CC BY
4
II научно-практическая конференция молодых ученых «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии»
Санкт-Петербург 18-19 ноября 2021 г.
инфекции кровеносного русла, вызванные грамо-трицательными бактериями. В 2019 и 2020 гг. удельный вес грамотрицательных бактерий в структуре инфекций кровеносного русла повысился и составил 75 и 74% соответственно. Среди грамотрицательных бактерий весомую долю составляли энтеробактерии с продукцией БЛРС. В нашем исследовании БЛРС выявлена у 24% культур, в том числе и у штаммов, выделенных из крови. Колонизация кишечника энтеро-бактериями с продукцией БЛРС рассматривается как предиктор развития бактериемий, вызванных тем же видом бактерий. Преобладающим путем проникновения микробов в кровь является эндогенное инфициро-
вание через кишечник. Этому способствует нарушение кишечной микробиоты и развитие мукозита желудочно-кишечного тракта.
Выводы. Бактериальные инфекции кровеносного русла, вызванные грамотрицательными бактериями, значительно отягощают течение заболевания у больных гемобластозами. Использование в клинической практике методов контроля инфекции (выявление штаммов с множественной резистентностью к антибиотикам и использование стратегии контроля антимикробной терапии) способствует улучшению результатов лечения онкогематологических больных.
Курочкин Д.В.г, Субботина Т.Н. %2, Хазиева А.С. 3, Васильев Е.В.3, Михалёв М.А.3
1ФГАОУ ВО Сибирский федеральный университет, Красноярск
2ФГБУ Федеральный Сибирский научно-клинический центр ФМБА России, Красноярск 3КГБУЗ Краевая клиническая больница, Красноярск
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СКРИНИНГОВЫХ МЕТОДОВ ПРИ АНАЛИЗЕ СОМАТИЧЕСКИХ
МУТАЦИЙ В ГЕНЕ CALR
Введение. Поскольку ассоциированные с онкологическими заболеваниями, в том числе с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями (Ph-МПН), соматические мутации очень разнообразны, встречаются с разной частотой и разным уровнем аллельной нагрузки, то на начальном этапе выполнения молекулярно-генетических диагностических процедур по выявлению и идентификации таких мутаций, желательно иметь возможность проведения в лаборатории скрининговых методов. Это особенно важно, когда проводится анализ редких и разнообразных мутаций, например, таких как мутации в гене CALR. В качестве скрининговых методов для выявления CALR мутаций могут быть использованы как гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ), так и анализ кривых плавления с высоким разрешением (HRM).
Цель. Показать возможность использования HRM и гетеродуплексного анализа в качестве скрининговых тестов для выявления CALR мутаций, а также определить чувствительность данных методов.
Материалы и методы. В ходе работы были проанализированы 10 CALR «+» образцов ДНК от пациентов с различными фенотипическими вариантами Ph-МПН. Гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в ПААГ проводили с использованием набора реагентов «ПЦР-комплект» (Синтол, Москва) на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США). ПЦР-продукты детектировали методом электрофореза в 8% ПААГ. ПЦР-HRM проводили с использованием набора реагентов Precision Melt Supermix (bio-Rad, США). ПЦР с дополнительным этапом плавления высокого разрешения проводилась на приборе «CFX96» (Bio-Rad, США). Анализ падения уровня флуоресценции с повышением температуры на этапе плавления проводился с использованием программы «Precision Melt Analysis» (Bio-Rad, США).
Для анализа порога определения доли мутантного аллеля осуществляли клонирование ДНК, выделенной из клинических образцов, в вектор pGem-Т по стандартной методике («Promega», США).
Результаты. В результате проведенного гетероду-плексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ мутации в области 9 экзона гена CALR были выявлены во всех 10 образцах. Стоит отметить, что фрагменты, соответствующие мутантным аллелям, визуализируются не во всех образцах, а именно на дорожке от образцов с небольшими вариантами делеций/вста-вок или их комбинаций, фрагмент, соответствующий мутантному продукту, не визуализируется. При этом, во всех пробах, имеющих мутации визуализируются дополнительные полосы, расположенные выше фрагмента дикого типа, соответствующие гетеродуплек-сам, образованным сочетанием фрагментов дикого и мутантного типов аллелей.
По результатам анализа порога определения доли мутантного аллеля для гетеродуплексно-го анализа было показано, что в случае мутации c.1154_1155insTTGTC полосы, соответствующие ге-теродуплексам четко визуализируются в образцах с уровнем аллельной нагрузки 6,25% и выше, в случае же мутации c.1092_1143del полосы четко визуализируются в образцах с уровнем аллельной нагрузки 3,13% и выше.
По результатам скрининга соматических мутаций в гене CALR методом HRM с использованием амплифи-катора «CFX96» и программы «Precision Melt Analysis» нормализованные кривые плавления 9 из 10 образцов пациентов четко показали отличия от таковых в группе дикого типа. Образец с мутацией c.1154_1155insTTGTC был ложно отнесен в кластер с диким типом. Вероятно, это обусловлено низким уровнем аллельной нагрузки мутации в ДНК у данного пациента (9%).
По результатам анализа порога определения доли мутантного аллеля для HRM-анализа было показано, что в случае мутаций c.1154_1155insTTGTC и c.1092_1143del порог определения составил от 12,5% присутствия мутантного аллеля в пробе.
