CC BY
12
УДК 619:579.842.11
ИСПЫТАНИЕ ПРЕПАРАТА «ПОЛИАПИСОГЕН» ПРИ ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНОМ ЭШЕРИХИОЗЕ
Гайзатуллин Р.Р.
ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань
Ключевые слова: эшерихиоз, белые мыши, композиционный препарат «Полиаписоген», иммунотерапия.
Key words: esherihioz, white mice, composite drug «Poliapisogen», immunotherapy.
Действенным оружием антиинфекционной защиты организма животных и человека является иммунотерапия с использованием лечебно-профилактических сывороток и глобулинов, в частности, противоколибактериозной антитоксической сыворотки при эшерихиозе. Однако, несмотря на определенную эффективность применения указанной сыворотки, нередко она теряет свою, поскольку, в настоящее время многие инфекционные болезни, в том числе и эшерихиозы, протекают в виде осложнений, обусловленных воздействием на организм сочетанного действия антропогенных факторов физической, химической и биологической природы. Поэтому применение на этом фоне регламентированных при конкретной инфекции средств не достигает цели, что диктует необходимость усовершенствования существующих и разработку более эффективных лечебно-профилактических средств.
Основываясь на принципе К. Ландштейнера (1946) о возможности получения конъюгированных антигенов на основе низкомолекулярных химических соединений и белковых носителей, нами был сконструирован комплексный (белково-кадмиевый радиоантиген - БКРА) антиген, который индуцировал в организме экспериментальных животных синтез факторов антиэшерихиозной, антикадмиевой и антирадиационной защиты. На основе поликлональных антител (полиглобулинов), продуктов пчеловодства (Вита-Форце), продуктов метаболизма B.subtilis, B.bifidum и микрочастиц природного минерала-монтмориллонита нами был сконструирован
полифункциональный композиционный лечебно-профилактический препарат «Полиаписоген», обладающий широким спектром биологического действия.
Учитывая многокопонентность препарата и вероятность наличия в его составе антиинфекционного, антитоксичного и антирадиационного факторов, проводили настоящие исследования, целью которых
является испытание лечебной антиинфекционной активности препарата при экспериментальном эшерихиозе.
Материалы и методы. Для моделирования эшерихиозной инфекции в качестве тест-микроба использовали вирулентный (энтеропатогенный) штамм возбудителя эшерихиоза поросят Е. coli «KB-1», продуцирующий адгезивный антиген К-99, который вводили внутрибрюшинно в дозе 2x106 м.к./мышь. В опытах использовали 120 белых мышей обоего пола, живой массой 17-20 г, разделенных на 6 групп по 20 животных в каждой. Животным 1-й группы, за 24 ч до заражения возбудителем эшерихиоза, однократно подкожно вводили инъекционную форму препарата «Полиаписоген» в дозе 25 мг/кг по сухому веществу; животным 2-й группы - в тех же дозах и идентичных условиях препарат вводили через 24 ч после заражения; животным 3-й группы за 24 ч до заражения вводили антиэшерихиозную сыворотку и внутримышечно хлорамфеникол в дозе 20-35 мг 2-3 раза в день в течение 5-7 дней подряд; животным 4-й группы указанные препараты в тех же дозах вводили через 24 ч после заражения; зараженным животным 5-й группы никакие препараты на вводили и они служили контролем заражения; животных 6-й группы не заражали и никакие препараты им не вводили - они служили биологическим контролем
Развитие эшерихиозного инфекционного процесса в зараженном организме и его модификации под воздействием испытуемого композиционного препарата «Полиаписоген» контролировали по клинико-гематологическим, иммунологическим, микробиологическим и патоанатомическим показателям. Подтверждением диагноза на эшерихиоз являлось развитие лейкопении и гранулоцитопении в периферической крови, уменьшение содержания глобулинов в сыворотке крови, нарушение иммунорегуляторного индекса (ИИ) - дисбаланс Т-хелперного и Т-супрессорного соотношения субпопуляций лимфоцитов (Th/Ts), развитие постинфекционного антителогенеза и лейкопении, микробная обсеменность органов и тканей.
Результаты исследований и обсуждение. Динамическое наблюдение за животными и гематоксические, иммунологические и микробиологические исследования показали, что однократное подкожное введение препарата «Полиаписоген» оказывало модифицирующее действие как на течение эшерихиозной инфекции, так и на указанные показатели инфекционного процесса. В таблице 1 представлены результаты изучения показателей периферической крови зараженных возбудителем эшерихиоза и на леченых испытуемым препаратом белых мышей через- 3 дня после заражения и лечения животных.
