CC BY
28УДК 616.092.19
ТЕСТИРОВАНИЕ ПОВЕРХНОСТЕЙ ДЕНТАЛЬНЫХ ИМПЛАНТАТОВ РАЗЛИЧНОЙ ПОДГОТОВКИ НА ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ НА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ
© 2019 С.В. Купряхин
ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Саратов
Одним из самых распространенных материалов для дентальной имплантации является титан, который давно уже зарекомендовал себя во всех отношениях: как биоинертный, достаточно пластичный и легкообраба-тываемый. Винтовые имплантаты самые распространенные и отличаются лишь формой, резьбой и способом подготовки поверхности имплантата. Обращает на себя внимание, что с точки зрения механики повреждающее действие имплантата на живые ткани одинаково. Но от качества обработки поверхности зависит процесс остео-интеграции и дальнейшее функционирование опорных элементов. Следовательно, взаимодействие кости и имплантата в системе «кость - подготовленная поверхность» становится важным фактором, обеспечивающим приживаемость имплантата. Таким образом, представляется необходимым исследовать влияние способа обработки поверхности имплантата на предмет токсичности для живой ткани. В литературе имеется много данных от разработчиков имплантатов, которые различными способами добиваются повышения пористости материалов для улучшения остеоинтеграции. К сожалению, они не всегда благоприятно влияют на репаративные процессы, поэтому требуют более детального исследования не только с механико-фармакологической точки зрения, но с позиции живой ткани - биосовместимости также не находит оптимального решения, что осложняет внедрение в практическое здравоохранение инноваций с биоэтической точки зрения.
Ключевые слова: дентальные имплантаты, культура МСК человека, титан - пескоструйная обработка, напыление титановой крошкой, напыление титановой крошкой + гидроксиаппатит.
Введение. На рынке стоматологических услуг проведение дентальной имплантации становится обычной операцией и практически доступной в любой клиники. Сдерживающим фактором остается высокая цена имплантации, вследствие дороговизны имплантационных систем. Выбор систем имплантации достаточно высок - практически каждый год на рынок выводят новые системы, но при этом цена, к сожалению, сколько-нибудь значительно не снижается. Вторым фактором, сдерживающим количество устанавливаемых имплантатов -ограничение типоразмеров имплантатов, которые не позволяют максимально использовать существующий у пациента объём костной ткани и устанавливать оптимальное количество и размерность имплантата. В этом стремлении различные исследователи предлагают либо наращивать костную ткань за счёт получения аугментата, либо модернизировать покрытие поверхности имплантат. На наш взгляд, это не всегда оправдано. Известно, что наиболее распространенным материалом для изготовления дентальных имплантатов служит титан. Практически все производители предлагают винтовые конструкции, отличающиеся резьбой и способом подготовки поверхности, в месте будущей остеоинтеграции. Таким образом, повреждающим агентом, во время репарационных процессов, будет именно эта поверхность. Представляется необходимым исследовать влияние способа обработки поверхности имплан-тата на предмет токсичности на живую ткань.
Интенсивное развитие биотехнологий в XXI веке привлекло внимание учёных всего мира к культурам клеток млекопитающих как к живой системе, которую можно использовать для научных исследований в самых разнообразных областях биологии, медицины. Применение клеточных культур в тестировании различных материалов и препаратов на цитотоксич-ность является весьма прогрессивным как с позиции биоэтики (Трунин Д.А., Садыков М.И., Волова Л.Т., Нестеров А.М., Россинская В.В., 2016; Котельников Г.П., Колсанов А.В., Нико-лаенко А.Н., Волова Л.Т., Россинская В.В., 2018), так и с точки зрения экономической выгоды по сравнению с экспериментами на животных. Кроме того, использование клеток человека позволяет с большей долей вероятности экстраполировать полученную информацию на целостный организм.
В литературе также появляется много данных от разработчиков имплантатов, которые различными способами добиваются повышения пористости материалов для улучшения остеоинтеграции. К сожалению, они не всегда благоприятно влияют на репаративные процессы, поэтому требуют более детального исследования не только с механико-фармакологической точки зрения, но с позиции живой ткани - биосовместимости также не находит оптимального решения, что осложняет внедрение в практическое здравоохранение инноваций с биоэтической точки зрения.
Цель: определить цитотоксичность дентальных имплантатов в зависимости от способов подготовки их поверхностей, в системе «кость - подготовленная поверхность», с помощью клеточных технологий.
Задачи:
1. Провести тестирование поверхности дентальных имплантатов различной подготовки с помощью клеточных технологий.
2. Определить цитотоксичность титановых поверхностей, обработанных различными способами.
