CC BY
173
88
Химия
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 5 (1), с. 88-94
УДК 54-38: 57.085.23
ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОРАЗМЕРНОГО ГИДРОКСИАПАТИТА НА МОДЕЛИ IN VITRO
© 2012 г. А.В. Князев х, Е.Н. Буланов *, Д.Я. Алейник 2, И.Н. Чарыкова 2,
А.Е. Земсков *, А.В. Калентьев 1
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
2 Нижегородский НИИ травматологии и ортопедии
knyazevav@gmail. com
Поступила в редакцию 25.01.2012
Представлена новая методика получения наноразмерного порошка гидроксиапатита Ca5(PO4)3OH. С целью выяснения биологической совместимости и активности полученного соединения проведены его испытания на клеточной культуре фибробластов человека. Показано, что синтезированный гидро-ксиапатит не токсичен для культуры дермальных фибробластов человека в системе in vitro.
Ключевые слова: гидроксиапатит, синтез, фибробласты.
Введение
Г идроксиапатит Са5(Р04)30Н - один из наиболее изученных представителей соединений со структурой апатита [1]. Данный факт связан с тем, что это вещество по составу, строению и свойствам аналогично материалу костной ткани человека, что обуславливоет его дальнейшее применение в качестве основы материалов ортопедического назначения [2, 3].
Несмотря на большое количество публикаций, посвященных получению синтетического аналога гидроксиапатита, существующие методы синтеза имеют ряд существенных недостатков: например, использование вместо воды дорогостоящих органических растворителей, таких как анизол и ДМСО [4], или труднодоступных исходных реагентов, в частности Са(ОЕ^)2 [5]. Кроме того, реакция должна проходить в первом случае в течение 2-х дней и при температуре 130°С, во втором - в течение 2-х часов под вакуумом. Таким образом, до сих пор стоит задача разработки оптимального метода получения гидроксиапатита.
В данном случае, оптимизация метода получения гидроксиапатита рассматривается как реальный экономический фактор, значительно снижающий себестоимость синтеза. По существующим оценкам ежегодно в Российской Федерации регистрируется до 20 миллионов травм, половина из которых связана с костными переломами. Потенциальная потребность отечественного здравоохранения в остеопластических материалах составляет более 160-220 тыс. еди-
ниц в год, т.е. около 1 единицы на 1000 человек населения [6]. Однако высокая стоимость материалов и имплантатов из них не позволяют удовлетворить эту потребность. Следует учитывать, что вновь синтезированное вещество не будет иметь коммерческой перспективы, если оно не удовлетворяет регламентированным показателям (отсутствие токсичности), либо уступает по степени активизации взаимодействия клеток в процессах репарации веществам, уже присутствующими на рынке. Тестирование, как этап управления проектом и созданием вещества с заданными свойствами, позволит перейти к разработке технологии производства, обеспечивающей уникальное соотношение «цена - качество» синтезированного гидроксиапатита и удовлетворить имеющиеся потребности в ос-теопластических материалах.
При практическом использовании гидро-ксиапатита в качестве материала для костных имплантатов предполагается in vivo его взаимодействие с клетками мезенхимального ряда, выполняющими структурные функции - меха-ноцитами. Очевидна целесообразность изучения воздействия гидроксиапатита на функциональные характеристики клеток именно этой клеточной популяции. Наиболее простой моделью являются основные клетки соединительной ткани - диплоидные фибробласты. Культура этой клеточной популяции относительно доступна, особенности роста фибробластов in vitro хорошо изучены и позволяют получить достаточный для исследования клеточный материал в относительно короткие сроки. Для того чтобы
охарактеризовать воздействие гидроксиапати-тов на функциональное состояние диплоидных фибробластов, был выбран один из основных компонентов межклеточного матрикса - фиб-ронектин, выделяемое количество которого контролировалось в ходе эксперимента.
