CC BY
5
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 4, 2021
Материалы и методы. В исследование включено 79 пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей ПБ-Ш стадии по Покров-скому-Фонтейну, которые наблюдались в ФГБУ РосНИ-ИГТ ФМБА России в 2018-2020 гг. Больные разделены на 2 группы. В группу 1 (основную) включены 37 пациентов с атеросклеротическим поражением артерий нижних конечностей, получавшие антигипоксант «Конфумин» в объеме 100 мл в сочетании с комбинированной антитромботической терапией (Риварокса-бан 2,5 мг х 2 раза в день и Ацетилсалициловая кислота 100 мг х 1 раз в день). Пациенты получали инфузии раствора, состоящие из 0,9% хлорида натрия в объеме 200 мл с пентоксифиллином (10 мл), и 0,9% хлорида натрия 200 мл с актовегином (10 мл). Продолжительность курса лечения 10 дней. Группу 2 (контрольную) составили 42 пациента. Антитромботическая терапия и продолжительность курса лечения были такими же, как у пациентов группы 1. Пациентам, включенным в исследование, выполнялись общеклинические и инструментальные методы исследования, которые проводились двукратно в 1-е и на 12-е сутки госпитализации.
Результаты. Средний возраст пациентов основной группы составил 65,0±6,4 лет. Возраст пациентов группы контроля статистически не отличался и составил 66,6±5,9 лет. Гендерное распределение в двух группах статистически не различалось - в обеих группах преобладали мужчины. Сахарный диабет и артериальная гипертензия часто преобладали у пациентов обеих групп. При составлении клинико-анамнестической характеристики групп, было отмечено, что по большинству изучаемых признаков группы были сопоставимы.
При исследовании гематологических показателей
у пациентов основной и контрольной групп до начала и после лечения существенных различий не выявлено, все показатели были в пределах нормы.
При исследовании показателей системы гемостаза уровень фибриногена, а также активность фактора VIII и ристоцетин-кофакторная активность фактора Вил-лебранда были выше контрольных значений у пациентов контрольной группы по сравнению с пациентами основной группы. На фоне проведенного комплексного лечения, через 12 дней после госпитализации, прослеживалось снижение уровня маркеров дисфункции эндотелия (ристоцетин-кофакторная активность фактора Виллебранда), VIII фактора у первой группы на фоне введения раствора «Конфумин», в отличие от второй группы.
В результате исследования процесса генерации тромбина с помощью теста обнаружены достоверные различия в основной группе пациентов по сравнению с группой контроля после проведенного лечения. Наблюдали повышение временного показателя ТГТ - СГ у пациентов группы контроля (3,2±0,6 против 2,7±0,6 мин, р<0,01).
Выводы. Поиск новых метаболических воздействий при хронической критической ишемии нижних конечностей, с учетом тенденции развития комбинированных методов антитромботической терапии, является перспективным. Представляется важным, что Конфумин может с успехом применяться совместно с противотромботическими препаратами, используемыми при лечении ЗПАНК, не снижая их эффективность, одновременно потенцируя действие комбинации антикоагулянта и антиагреганта на эндотелий пораженных артерий.
Кулешова А.В.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства », Санкт-Петербург
ЭТИОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ИНФЕКЦИЙ КРОВОТОКА
У БОЛЬНЫХ ГЕМОБЛАСТОЗАМИ
Введение. В лечении гемобластозов достигнуты значительные успехи, связанные с использованием таргетной терапии и трансплантации гемопоэтиче-ских стволовых клеток. Однако их применение увеличило риск возникновения инфекционных осложнений, среди которых особую опасность представляют системные инфекции кровотока. Летальность при сепсисе, вызванном грамотрицательными бактериями, может достигать 57%.
Цель. Определить частоту и этиологическую структуру инфекций кровотока у больных гемобластозами в период с 2010 по 2021 гг. и совершенствование стратегии диагностики и контроля инфекционных осложнений у больных гемобластозами.
Материалы и методы. Исследовали частоту и этиологическую структуру инфекций кровотока у больных с различными онкогематологическими заболеваниями, находившихся на лечении в гематологической клинике института в период с 2010 по 2021 годы. Забор крови для проведения бактериологического ис-
следования выполняли до начала противомикробного лечения и затем регулярно при эпизодах лихорадки. Культивирование посевов крови осуществляли в автоматическом анализаторе BacT/ALERTR 3D (BioMerieux, Франция). Параллельно с фенотипической идентификацией проводили идентификацию положительных гемокультур с помощью метода мультиплексной ПЦР в реальном времени . В период с 2018 по 2020 гг., наряду с определением этиологии инфекционных осложнений проводили стратификацию бактериальных инфекций по степени тяжести в соответствии с консенсусом Sepsis 3. Определяли также бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) по выявлению генов бета лактамаз расширенного спектра (БЛРС) с помощью ПЦР в реальном времени.
Результаты. Исследование показало, что среди положительных посевов с 2010 по 2018 гг. грамположи-тельные микробы были выявлены в 69,2% гемокультур, грамотрицательные - в 30,8%. Установлено, что наибольшую опасность для больных представляют
II научно-практическая конференция молодых ученых «Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии»
Санкт-Петербург 18-19 ноября 2021 г.
