имплантатов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание, лиофилизацию и фрезерную обработку.
В качестве тест-систем была выбрана культура дермальных фибробластов человека.
Культуру дермальных фибробластов человека выращивали по стандартной методике первичных эксплантатов из кожи крайней плоти троих мальчиков (10, 10, 11 лет), полученных при операции циркумцизии, произведенной по поводу фимоза. Доноры были соматически здоровыми, обследованы на ВИЧ, сифилис, гепатиты В и С; результаты анализов отрицательные.
Фрагменты тканей, полученные в стерильных условиях у 3-х пациентов, помещали каждый в отдельный стерильный флакон со средой 199 и доставляли в течение двух часов в лабораторию культивирования клеток Института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ. Образцы хранили при температуре +40 °С в течение суток. Через сутки, убедившись в стерильности образцов, начинали их обработку.
До начала работы с образцами во флакон со средой 199 добавляли эмбриональную сыворотку коров. Полученные фрагменты крайней плоти очищали от крови стерильным раствором Хенкса с последующим центрифугированием в центрифужной пробирке в течение 5 минут при 1500 оборотов. Фрагмент ткани извлекали из центрифужной пробирки и обрабатывали коллагеназой, а полученный осадок при центрифугировании с целью сохранения клеток наслаивали на градиент плотности на стерильный раствор фиколла и повторно центрифугировали в новых стерильных центрифужных пробирках в течение 5 минут при 1500 оборотов. От фиколла клетки отмывали стерильным раствором Хенкса. Действие коллагеназы останавливали ростовой средой 199 с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «БиолоТ», Санкт-Петербург, РФ), а полученный осадок с целью выделения клеток переносили в новую стерильную центрифужную пробирку, наслаивали на градиент плотности (стерильный раствор фикола) и повторно центрифугировали в течение 5 минут при 1,5 тысячи оборотов. Затем фрагменты тканей помещали в стерильные пластиковые культуральные флаконы («Orange Scientific», Бельгия) площадью 25 см2 и помещали в СО2-инкубатор в 10 % полной ростовой среде до достижения монослоя.
Рис. 1. Культуральный флакон для выращивания фибробластов человека
Смену ростовой среды проводили каждые 3 дня. Для получения чистой культуры клеток при достижении плотного монослоя клетки пассировали, используя стерильный раствор Версена.
Всего для использования в дальнейших исследованиях выращено 18*106 дермальных фибробластов. На 4 пассаже проведена идентификация клеток с использованием морфологических и биохимических методов и проточной цитометрии. Нативные культуры изучали, фотографировали и морфометрировали с помощью инвертированного микроскопа «Биолам-2-1» при увеличении 63 и 100 (окуляры - 6,3 и 10, объектив - 10).
Оценивали целостность монослоя, наличие слущенных клеток в культуральной жидкости, форму и размеры клеток, структуру клеток (состояние цитолеммы, состояние цитоплазмы - наличие вакуолей, зернистости, наличие и состояние отростков, структуру ядра и ядрышек, положение ядра в клетке, количество ядер и ядрышек в клетках). Плотность клеток монослоя на единицу площади определяли с помощью окулярной сетки Автандилова, а количество слущенных клеток в культуральной жидкости и соотношение живых и мертвых клеток (при пересеве) - с помощью камеры Горяева. Для определения количества поврежденных клеток в монослое считали 200 клеток в 5 полях зрения, из них отдельно учитывали поврежденные клетки и выражали результат в %. На основании данных о плотности монослоя рассчитывали время удвоения культуры.
Контрольная группа культуры дермальных фибробластов человека имела следующие морфофункциональные характеристики.
Дермальные фибробласты нативной культуры имели вытянутую или (при высокой плотности монослоя) веретеновидную форму, 2-4 отростка, гомогенную цитоплазму. Границы клеток четкие, ядра овальной формы, расположены, как правило, несколько эксцентрично, содержат 1-2 ядрышка. У таких клеток хорошо выражена адгезия к культуральному пластику: через 2 часа после пересева большая часть фибробластов пристает ко дну культуральной посуды и распластывается по нему. Через сутки клетки формируют неполный равномерный монослой (рис. 2), в дальнейшем клетки растут равномерным монослоем, плотность которого увеличивается с течением времени (экспоненциальная фаза роста), на 3 сутки образуют полный монослой, формируя характерный рисунок в виде «завитков» (рис. 3), а на 7 - достигают плотности насыщения и переходят в стационарную фазу (рис. 4). Способность к клоно-образованию у клеток данной культуры отсутствовала.