Таким образом, предлагаемая комплексная методика оценки взаимодействия гидроксиапа-титов с культурой диплоидных фибробластов включает в себя следующее:
1) изучение воздействия на жизнеспособность клеток в культуре,
2) изучение воздействия на адгезию клеток,
3) изучение воздействия на пролиферацию клеток в культуре,
4) изучение воздействия на синтез фибро-нектина.
Преимущество предлагаемой экспериментальной модели состоит в том, что практически все изучаемые параметры можно определить достоверно в одном и том же эксперименте в необходимом количестве повторов. Кроме того, для исследования расходуются минимальные количества испытуемого вещества (гидроксиа-патита) и клеточной массы.
Экспериментальная часть
При получении гидроксиапатита Ca5(PO4)3OH использовался золь-гель метод синтеза. Известно, что при твердофазном синтезе размер получаемых частиц находится на микроуровне. Однако для дальнейшего использования указанного вещества (изготовление биоактивных керамических высокопористых материалов) необходимы наноразмерные частицы.
В связи с вышеизложенным, процесс получения гидроксиапатита проводили согласно представленному уравнению реакции:
5 Ca(NO3)2'4H2O + 3 H3PO4 +10 NaOH ^
^ Ca5(PO4)3OH + 10 NaNO3 + 29 H2O.
При этом температура, время синтеза, кислотность среды и концентрации реагентов подбирались таким образом, чтобы получить монофазный продукт с наноразмерными частицами. Подобранные условия синтеза (температура, близкая к комнатной, нейтральная среда, доступные реагенты, время синтеза - 2 часа) говорят о конкурентоспособности разработанной методики и ее потенциальной технологической реализуемости.
Фазовую индивидуальность полученного вещества контролировали с помощью рентгеновского дифрактометра XRD-6000 Shimadzu (CuK„-излучение, геометрия съемки на отражение, шаг сканирования 0.02°, в интервале 20 10-60°).
Высокотемпературные исследования проводили на указанном дифрактометре, оснащенном нагревающей приставкой HA-1001 Shimadzu (в интервале температур 25-900°С) и в дифференциальном сканирующем калориметре Labsys Setaram (аргоновая атмосфера, платиновые тигли, интервал температур 25-900°С).
Регистрацию ИК-спектров гидроксиапатита, приготовленного в виде таблеток с бромидом калия, проводили на ИК-фурье-спектрометре FTIR-8400S фирмы Shimadzu в области 4000 -400 см-1 с разрешением 1 см-1 и накоплением сигнала 20 сканов.
Размер частиц поликристаллического порошка гидроксиапатита определяли с помощью атомно-силового микроскопа ACM Solver-Pro47H (полуконтактный метод съемки, диаметр кантелевера 1 мкм).
Для получения клеточной культуры дер-мальных фибробластов человека использовали метод тканевых эксплантатов [7-9]. Исходным материалом в нашей работе были биоптаты неизмененной кожи, полученные после косметических операций (минимальные остатки кожи не более 1 см2, не востребованные при операциях). Использовали только материал от пациентов, обследованных на RW, гепатиты, ВИЧ при получении отрицательных результатов. В анамнезе пациентов отсутствовали онкологические заболевания, туберкулез, заболевания кожи.
Биоптаты кожи забирали в условиях операционной во флаконы со стерильной ростовой средой, которые доставляли в лабораторию. В качестве среды на этом этапе использовали среду 199 с антибиотиками (пенициллин/стрептомицин).
Дальнейшая работа с исходным материалом и клеточными культурами проходила в культуральном боксе в условиях ламинара. Образцы кожи тщательно промывали средой с антибиотиками (среда 199, пенициллин/стрептомицин для культур клеток), очищали от подкожножировой клетчатки и подвергали ферментативной обработке. Использовали холодовую трип-синизацию (трипсин 0.25%) в течение 18 часов при температуре 4°С. После ферментативной обработки кусочки кожи механически измельчали до разметов 0.1 см2 и в шахматном порядке раскладывали в культуральные флаконы «Costar» 25 см2. в качестве ростовой среды использовали среду ДМЕМ с добавлением антибиотиков, 2% глутамина и 10% телячьей эмбриональной сыворотки.