инфекции кровеносного русла, вызванные грамо-трицательными бактериями. В 2019 и 2020 гг. удельный вес грамотрицательных бактерий в структуре инфекций кровеносного русла повысился и составил 75 и 74% соответственно. Среди грамотрицательных бактерий весомую долю составляли энтеробактерии с продукцией БЛРС. В нашем исследовании БЛРС выявлена у 24% культур, в том числе и у штаммов, выделенных из крови. Колонизация кишечника энтеро-бактериями с продукцией БЛРС рассматривается как предиктор развития бактериемий, вызванных тем же видом бактерий. Преобладающим путем проникновения микробов в кровь является эндогенное инфициро-
вание через кишечник. Этому способствует нарушение кишечной микробиоты и развитие мукозита желудочно-кишечного тракта.
Выводы. Бактериальные инфекции кровеносного русла, вызванные грамотрицательными бактериями, значительно отягощают течение заболевания у больных гемобластозами. Использование в клинической практике методов контроля инфекции (выявление штаммов с множественной резистентностью к антибиотикам и использование стратегии контроля антимикробной терапии) способствует улучшению результатов лечения онкогематологических больных.
Курочкин Д.В.г, Субботина Т.Н. %2, Хазиева А.С. 3, Васильев Е.В.3, Михалёв М.А.3
1ФГАОУ ВО Сибирский федеральный университет, Красноярск
2ФГБУ Федеральный Сибирский научно-клинический центр ФМБА России, Красноярск 3КГБУЗ Краевая клиническая больница, Красноярск
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СКРИНИНГОВЫХ МЕТОДОВ ПРИ АНАЛИЗЕ СОМАТИЧЕСКИХ
МУТАЦИЙ В ГЕНЕ CALR
Введение. Поскольку ассоциированные с онкологическими заболеваниями, в том числе с Ph-негативными миелопролиферативными новообразованиями (Ph-МПН), соматические мутации очень разнообразны, встречаются с разной частотой и разным уровнем аллельной нагрузки, то на начальном этапе выполнения молекулярно-генетических диагностических процедур по выявлению и идентификации таких мутаций, желательно иметь возможность проведения в лаборатории скрининговых методов. Это особенно важно, когда проводится анализ редких и разнообразных мутаций, например, таких как мутации в гене CALR. В качестве скрининговых методов для выявления CALR мутаций могут быть использованы как гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ), так и анализ кривых плавления с высоким разрешением (HRM).
Цель. Показать возможность использования HRM и гетеродуплексного анализа в качестве скрининговых тестов для выявления CALR мутаций, а также определить чувствительность данных методов.
Материалы и методы. В ходе работы были проанализированы 10 CALR «+» образцов ДНК от пациентов с различными фенотипическими вариантами Ph-МПН. Гетеродуплексный анализ с последующим электрофорезом в ПААГ проводили с использованием набора реагентов «ПЦР-комплект» (Синтол, Москва) на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США). ПЦР-продукты детектировали методом электрофореза в 8% ПААГ. ПЦР-HRM проводили с использованием набора реагентов Precision Melt Supermix (bio-Rad, США). ПЦР с дополнительным этапом плавления высокого разрешения проводилась на приборе «CFX96» (Bio-Rad, США). Анализ падения уровня флуоресценции с повышением температуры на этапе плавления проводился с использованием программы «Precision Melt Analysis» (Bio-Rad, США).
Для анализа порога определения доли мутантного аллеля осуществляли клонирование ДНК, выделенной из клинических образцов, в вектор pGem-Т по стандартной методике («Promega», США).
Результаты. В результате проведенного гетероду-плексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ мутации в области 9 экзона гена CALR были выявлены во всех 10 образцах. Стоит отметить, что фрагменты, соответствующие мутантным аллелям, визуализируются не во всех образцах, а именно на дорожке от образцов с небольшими вариантами делеций/вста-вок или их комбинаций, фрагмент, соответствующий мутантному продукту, не визуализируется. При этом, во всех пробах, имеющих мутации визуализируются дополнительные полосы, расположенные выше фрагмента дикого типа, соответствующие гетеродуплек-сам, образованным сочетанием фрагментов дикого и мутантного типов аллелей.
По результатам анализа порога определения доли мутантного аллеля для гетеродуплексно-го анализа было показано, что в случае мутации c.1154_1155insTTGTC полосы, соответствующие ге-теродуплексам четко визуализируются в образцах с уровнем аллельной нагрузки 6,25% и выше, в случае же мутации c.1092_1143del полосы четко визуализируются в образцах с уровнем аллельной нагрузки 3,13% и выше.
По результатам скрининга соматических мутаций в гене CALR методом HRM с использованием амплифи-катора «CFX96» и программы «Precision Melt Analysis» нормализованные кривые плавления 9 из 10 образцов пациентов четко показали отличия от таковых в группе дикого типа. Образец с мутацией c.1154_1155insTTGTC был ложно отнесен в кластер с диким типом. Вероятно, это обусловлено низким уровнем аллельной нагрузки мутации в ДНК у данного пациента (9%).
По результатам анализа порога определения доли мутантного аллеля для HRM-анализа было показано, что в случае мутаций c.1154_1155insTTGTC и c.1092_1143del порог определения составил от 12,5% присутствия мутантного аллеля в пробе.
Выводы. В настоящем исследовании показана возможность использования гетеродуплексного анализа и HRM, для выявления различных вариантов