1. Влияние препарата «Полиаписоген» на показатели периферической крови пораженных возбудителем эшерихиоза белых мышей (на 3-и
сут после заражения)
Группы животных Эритроциты, 10% Лейкоциты, 10% Нейтрофилы, 109/л Лимфоциты, 109/л Моноциты, %
Контрольная 8,5±0,3 2,9±0,2 0,9±0,0; 1,8±0,2 1,1 ±0,3
Зараженная Е. coli «KB-1» 8,1±0,5 1,03±0,Г о,2±о,о; * 0,7±0,З * 0,6±0,01
Зараженная и
леченная препаратом «Полиаписоген» 8,3±0,1 2,7±0,09 0,7±0,0 1,6±0,07 0,9±0,07
Из данных таблицы видно, что однократное подкожное введение инъекционной формы препарата «Полиаписоген» зараженным возбудителем эшерихиоза белым мышам через 24 ч после заражения, оказывало гемопротективный эффект, препятствуя постинфекционной лейкопении, нейтропении и лимфопении.
Учитывая, что гемопротективное действие иммунотропных препаратов реализуется через систему иммунитета посредством гуморальных (иммуноглобулины, медиаторы иммунитета - цитокины) и клеточных (Т- и В-лимфоциты, макрофаги) компонентов (Anderson R.E. 1983), нами были проведены параллельные исследования по изучению состояния клеточного и гуморального иммунитета у зараженных возбудителем эшерихиоза и леченных испытуемым препаратом белых мышей.
Результаты исследований показали (табл.2), что развитие эшерихиозного инфекционного процесса в организме сопровождалось значительными изменениям системы клеточного и гуморального иммунитета: к моменту гибели белых мышей от эшерихиозной интоксикации последовало почти двукратное (в 1,96 раза, Р<0,05) снижение содержания В-лимфоцитов при одновременном увеличении (в 1,16 раза, Р>0,05) количества Т-лимфоцитов. Увеличение содержания Т-лимфоцитов происходило за счет увеличения Т-хелперов при одновременном уменьшении содержания Т-супрессоров (в 1,12 раза, Р>0,05).
Указанный дисбаланс (разнонаправленность) субпопуляционного состава Т-клеток под воздействием инфекционного агента является важнейшим показателем функционирования клеточного звена иммунитета и характеризуется как хелперно-супрессорное соотношение (Th/Ts). Как видно из данных таблицы 2, развитие эшерихиозной инфекции у белых мышей сопровождалось существенным нарушением
иммунорегуляторного индекса в сторону увеличения этого показателя (Th/Ts=3,05).
2. Состояние клеточного и гуморального иммунитета у зараженных возбудителем эшерихиоза и леченных препаратом «Полиаписоген» белых мышей (на 3-й сут после заражения)
Показатель Г руппы животных
контрольная зараженная Е. соН «КВ-1» леченная «Полиаписоге
В-лимфоциты, % 22,9±0,7 * 11,7±0,5 19,5±0,3
Т-лимфоциты, % 42,7±1,9 49,5±1,1 41,9±2,1
Т-хелперы, % 29,3±1,3 31,5±1,9 28,7±1,5
Т-супрессоры, % 11,5±1,5 10,3±1,7 10,7±1,8
Соотношение ^/Г 2,54 3,05 2,68
Иммуноглобулины класса G 25,3±1,3 * 14,7±2,5 23,9±1,1
Бласттрансформирующая активность лимфоцитов (РБТЛ,%) 54,7±3,9 * 27,3±1,7 50,5±2,7
РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов.
Несмотря на то, что увеличение Т-хелперов при одновременном уменьшении Т-супрессоров должно было бы свидетельствовать о положительной иммунобиологической перестройке организма, однако у пораженных возбудителем эшерихиоза животных увеличение субпопуляционного индекса не приводило к усилению синтеза иммуноглобулинов, а наоборот, последовало резкое (в 1,72 раза, Р<0,05) снижение содержания иммуноглобулинов (IgG) и бласттрансформирующей активности лимфоцитов. Неспособность синтеза В-клетками IgG ассоциируется иммунопатологией с активацией Lg-1, Qa-1+-хелперных и Lg-123+, Qa-1+-регуляторных Т-клеток, которые сдерживают синтез иммуноглобулинов. Как известно, для этого необходима активация Т-хелперов типа Lg-1 Qa-1+ и Lg-1 Qa-1- (Cantor H. 1980). Следовательно, увеличение субпопуляционного индекса (Th/Ts) при эшерихиозе свидетельствует о развитии в пораженном организме иммунотоксического (аллергического) процесса, обусловленного накоплением в организме токсических продуктов метаболизма Е. coli: экзо- и эндотоксинов, обладающих сенсибилизирующими свойствами.