Все указанные реактивы и среды, использованные в работе производства фирмы ООО «НПО ПанЭко», Россия. В работе используется разовый стерильный пластик («Costar», «Nunc»), протестированный для работы с клеточными культурами.
Рис. 1. Контрольный образец клеточной культуры до эксперимента при различном увеличении
Дальнейший рост культуры проходил в условиях СО2-инкубатора при 5% СО2, температуре 37°С, абсолютной влажности. По достижении субконфлюэнтного монослоя проводили пересевы (пассажи) клеток с помощью трипси-низации до накопления достаточной клеточной массы. На всех этапах роста культуры формирование монослоя и стерильность контролировали ежедневно с помощью инвертированного микроскопа «Leica». Кондиционная среда каждой культуры перед использованием в эксперименте проверялась с помощью ПЦР на наличие микоплазм и вирусов (вирусов герпеса, цитоме-галовируса, вируса Эпштейна-Барр). Для ПЦР-анализа использовали систему Rotor-Gene 6000, Австралия и наборы реагентов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Культура, подготовленная к эксперименту, представляла собой микроскопически равномерный монослой с типичным рисунком в виде «завитков». Характерная визуальная картина нативной культуры перед вводом в эксперимент представлена на рис. 1. Для экспериментов на клетках использовали четыре штамма культур дермальных фибробластов человека 5-6 пассажа.
Фибронектин - мультифункциональный высокомолекулярный гликопротеин - синтезируется фибробластами и является одним из важнейших компонентов межклеточного матрикса. Фибронектин содержится в биологических жидкостях и тканях и участвует в регуляции функций лейкоцитов, тромбоцитов, ретикуло-эндотелиальной системы, пролиферации и дифференцировке фибробластов и эпидермальных клеток и играет важнейшую роль в процессах заживления ран [10-12]. В процессе роста нормальных фибробластов в культуре в течение первых двух суток происходит внутриклеточное накопление этого белка, а, начиная с третьих суток, фибронектин обнаруживается и начинает накапливаться в ростовой среде [12, 13].
Для количественного определения фибро-нектина применяли твердофазный иммунофер-ментный анализ. Использовали иммунофер-ментные наборы группы компаний ВСМ «Био-
химмак». Оптическую плотность (ОП) измеряли на иммуноферментном анализаторе «Sunrise» производства Австрии с использованием программы Magellan. Интенсивность окраски, измеренная при длине волны 450 нм и длине волны сравнения 620 нм, прямо пропорциональна концентрации фибронектина, присутствующего в образцах.
Эксперимент проводили следующим образом: на шесть лунок 24-луночного культурального планшета выкладывали образцы гидроксиа-патита площадью примерно до 10% площади лунки. Следующие 6 лунок использовались для контроля 1 (контроль - клетки), 2 лунки — контроль 2 (среда без клеток и без вещества), 2 лунки — контроль 3 (среда + гидроксиапатит).
Клетки высевали в лунки трех культуральных планшетов по 20 тысяч на см2 (на лунку) и на 9 матрацев площадью 25 см2. В качестве ростовой среды использовали среду ДМЕМ с добавлением антибиотиков, 2% глутамина и 10% телячьей эмбриональной сыворотки.
Таким образом, в планшете использовали 16 лунок в следующем порядке: 6 лунок — гидро-ксиапатит + клетки, 6 лунок — контроль 1, 2 лунки — контроль 2, 2 лунки контроль 3. На 3 матраца выкладывали по 1/10 гидроксиапатита,
3 матраца — контроль.