3. Провести анализ с целью определения оптимального способа подготовки дентального имплантата из титанового сплава
Материал и методы исследования. Работа проведена в лаборатории культур клеток ИЭМБ Самарского государственного медицинского университета. Данная лаборатория в соответствии со стандартом ISO 5 оснащена комплексом «чистых помещений» класса В с возможностью создания зон класса А в соответствии со стандартом ISO 5. Все работы с материалом выполнялись в ламинарных боксах БАВп-01 «Ламинар-С» (ЗАО «Ламинарные системы», Миасс, РФ) второго класса биологической защиты с применением всех правил асептики и антисептики.
Оборудование, использованное при выполнении работы:
- Ламинарный бокс БАВп-01 «Ламинар-С» (ЗАО «Ламинарные системы», Миасс, РФ) второго класса биологической защиты;
- СО2-инкубатор МСО-18АС («Sanyo» Япония);
- Рефрижераторная центрифуга Eppendorf 5702R («Eppendorf» Германия);
- Термошейкер возвратно-поступательный ES-20 («Biosan» Латвия);
- Система визуализации - аппаратно-программный комплекс (АПК) на основе инвертированного микроскопа Olympus CKX 41 («Olympus», Япония), цветной цифровой камеры
Olympus SC 100 («Olympus», Корея) и стационарного компьютера, с программным обеспечением CellSens Standart 1.7 («Olympus», Япония);
- Система визуализации - аппаратно-программный комплекс (АПК) на основе исследовательского микроскопа Olympus BX41 («Olympus», Япония), цветной цифровой камеры «ProgRes CF» и стационарного компьютера с программным обеспечением «Морфология 5.2» («ВидеоТесТ», Россия);
- Автоматический цифровой счётчик клеток Scepter™ («Merck Millipore», Германия).
Реактивы и материалы, использованные при выполнении работы:
- одноразовая пластиковая посуда квалификации «для культур клеток»: культуральные флаконы 25 см2 и 75 см2 («ТРР», Швейцария); чашки Петри диаметром 3,5 см («Orange Scientific», Бельгия), 24-луночные планшеты с плоским дном («ТРР», Швейцария);
- все реактивы для выращивания клеток квалификации «для культур клеток» производства ООО «Биолот», Россия.
Тестируемые материалы. Для исследования были представлены образцы титана ВП1-00, поверхность которых была обработана различными способами (3 вида). Все они имели форму диска диаметром 0,5 см и толщиной 0,2 см. Образцы титана без специальной обработки и/или покрытия (с гладкой шлифованной поверхностью) были использованы в качестве группы сравнения. Всего было сформированно 5 групп: 1) титан (группа сравнения); 2) титан с пескоструйной обоаботкой; 3) напыление титановой крошкой; 4) напыление титановой крошкой + гидроксиаппатит (ГА); 5) контрольная.
Тестовая культура. Тестирование проведено на культуре мезенхимальных стромальных клеток (МСК), выращенной из фрагментов пуповины по методике, описанной в патенте № 2455357 от 10.07.2012 г., в собственной модификации. Фрагмент пупочного канатика был получен в роддоме при срочных родах с добровольного информированного согласия роженицы. Забор первичного материала проводили, основываясь на положениях Федерального закона РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека от 22 декабря 1992 г. № 4180-1 и после одобрения Комитетом по биоэтике при СамГМУ. Роженица была соматически здорова, беременность и роды протекали без осложнений. МСК выращивали с использованием полной ростовой среды (среда а-МЕМ с добавлением 15 % эмбриональной телячьей сыворотки и 40 мкг/мл гентамицина) в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С, постоянной влажности и 5 % СО2. Перед исследованием выращенная культура идентифицирована с помощью морфологических и биохимических методов. Обследование методом ПЦР подтвердило отсутствие контаминации культуры инфекционными агентами, в том числе микоплазмами и ЦМВ.
Тестирование проводили методом прямого контакта согласно рекомендациям межгосударственного стандарта ГОСТ ISO 10993-5-2011 (3). МСК 2 пассажа снимали со дна культу-рального флакона стандартным способом (при помощи 0,25 % раствора трипсина и 0,02 % раствора Версена) и пересевали в культуральные планшеты с плоским дном в дозе 1х104 кл/см2 (4). После того как МСК сформировали неплотный монослой, на него осторожно, чтобы не повредить клетки, помещали образцы исследуемого материала. Контролем служили лунки с культурами без образцов. Взаимодействие объекта и тест-системы наблюдали в течение 7 суток.
Ежедневно производили визуальную оценку и фотографирование нативной культуры с помощью аппаратно-программного комплекса (АПК) на основе инвертированного микроскопа Olympus CKX 41, при увеличении 100, 200 оценивали структурные особенности клеток и монослоя в целом.