Выводы. В настоящем исследовании показана возможность использования гетеродуплексного анализа и HRM, для выявления различных вариантов
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 4, 2021
мутаций в 9 экзоне гена CALR. Предлагаемые методы подходят для выявления любых вариантов мутаций (делеции/вставки или их комбинации) в гене CALR. Порог определения в случае анализа мутации c.1154_1155insTTGTC составляет от 6,5% присутствия
мутантного аллеля в пробе для гетеродуплексного анализа и от 12,5% для HRM-анализа, в случае анализа мутации c.1092_1143del - от 3,13% для гетеродуплекс-ного анализа и от 12,5% для HRM-анализа.
Маркелов В.В.1, Рогачева Ю.А. 1, Попова М.О. 1, Волкова А.Г. 1, Николаев И.Ю.1, Пинегина О.Н. 1, Игнатьева С.М.2, Т.С. Богомолова 2, Волков Н.П. 1, Бондаренко С.Н. 1,
Климко Н.Н.12, Кулагин А.Д.1
ФГБОУ ВО Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова Минздрава РФ, Санкт-Петербург
2ГБОУ ВПО Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова Минздрава РФ, Санкт-Петербург
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ИНВАЗИВНОГО АСПЕРГИЛЛЁЗА ПОСЛЕ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В РЕАЛЬНОЙ
КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ
Введение. Текущие европейские руководства по первичной противогрибковой профилактике у взрослых реципиентов аллогенной трансплантации гемопо-этических стволовых клеток (алло-ТГСК) предлагают рекомендации в зависимости от фазы посттрансплан-тацонного периода, где первичная противогрибковая профилактика требуется трём группам пациентов. Группа 1 - группа низкого риска развития плесневых (мицелиальных) инвазивных микозов (ИМ) в период «до приживления», группа 2 - группа высокого риска плесневых ИМ в период «до приживления», и группа 3 - группа высокого риска развития ИМ в период «после приживления». Ограничения этого руководства включают неполный список групп риска, научно-обоснованных препаратов и их форм введения.
Цель. Изучить реализуемость европейских рекомендаций по противогрибковой профилактике у большой когорты взрослых реципиентов алло-ТГСК и частоту прорывного инвазивного аспергиллёза (ИА).
Материалы и методы. Мы проанализировали 672 взрослых пациента, получивших алло-ТГСК с 2017 по 2020 гг. в CIC 725. Пациенты были разделены на 3 группы в соответствии с типом противогрибковой профилактикой в первые 100 дней посттрансплантационного периода: Группа 1 - первичная противогрибковая профилактика флуконазолом (низкий риск развития плесневых ИМ, n=434); 2-я группа - первичная противогрибковая профилактика препаратами активными в отношении плесневых возбудителей ИМ (высокий риск плесневых ИМ, включая случаи непрофилактического применения, n=212) и 3-я группа - вторичная противогрибковая профилактика у пациентов с пред-существующим ИА. В течение 1-летнего периода наблюдения было диагностировано 2 доказанных и 41 вероятный случая прорывного ИА в соответствии с критериями EORTC / MSG. Медиана времени наблюдения за всеми пациентами составила 12 (0-51) месяцев.
Результаты. Сравнительный анализ показал основные характеристики пациентов группы высокого риска, у которых применялись препараты в активные отношении плесневых возбудителей ИМ преимущественно в качестве первичной противогрибковой профилактики: отсутствие полной ремиссии основ-
ного заболевания (p=0,002), повторная алло-ТГСК (p<0,001), трансплантация от гаплоидентичного донора (p<0,001), реактивация ЦМВ (р<0,001), острая РТПХ 3-4 степени (p<0,001), тяжелая хроническая РТПХ (p=0,010) и режим кондиционирования со сниженной интенсивностью (p = 0,001). В группу низкого риска попали пациенты, которым выполнена алло-ТГСК от полностью совместимого родственного (p = 0,002) и неродственного доноров (p = 0,009), использование миелоаблативного режима кондиционирования (p <0,001). Годовая КЧ прорывного ИА после алло-ТГСК в группе низкого риска после первой и повторной алло-ТГСК составила 3,7% и 8,6% соответственно, в группе высокого риска - 10 % и 26%, у пациентов с ранее существовавшим ИА - 5% и 14%. Медиана времени развития ИА составила 66 (2-282) дней. Основным органом поражения были легкие 93%. Прорывной ИА был диагностирован с помощью культурального исследования бронхоальвеолярной (БАЛ) или синусовой жидкости в 44% случаев, этиология: Aspergillus niger - 8 (42%), Aspergillus fumigatus - 7 (36%), Aspergillus flavus
- 2 (11%), Aspergillus terreus - 1 (5%), Aspergillus spp.
- 1 (5%). Общая 12 недельная выживаемость у пациентов с прорывным ИА составила 73%. Многофакторный анализ показал, что значимыми факторами риска развития ИА после алло-ТГСК в группе 1 был диагноз Ph (-) МПН (p=0,025), а в группе 2 - диагноз НХЛ (p=0,007). У пациентов с ранее существовавшим ИА из-за небольшого количества случаев ИА (n = 2) анализ не проводился.
Выводы. Исследование КЧ прорывного ИА идентифицировало группу сверхвысокого риска - повторная алло-ТГСК. Наиболее частым этиологическим агентом прорывного ИА был Aspergillus niger. Диагноз Ph (-) МПН был связан с более высоким риском ИА в посттрансплантационном периоде у пациентов, получавших профилактику флуконазолом, а диагноз НХЛ
- у пациентов, получавших первичную профилактику препаратами активными в отношении мицелиальных возбудителей.