Для оценки отдаленного воздействия исследуемого вещества на клетки в культуре в процессе роста регистрировали состояние культуры в следующие сроки после пересева: через 48, 72 и 96 ч. На всех сроках наблюдения отмечали визуальные характеристики культуры: состояние монослоя и самих клеток. Фиксировали состояние культуры при увеличениях х40, х100, х200, оценивали выраженность адгезии клеток к культуральному пластику. Визуальные характеристики культуры оценивали в нативном состоянии и после окраски. В качестве красителя использовали азур-эозин по Романовскому. Перед окраской из каждой лунки отбирали пробы кондиционной среды для последующего определения содержания фибронектина. Пробы центрифугировали для отделения клеточных от-
6)
ЯАлм. гига
Ьт
Рис. 2. Изображение наночастиц гидроксиапатита (а, б) и профиль поверхности образца (в), полученные атомносиловым микроскопом
ломков, отбирали надосадок и замораживали при -80 С. Клетки в матрацах через 48, 72, 96 часов снимали с помощью трипсинизации и подсчитывали концентрацию и процент погибших клеток с помощью гемоцитометра. Жизнеспособность клеток определяли, используя в качестве прижизненного красителя трипановый синий.
Результаты и их обсуждение
При синтезе гидроксиапатита по разработанной методике был получен наноразмерный порошок со средним размером частиц порядка 80 нм, что подтверждено методом атомносиловой микроскопии (рис. 2).
Сочетание методов высокотемпературной рентгенографии и дифференциальной сканирующей калориметрии показало отсутствие каких-либо фазовых превращений Са5(Р04)30Н в интервале температур 25-600°С, что свидетельствует о сохранении групп ОН в структуре соединения. Данный факт был также подтвержден методом ИК-спектроскопии. Из приведенного на рис. 3 спектра видно, что полосы, характерные для валентных колебаний групп ОН, сохраняются. Кроме того, спектр демонстрирует отсутствие характерных для группы СО3 полос на 870 и 1450 см-1. Опасность изоморфного внедрения карбонатных групп в гидроксиапатит с образованием твердых растворов состава
Са10(Р04)6(0Н)2-2х(С03)х, значительно ухуд-
шающих механические свойства будущего материала, ранее описывалась в литературе [14, 15]. Как показали наши исследования, при температуре 37°С внедрение карбонатных групп не происходит. На наш взгляд, подобные явления имеют место только в гидротермальных условиях. Кроме того, низкая температура синтеза и вода в качестве растворителя делают разработанную методику более приемлемой для воплощения в промышленном масштабе. Также существенным плюсом описанного способа синтеза является возможность получения больших (до нескольких сотен грамм) количеств наноразмерного гидроксиапатита в течение непродолжительного времени.
В рамках опытов на клетках были проведены четыре серии экспериментов. Результаты одного из них представлены ниже и на рис. 4-6, в табл. 1-2.
V, см'1
Рис. 3. ИК-спектр гидроксиапатита Са5(Р04)30Н, полученного золь-гель методом
При ежедневной контрольной микроскопии через 24 часа наблюдали следующее: контроль 1 (клетки без образцов) - культура в хорошем состоянии, клетки распластаны на поверхности, единичные клетки в среде, форма клеток преимущественно веретеновидная, реже звездчатая, отростки выражены, ядра отчетливо конту-рируются, рисунок монослоя типичен для фиб-робластов, рост неравномерный - в центре густой рост, по периферии редкий.
Примесей в среде нет, выраженных изменений pH на протяжении всех сроков наблюдения за культурой не отмечено.
В опытных лунках гидроксиапатит + клетки картина идентична таковой в контроле: в среде единичные клетки, зон альтерации нет, рост неравномерный.
Состояние культуры через 48 часов (рис. 4).
В опытных лунках серии гидроксиапатит + клетки картина практически идентична таковой в контроле, рост клеток неравномерный, очень густой в центре лунок и более редкий по пери-
х40
хЮО
ферии, структура клеток не нарушена, рисунок монослоя правильный, в среде единичные клетки, зон альтерации нет, отмечается концентрация клеток вокруг мелких частиц гидроксиапа-тита. На месте образцов гидроксиапатита виден отчетливый рост клеток. Картина идентична во всех опытных лунках этой серии.
В контрольных лунках 1 (среда + клетки) отмечен неравномерный рост, очень густой в центре и более редкий к периферии лунки. Рисунок монослоя правильный, клетки с четкими контурами, плотными ядрами, выраженными отростками, единичные клетки в среде.