По окончании эксперимента клетки на дне лунок планшетов окрашивали гематоксилином Майера и суданом IV по стандартной методике для выявления структурных изменений. Анализ окрашенных препаратов, фотографирование и морфометрию производили с помощью АПК на основе исследовательского микроскопа Olympus ВХ41, с использованием программного обеспечения «Морфология 5.2» при увеличении 100 и 400.
Пролиферативную активность и жизнеспособность клеток характеризовали на основании следующих показателей: плотность монослоя на единицу площади, индекс пролиферации, наличие жизнеспособных и поврежденных клеток в монослое.
Обсуждение результатов. В нативной культуре МСК, начиная с первого пассажа, имеют полигональную, ромбическую или слегка вытянутую форму, четкие границы и эксцентрично расположенные ядра овальной формы. В большинстве МСК цитоплазма визуально гомогенная, отростки короткие, их от 2 до 5 в зависимости от формы клетки. Встречаются единичные крупные клетки, в цитоплазме которых четко различаются эндо- и эктоплазма и присутствуют оптически пустые мелкие вакуоли. В окрашенных препаратах наблюдается аналогичная картина, в нуклеоплазме наблюдаются различные варианты распределения хроматина в зависимости от фазы клеточного цикла (рис. 1).
\ \
Рис. 1. Культура МСК человека. Окраска окр. гематоксилином Майера и суданом IV. Ув. 400
Культивирование МСК в присутствии образцов титана с разным характером поверхности показало следующее. В первых трех группах пролиферативная активность была практически одинаковой и не отличалась от контроля (ИП 1,4). В то же время в группах 2 и 3 в цитоплазме четко определялись эндо- и эктоплазма (рис. 3, 4), а в группе 2 в эндоплазме некоторых крупных клеток определялись жировые включения в виде мелких капель (рис. 3). Плотность клеток в монослое колебалась от 465 до 475 кл/мм2, а количество жизнеспособных клеток - от 92 до 95%. Характерно, что монослой вокруг образцов был значительно более плотным.
Рис. 2. Культура МСК человека в присутствии образца титана. Окраска окр. гематоксилином
Майера и суданом IV. Ув. 400
Рис. 3. Культура МСК человека в присутствии образца титана с пескоструйной обработкой. Окраска окр. гематоксилином Майера и суданом IV. Ув. 400
Рис. 4. Культура МСК человека в присутствии образца титана с напылением титановой крошкой. Окраска
окр. гематоксилином Майера и суданом IV. Ув. 400
В 4 группе картина резко отличается. Только на периферии лунок плотность монослоя приближается к контролю. На остальной площади лунок, особенно вокруг образцов, преобладали мелкие вытянутые клетки с двумя длинными отростками и грубозернистой цитоплазмой, плотность монослоя по окончании эксперимента составляла 229 кл/мм2. Во многих МСК при окраске гематоксилином и суданом IV визуализировались жировые включения (рис. 5). В нативной культуре были видны высыпания частиц ГА, которые вызывали дополнительные механические повреждения клеток.
Рис. 5. Культура МСК человека в присутствии образца титана с напылением титановой крошкой и ГА. Окраска окр. гематоксилином Майера и суданом IV. Ув. 400
Таким образом, тестирование на культуре МСК образцов титана 2, 3 и 4 с помощью морфологических методов показало отсутствие их цитотоксичности, Образцы титана с напылением титановой крошкой и ГА продемонстрировали достоверную цитотоксичность; кроме того, частицы отделяющегося с поверхности образцов ГА механически повреждают клетки монослоя. Не исключено, что подобное явление может происходить при помещении такого материала в ткани пациента.
Выводы: 1. Титан - образец с пескоструйной обработкой и образец, с напылённой титановой крошкой, а также «чистый» титан: с помощью морфологических методов показало отсутствие их цитотоксичности.
2. Титан с напылением титановой крошкой и ГА достоверно цитотоксичен; кроме того, частицы отделяющегося с поверхности образцов ГА механически повреждают клетки монослоя.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Федеральный закон РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» от 22 декабря 1992 г. № 4180-1 URL: http://base.garant.ru/5629839/ (дата обращения 14.12.18).
2 ГОСТ ISO 10993-5-2011. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro. URL: http://base.garant.ru/5245987/ (дата обращения 14.12.18).
3 Волова Л.Т., Пономарева Ю.В., Розенбаум А.Ю. Значение тестирования на культуре клеток для выявления малотоксичного эффекта средств медицинского назначения // Вестник неотложной и восстановительной медицины. - 2012. - Т. 13. - № 1. - С. 48-51.