Рис. 2. Нативная культура фибробластов человека, 4 пассаж. Монослой, 1 сутки после пересева. Инвертированный микроскоп. Увеличение 200
Рис. 3. Нативная культура фибробластов человека, 4 пассаж. Монослой, 3 сутки после пересева. Инвертированный микроскоп. Увеличение 100
Рис. 4. Нативная культура фибробластов человека, 4 пассаж. Монослой, 7 суток после пересева. Инвертированный микроскоп. Увеличение 100
При обзорных окрасках на 7 сутки после пересева цитолемма фибробластов в культуре ровная, цитоплазма слабо оксифильна и представляется гомогенной. Ядра правильной овальной формы, с гладкой оболочкой, хроматин в виде мелкой зернистости расположен в ядрах диффузно. В фибробластах при окраске гематоксилин + судан IV нейтральный жир не обнаруживается, что соответствовало норме (рис. 5).
Рис. 5. Культура фибробластов человека, 4 пассаж. Монослой, Зсутки после пересева. Окраска гематоксилин+ судан IV. Увеличение 200
Методы исследования. При ежедневном наблюдении в инвертированном микроскопе «Биолам П - 2-1» за нативной культурой проводили ее изучение, морфометрирование и фотографирование. Визуально оценивали целостность монослоя, наличие слущенных клеток в культуральной жидкости, форму и размеры клеток, структуру клеток (состояние цитолеммы, состояние цитоплазмы - наличие вакуолей, зернистости, наличие и состояние отростков, структуру ядра и ядрышек, положение ядра в клетке, количество ядер и ядрышек в клетках).
Плотность клеток на единицу площади и количество поврежденных клеток (на 200 клеток) определяли с помощью окулярной сетки Автандилова, а количество слущенных клеток в культуральной жидкости и соотношение живых и мертвых клеток (при пересеве) - с помощью камеры Горяева. По окончании эксперимента ростовую среду из чашек удаляли, а клетки окрашивали гематоксилином и суданом IV.
Фибробласты снимали со дна культурального флакона стандартным способом (при помощи 0,25 % раствора трипсина и 0,02 % раствора Версена), отмывали клетки центрифугированием в стерильной центрифужной пробирке в ростовой среде, содержащей 5 % сыворотки плодов коровы в течение 5 минут при 1500 оборотов. Считали количество клеток в камере Горяева, еще раз центрифугировали, а затем ресуспендировали осадок в ростовой среде, и переносили полученную суспензию на тестируемый образец (размерами 3*3*5 мм), помещенный в чашку Петри (рис. 6, 7). Вели ежедневное наблюдение за культурой клеток в течение 7 дней.
Рис.6. Внешний вид тестируемого образца Рис. 7. Внесение суспензии клеток на имплантат
Результаты и обсуждение. Результаты тестирования опытных образцов персонифицированных костных имплантатов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание и фрезерную обработку (1 группа).
Через сутки от начала эксперимента наблюдали адгезию клеток как ко дну культураль-ной чашки, так и к поверхности исследуемого образца. Клетки имели вытянутую форму с 3-4 отростками. Цитоплазма гомогенная, ядро располагалось эксцентрично (рис. 8).
Рис. 8. Нативная культура фибробластов, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. 1-е сутки эксперимента. Увеличение 100
К 3 суткам количество клеток постепенно увеличивалось, создавая тем самым монослой. Клетки сохраняли форму и структуру. Цитоплазма гомогенная, ядра располагались эксцентрично. Клетки соединены своими отростками друг с другом. Плотность клеток одинаковая как в непосредственной близости от образца, так и в отдаленных зонах (рис. 9).
К 7 суткам эксперимента количество клеток постепенно увеличивалось, при этом у них сохранялись характерные форма и размеры. При осмотре инвертированным микроскопом можно было увидеть, что фибробласты, находящиеся под образцом, также сохраняли адгезивную способность к культуральному флакону и к образцу. Клетки соединялись между собой отростками, формируя монослой.
Рис. 9. Нативная культура фибробластов, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. 3-е сутки эксперимента. Увеличение 100
При окраске гематоксилин + судан IV на 7 сутки эксперимента фибробласты в непосредственной близости от помещенного образца свободно были расположены в разных направлениях. Клетки удлиненной формы, отростки имели четкие контуры. Цитоплазма клеток оксифильна, и представлялась гомогенной. Ядра правильной формы, с гладкой оболочкой, хроматин в виде мелкой зернистости расположен в ядрах диффузно. Нейтральный жир в фибробластах не обнаруживали, что соответствовало норме (рис. 10).