Однократное подкожное применение испытуемого препарата оказывало иммунорегуляторное действие на клеточный и гуморальный иммунитет, обеспечивая нормализацию иммунорегуляторного индекса с восстановлением функциональной активности В-лимфоцитов,
обеспечивающих синтез IgG на фоне восстановления их бласттрансформирующей активности (РБТЛ).
Развитие септической формы эндотоксемии у пораженных возбудителем эшерихиоза животных сопровождалось не только нарастанием обсеменения тонкого кишечника Е. coli, но и транслокацией патогенного агента из кишечника во внутренние органы, обусловливая бактериемию. Результаты анализа особенностей развития эшерихиозной инфекции у животных и лечения испытуемым препаратом представлены в таблице 3, в которой, с целью ограничения цифрового материала, приведены только данные исследования на 3-й сут после заражения и лечения испытуемым препаратом.
3. Содержание E. coli и Enterobacter в тонком отделе кишечника зараженных возбудителем эшерихиоза и леченных препаратом «Полиаписоген» белых мышей (КОЕ/г, lg)
Группа Е. coli Enterobacter
частота высевов, % содержание на грамм ткани, lg) частота высевов, % содержание на грамм ткани, lg)
Контрольная 7,3 0,13±0,02 1Д2 0,07±0,001
Зараженная Е. coli 100,0* * 5,33±0,09 * 100,0 * 4,98±0Д5
Зараженная Е. coli и леченная препаратом «Полиаписоген» 21,1 1,39±0,31 17,13 1,03±0,05
х-Р<0,05
Из данных таблицы видно, что однократная подкожная инъекция испытуемого средства уже на 3-й сутки обеспечивала существенное снижение частоты высевов кишечной палочки и энтеробактера из проб тонкой и подвздошной кишок, а также достоверное снижение концентрации микробов на грамм ткани, предотвращая колонизацию тонкого отдела кишечника условно-патогенными грамотрицательными микробами.
Результаты параллельных серологических исследований проб органов и тканей на наличие специфического антигена (К 99) и энтеротоксина E.coli показали, что обсеменение тонкого кишечника периферической крови и внутренних органов сопровождалось антигенемией и эндотоксинемией. Применение препарата «Полиаписоген» в качестве средства ранней (превентивной) терапии сепсиса при эшерихиозном инфекционном процессе оказывало биоцидное
действие на возбудителя, снижая концентрацию клеток Е. coli, уровень антигенемии и энтеротоксинемии.
Нарастание обсеменения тонкой кишки микробами семейства Enterobacteriaceae при поражении организма эшерихиями приводит к повышению уровня бактериальных эндотоксинов и антигенов в системном кровотоке. Резидентные тканевые макрофаги и клетки Купфера являются основным барьером на пути бактериальных эндотоксинов и антигенов, поступающих в портальный кровоток из правого синуса. При этом в макрофагах активируется ядерной фактор транскрипции NФ-карра В, что приводит к усилению экспрессии генов и усилению биосинтеза воспалительных цитокинов (Yanagawa H., 1993). Следовательно, в первые сутки после заражения возбудителем эшерихиоза возникает повышенная нагрузка на макрофаги, которая трансформируется в усиление воспалительной активности макрофагов с возрастанием синтеза и продукции медиаторов воспаления, ключевыми из которых являются синергически действующие цитокины: интерлейкин-1 (ИЛ-1), туморнекротический фактор (ТНФ-а) и у-интерферон (ИНФ- у). Чрезмерное накопление медиаторов воспаления вызывает развитие септического шока, нарушение тканевой перфузии и наступление летальных исходов (Будагов Р.С. 2004).
С учетом изложенного нами были проведены биохимические исследования по изучению влияния испытуемого препарата на воспалительный цитокинез у зараженных возбудителем эшерихиоза белых мышей, результаты которых представлены в таблице 4.