Состояние культуры через 72 часа (рис. 5).
Во всех лунках серии гидроксиапатит + клетки виден неравномерный рост, очень густой в центре, более редкий по периферии. Зон разрушения нет. Вокруг мелких кусочков гидроксиа-патита отмечается выраженное сгущение клеток. Клетки в культуре преимущественно веретеновидной формы, с плотными ядрами, выраженными отростками.
х200
И
• *>?:'• -'Ї-Г.'-ІЗЕ: " с’-ґ,.-; а? - - • - .у— •• - - 4 -V- < • " У * "*■ » ^ л v',v і' - я p* v '!>•'t ¿f. •
V •
х40
Рис. 4. Состояние культуры через 48 часов наблюдения
хЮО х200
«v.
И
о
Он
К
1-4
S-A4.“'' V#«'»-'* ’"ic'sSS
•V. Л" .V'.wSi
; * і * r *V- и
і чЗ... Y ** +
4 С? . * * V
Рис. 5. Состояние культуры через 72 часа наблюдения
х40 хЮО х200
Рис. 6. Состояние культуры через 96 часов наблюдения
Таблица 1
Изменение концентрации клеток (шт.) в процессе роста культуры в сериях экспериментов
с образцами гидроксиапатита
Серия Г идроксиапатит + клетки Контроль - клетки
№№ Сроки наблюдения
эксперимента 48 ч 72 ч 96 ч 48 ч 72 ч 96 ч
1 679932 1063237 1120934 673266 874357 1100204
2 554000 647700 1044400 555000 583000 1046600
3 666629 762600 999900 706593 808880 1166550
4 443289 533280 833250 369964 399960 866580
Таблица 2
Содержание фибронектина в культуральной среде (в мкг/мл) в сериях экспериментов
с образцами гидроксиапатита
Серия Г идроксиапатит + клетки Контроль - клетки
№№ Сроки наблюдения
эксперимента 48 ч 72 ч 96 ч 48 ч 72 ч 96 ч
1 1.490 1.980 1.840 1.560 1.660 1.840
2 1.000 1.110 1.540 0.900 0.950 1.550
3 0.452 0.690 1.067 0.477 0.726 0.867
4 0.500 0.790 1.110 0.590 0.960 1.270
Во всех лунках контрольной серии рост культуры неравномерный, очень густой в центре, более редкий по периферии лунок. Можно видеть монослой с правильным типичным рисунком, клетки с четкими контурами, плотными ядрами, цитоплазма гомогенная, отростки выражены, единичные плавающие клетки в среде.
Состояние культуры через 96 часов (рис. 6).
Во всех лунках серии гидроксиапатит + клетки отмечается неравномерный рост клеток, от частой сеточки по краям лунки до конфлюэнтного монослоя, особенно вблизи гидроксиапатита, в центре лунок. Рост клеток не нарушен, рисунок монослоя правильный, отмечается концентрация клеток вокруг мелких частиц гидроксиапатита. Единичные открепившиеся клетки в среде.
Во всех лунках контрольной серии 1 (среда + клетки) отмечается рост в виде монослоя, к центру - очень густой. Рисунок монослоя правильный, клетки с четкими контурами, плотными ядрами, выраженными отростками, единичные клетки в среде.
Результаты изменения концентрации, выраженность и изменение содержания фибронек-тина в среде в процессе роста культуры в присутствии гидроксиапатита и в контрольных сериях без него представлены в табл. 1-2.
Таким образом, результаты эксперимента демонстрируют отсутствие токсического воздействия представленных образцов гидрокси-апатита на культуру дермальных фибробластов человека. При визуальном наблюдении на всех сроках исследования повреждения клеток не выявлено, можно видеть увеличение количества
клеток вокруг мелких частиц гидроксиапатита. Концентрация клеток в опытных сериях с образцами гидроксиапатита нарастает аналогично изменениям концентрации в контрольных сериях. Изменение содержания фибронектина в сериях с образцами гироксиапатита происходит параллельно таковому в контрольной группе: уровень фибронектина начинает нарастать с третьих суток и плавно увеличивается до окончания эксперимента. Эксперименты показали высокую адгезию клеток к культуральному пластику.