Рис. 10. Культура фибробластов человека, вблизи имплантата. 7 суток эксперимента. Окраска
гематоксилин + судан IV. Увеличение 200
Результаты тестирования опытных образцов персонифицированных костных имплан-татов из матриц губчатого слоя нативной кости, прошедших обезжиривание, лиофилиза-цию и фрезерную обработку (2 группа).
В первые сутки эксперимента клетки сохраняли адгезию как ко дну культурального флакона, так и к поверхности помещенного образца. Клетки сохраняли форму и размер, имели 3-4 отростка. Цитоплазма гомогенная, ядра находились в центре клетки (рис. 11).
Рис. 11. Нативная культура фибробластов, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. 1-е сутки эксперимента. Увеличение 100
На 3 сутки эксперимента наблюдали увеличение количества клеток как в непосредственной близости от помещенного образца, так и в отдаленных участках. Цитоплазма гомогенная, границы клеток хорошо просматривались. Клетки соединялись отростками (рис. 12). На 7 сутки эксперимента клетки начинали формировать монослой (рис. 13).
При обзорных окрасках судан 1У+ гематоксилин на 7 сутки эксперимента клетки вытянутой формы. Цитоплазма гомогенная, оксифильная. Клетки соединялись между собой. Отростки хорошо видны. Ядра правильной округлой формы с гладкой оболочкой, располагались преимущественно в центре. Хроматин в виде мелкой зернистости расположен в ядрах диффузно. При окраске гематоксилин + судан IV нейтральный жир не обнаруживали (рис. 14).
Рис. 12. Нативная культура фибробластов, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. 3- е сутки эксперимента. Увеличение 100
Рис. 13. Нативная культура фибробластов, нанесенная в суспензии на имплантат. Инвертированный микроскоп. 7-е сутки эксперимента.Увеличение 100
Рис. 14. Культура фибробластов человека, вблизи имплантата. 7 суток эксперимента. Окраска
гематоксилин + судан IV. Увеличение 200
Заключение. Проведенное тестирование с применением культуры дермальных фибробластов человека показало, что полученные по двум разработанным различным технологиям персонифицированные костные имплантаты обладают высокой биосовместимостью и отсутствием цитотоксического эффекта, а включение в технологический процесс дополнительного этапа фрезерной обработки не приводит к изменениям свойств у полученных персонифицированных костных имплантатов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Ипполитов Е.В., Новиков М.М., Новикова Л.В. Лазерно-информационные аддитивные технологии в медицине // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии : материалы Международной конференции. - 2016. - С. 38-47.
2 Волков А.В. и др. Создание индивидуальных трехмерных конструкций для восстановления челюстно-лицевых костных дефектов // Пародонтология. - 2011. - Т. 16. - № 4. - С. 61-64.
3 Болонкин В.П., Меленберг Т.В., Болонкин И.В. и др. Реабилитация больных при значительной атрофии костной ткани альвеолярного отростка // Уральский медицинский журнал. - 2009. - № 5. - С. 12-17.
4 Трунин Д.А., Кириллова В.П., Волова Л.Т. и др. Применение материалов «лиопласт» в имплантологии и пародонтологии // Стоматология славянских государств. Сборник трудов по материалам VIII Международной научно-практической конференции ; под ред. А.В. Цимбалистова, Б.В. Трифонова, А. А. Копытова. - М., 2015. - С. 277-279.
5 Болонкин В.П., Болонкин И.В., Рыбаков П.А. и др. Оптимизация костной пластики в боковых отделах верхней челюсти // Стоматология. - 2008. - Т. 87. - № 5. - С. 44-45.
6 Кравчук А., Потапов А., Корниенко В. и др. Поиск оптимальных материалов и технологий изготовления имплантов при реконструктивной хирургии посттравматических дефектов и деформаций черепа // Российская нейрохирургия. - 2006. - № 2 (17).
7 Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков (пер. с англ.) // Москва. - Мир. - 1983. - 263 с.
8 Волова Л.Т. Биологическая система оценки качества биоимплантатов с помощью клеточных технологий // Успехи современного естествознания. - 2008. - № 5. - С. 86-88.
Рукопись получена: 15 сентября 2017 г. Принята к публикации: 29 сентября 2017 г.