4. Концентрация медиаторов воспаления в сыворотке крови и супернатантах лимфоцитов пораженных возбудителем эшерихиоза и леченных препаратом «Полиаписоген» белых мышей через 3 сут после
заражения и лечения
Показатель Контроль Зараженные E.coli Зараженные E.coli и леченные препаратом «Полиаписоген»
ИЛ-1 в сыворотке крови, нг/мл. 9,3±1,1 13,5±1,7 10,1±1,5
ТНФ-а в сыворотке крови, нг/мл 2,9±0,3 5,1 ±0,9х 3,0±0,7
ИФН-у в супернатанте лимфоцитов, ед/мл 17,7±2,1 25,5±1,9Х 18,1±2,3
Из данных таблицы видно, что однократное подкожное введение многокомпонентного композиционного препарата «Полиаписоген» зараженным возбудителем эшерихиоза белым мышам снижает уровень циркулирующих в крови провоспалительных гормонов (ИЛ-1, ТНФ- а и ИНФ- у) до контрольных значений. В основе противовоспалительного действия композиционного препарата «Полиаписоген» на макрофаги, по-видимому, лежит подавление активности фактора транскрипции (Мазишоп А. е1 а1., 2000). В итоге препарат уменьшает уровень экспрессии цитокиновых и информационных и-РНК, что обуславливает снижение концентрации противовосполительных цитокинов ИЛ-1, ТНФ- а и ИНФ- у.
Учитывая, что поражение животных эшерихиозной инфекцией сопровождалось антигенемией, энтеротоксинемией и бактериемией, обуславливая септический воспалительный процесс, при котором тканевым и циркулирующим макрофагам и микрофагам принадлежит ведущая роль в противоинфекционной защите, нами были проведены опыты по изучению влияния испытуемого препарата на показатели неспецифической резистентности организма.
Результаты проведенных исследований в этом направлении показали, что применение изучаемого лечебного средства препятствовало снижению факторов неспецифической резистентности - значения исследованных показателей недостоверно отличались от таковых биологического контроля, уступая не более, чем в 1,04 - 1,14 раза (Р>0,03).
Заключение. Однократное подкожное введение препарата «Полиаписоген» белым мышам как до (за 24 ч), так и после (через 24 ч) заражения оказывало модифицирующее действие на течение и исход эшерихиозной инфекции, обеспечивая выживаемость 75-80% летально зараженных животных. Механизм антиэшерихиозного биозащитного эффекта препарата реализовался путем регулирования воспалительного потенциала макрофагов с ингибированием синтеза провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ТНФ- а и ИНФ- у), снижения антигенной нагрузки на организм, детоксикации бактериальных эндотоксинов, снижения бактериальной обсеменности органов, блокирования транслокации Е. соН из кишечника во внутренние органы, усиления факторов специфической (восстановление уровня синтеза иммуноглобулинов,
иммунорегуляторного индекса - тъ/тб) и неспецифической (бактерицидной, лизоцимной активности сыворотки, функциональной активности макро- и микрофагов) резистентности организма, что приводит к повышению выживаемости зараженных возбудителем эшерихиоза животных.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Будагов, Р.С. Влияние средств микробного происхождения на содержание цитокинов в сыворотке крови и выживаемость мышей при комбинированных радиационных
поражениях / Р.С. Будагов, Л.П. Ульянова// Радиац. биол. Радиоэкол. -2004. -Т.41. - №41. - №1. - С.38-42. 2. Anderson, R.E. The made of action of thymic hormones and its relevance to T- cell differenation/ R.F. Anderson, J.C. Standefec// J. Immunol. - 1983. - V.I 17. - P.381-387. 3. Cantor, H. T-cell sets: the role of thies genetic programme in immunoregulation/ H. Cantor, R.K. Gershon// Immune Syst. - London. - 1988. - P.13-25. 4. Landsteiner, K. The specificity of serologic reactions. - Camfricide: Harvard Univ. press. -1946.-326 p. 5. Matsumori, A. Nifedrine inhibits activation of transcription factor NF-kappa B / A. Matsumori, Y. Nunokawa, S. Sasagava// Life Sci. -2000. - V.67. - P.2655-2661. 6. Yanagawa, H. Abnormal levels of proimflammatory cytokines in serum and monocyte cultures// Hematol. Oncol. - 1993. - №3. - P.143-154.
ИСПЫТАНИЕ ПРЕПАРАТА «ПОЛИАПИСОГЕН» ПРИ ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНОМ
ЭШЕРИХИОЗЕ
Гайзатуллин Р.Р.
Резюме
Описано развитие эшерихиозного инфекционного процесса в зараженном организме и его модификации под воздействием композиционного препарата «Полиаписоген».
THE TEST DRUG «POLIAPISOGEN» IN THE EXPERIMENTAL ESHERIHIOZE
Gaizatullin R.R.
Summary
Describet the development esherihiozing infection in the infected organism and its modifications under the influence of composition of the drug «Poliapisogen».
УДК 547.458.82:619:617.12:636.7
ВОЛОКНИСТАЯ ИОНООБМЕННАЯ ТКАНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ
ИНФИЦИРОВАННЫХ РАН
Галимзянов И.Г.
ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: собаки, инфицированные раны, ионообменная ткань, бриллиантовая зелень, лечение.