Заключение
В результате проведенной работы разработана новая методика получения наноразмерного гидроксиапатита и экспериментальная комплексная методика изучения его воздействия на функциональные характеристики клеток человека в системе in vitro, которая показала, что синтезированный гидроксиапатит не токсичен для культуры дермальных фибробластов человека в системе in vitro. Свидетельством нейтральности образцов гидроксиапатита является отсутствие повреждения клеток в культуре на протяжении всех сроков наблюдения, хорошая адгезия клеток к поверхности пластика в этих сериях, отчетливая пролиферация клеток в культуре в присутствии образцов гидроксиапа-тита, удвоение концентрации клеток к четвертым суткам, накопление фибронектина в сериях с образцами этого вещества. Более того, практически во всех исследованных сериях с гидро-ксиапатитом наблюдается концентрация клеток вокруг мелких образцов препарата, что свидетельствует о возможности повышения адгезии клеток на этом веществе.
Следовательно, гидроксиапатит, полученный технологией золь-гель метода, может использоваться для создания препаратов, применяемых в медицинских целях.
Работа проводилась в сотрудничестве с Центром сетевой интеграции Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского в целях создания системы управления инновационными проектами, имеющими высокий научный и коммерческий потенциал.
Список литературы
1. Best S.M., Porter A.E., Thian E.S., Hyang J. // J. Eur. Ceram. Soc. 2008. V. 28. P. 1319-1327.
2. Баринов С.М. // Успехи химии. 2010. Т. 79. С. 15-33.
3. Barralet J.E., Grover L., Gaunt T., Wright A.J., Gibson I.R. // Biomaterials. 2002. V. 23. P. 3063 - 3072.
4. Sternlieb M.P., Brown H.M., Schaeffer C.D.Jr., Yoder C.H. // Polyhedron. 2009. V. 28. P. 729-732.
5. Баринов С.М., Комлев В.С. Биокерамика на основе фосфатов кальция. М.: Наука, 2005. 125 с.
6. Fellah B.H., Layrolle P. //Acta Biomaterialia. 2009. V. 5. P. 735-742.
7. Ham R.G. // Methods in cell biology. 1980. V. 21A, Ск 16. P. 253-275.
8. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Методы. М.: Мир, 1989. 333 с.
9. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. М.: БИНОМ, 2010. 691 с.
10. Лавров В.А., Заец Т.Л. //БЭБиМ. 1998. Т. 125. № 3. С. 355-357.
11. Grinnel F. // J. Cellular Biochemistry. 1984. V. 26. P. 1-10.
12. Алексеев А.А., Лавров В.А., Ушакова Т.А. // Хирургия. 2000. № 2. С. 50-53.
13. Нго Т.Т., Ленхофф Г. Иммуноферментный анализ. М.: Мир, 1988. 444 с.
14. Muller L., Conforto E., Caillard D., Muller F.A. // Biomolecular Engineerring. 2007. V. 24. P. 462-466.
15. Habibovic P., Juhl M.V., Clyens S., Martinetti R., Dolcini L., Theilgaard N., van Blitterswijk C.A. // Acta Biomaterialia. 2010. V. 22. P. 2219-2226.
SYNTHESIS AND IN VITRO INVESTIGATION OF NANOSIZED HYDROXYAPATITE
A. V. Knyazev, E.N. Bulanov, D.Ya. Aleinik, I.N. Charykova, A.E. Zemskov, A. V. Kalentiev
A new procedure for obtaining nanosized hydroxyapatite (Ca5(PO4)3OH) powder is presented. The obtained compound has been tested on a human fibroblast cell culture to clarify its biological compatibility and activity. The synthesized hydroxyapatite is shown to be non-toxic to human dermal fibroblast cultures in vitro.
Keywords: hydroxyapatite, synthesis, fibroblasts.
