CC BY
9
VВсероссийская научно-практическая конференция с международным участием
«ГЕНЕТИКА ОПУХОЛЕЙ КРОВЕТВОРНОЙ СИСТЕМЫ - Санкт-Петербург ОТ ДИАГНОСТИКИ К ТЕРАПИИ»_26-27 апреля 2019 г.
Т. Н. Субботина12, А. А. Карнюшка1, E. A. Дунаева3, К. О. Миронов3, Е. В. Васильев4, М. А. Михалев5, М. Г. Смелянская4, А. С. Хазиева4, Т. A. Гаркуша6, В. А. Хоржевский6
1 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Сибирский федеральный университет», г. Красноярск
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный Сибирский научно-клинический центр Федерального медико-биологического агентства России», г. Красноярск
3 Федеральное Государственное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека,
г. Москва
4 Краевое государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Краевая клиническая больница», г. Красноярск
5 Краевое государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Красноярская межрайонная клиническая больница № 7», г. Красноярск
6 Краевое государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро», г. Красноярск
СКРИНИНГОВЫЙ АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В 9 ЭКЗОНЕ ГЕНА CALR С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ГЕТЕРОДУПЛЕКСНОГО АНАЛИЗА
Введение. На сегодняшний день идентифицировано и классифицировано более 50 различных мутаций в гене СЛЬЯ, ассоциированных с хроническими миелопролиферативными новообразованиями (ХМН). Все мутации делят на два типа, к первому типу относятся делеции, ко второму типу — инсерции. Мутации типа 1 чаще встречаются при миелофиброзе (МФ), тогда как при эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ) мутации типа 1 и типа 2 встречаются с одинаковой частотой. Случаи наличия CALR мутаций при истинной полицетемии (ИП) в литературе имеются, но остается неясным клиническое значение таких мутаций и их вклад в развитие патогенеза ИП.
Для выявления всех возможных вариантов CALR мутаций удобнее использовать методы секвенирования. Вместе с тем, высокая стоимость секвенирования определяет необходимость разработки двухэтапного алгоритма тестирования с предварительным использованием более доступного скринингового теста. Ранее мы предложили двухэтапный алгоритм для обнаружения мутаций в экзоне 12 |АК2 с использованием недорогого скринингового теста с помощью гетеродуплексного анализа.
Цель. Продемонстрировать возможность использования метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в по-лиакриламидном геле (ПААГ) для выявления мутаций в 9 экзоне гена СЛЬЯ в качестве предварительного скринингового теста.
Материалы и методы. В исследование было включено 6 образцов ДНК пациентов с различными фенотипическими формами ХМН и различным уровнем аллельной нагрузки мутациями в гене СЛЬЯ. Было получено письменное информированное согласие пациентов на прове-
дение научного исследования. Наличие мутаций в гене CALR в выбранных образцах ДНК было ранее определено методом секвенирования по Сэнгеру (АВ3500, США). Для определения уровня аллельной нагрузки образцы ДНК также были проанализированы методом пиросекве-нирования (PyroMark Q24, Германия). Для отработки скринингового теста проводили ПЦР с дополнительным этапом образования гетеро-дуплексов с использованием набора реагентов «ПЦР-комплект» (Синтол, Москва) на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США). ПЦР-продукты детектировали методом электрофореза в 8 % ПААГ.
Результаты. Диагнозы ЭТ и МФ для шести выбранных пациентов ранее подтверждены морфологическим исследованием трепано-биоптата костного мозга. Важно отметить, что у одного из шести пациентов был подтвержденный диагноз ИП, что является редким явлением. Все шесть пациентов имеют шесть различных indel вариантов мутаций в 9 экзоне CALR, в частности, пациент № 1 имеет мутацию с. 1154_1155insGTGTC; № 2 — с. 1128_1129insCTTTGCTT и c. 1131_1133delAGA; №3 — с. 1100_1151del (52); №4 — c.1154_1155insTTGTC; № 5 — с. 1092_1143del (51); №6 — c.1154_1155insTTGTC. Минимальное и максимальное количество нуклеотидов, отличающих мутантную последовательность 9 экзона CALR от дикого типа, при разных вариантах мутаций составило 5 и 52, соответственно. Уровень аллельной нагрузки варьировал в выбранных образцах ДНК от 25 % до 50 %.
При анализе полученных электрофореграмм на дорожках всех шести проб, имеющих мутации, чётко визуализируется основной фрагмент, соответствующий дикому типу — 265 п.о. Полосы, соответствующие мутантным аллелям
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XV, № 2, 2019
визуализируются лишь для пациентов № 3 и № 5, имеющих крупные делеции. На дорожках пациентов № 1, № 2, №4 и №6 таковые полосы отсутствуют, что, по-видимому, обусловлено типом мутации, то есть, во всех этих четырех вариантах мутантный аллель отличается от аллеля дикого типа инсерцией 5-ти нуклеоти-дов. Важно отметить, что во всех шести случаях также визуализируются дополнительные полосы выше фрагмента дикого типа, соответствующие гетеродуплексам, образованным сочетанием фрагментов дикого и мутантного типов аллелей. Таким образом, использование
метода гетеродуплексного анализа с последующим электрофорезом в ПААГ позволило выявить мутации в 9 экзоне гена CALR во всех выбранных образцах ДНК.
Выводы. Предлагаемый вариант гетеродуплексного анализа с детекцией в ПААГ может быть рекомендован к использованию как скри-нинговый тест, предшествующий секвенирова-нию. Двухэтапный подход позволяет оптимизировать алгоритм и повысить эффективность тестирования пациентов с подозрением на мутации в 9 экзоне гена CALR.
С. А. Таирова, О. В. Березина, В. С. Овчинников, Т. И. Поспелова
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Новосибирск Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Городская клиническая больница № 2, Новосибирск.
АНАЛИЗ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ВАРИАНТАХ ОСТРОГО МИЕЛОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА
Введение. Генетические аномалии играют основную роль в патогенезе острых лейкозов, а также определяют морфологические и иммунологические особенности опухолевых клеток.
Цель. Изучить структуру хромосомных аберраций (ХА) при различных морфологических вариантах острого миелобластного лейкоза (ОМЛ) у больных г. Новосибирска и Новосибирской области.
Материалы и методы. В лаборатории Городского гематологического центра г. Новосибирска за период с 2014 по 2018 гг. обследовано 111 пациентов города и области с впервые выявленным ОМЛ. Средний возраст больных составил 47 лет (от 16 до 78). Из них 48 мужчин (43,2 %), 63 женщины (56,8 %). Всем пациентам проведены стандартные цитогенетические исследования (СЦИ), изучены данные морфологического исследования и проточной цитометрии. У 104 больных (93,7 %) СЦИ были дополнены флюоресцентной гибридизацией in situ (FISH). Использовались следующие ДНК-пробы: Break Apart Probe — MLL(11q23.3), EVI1(3q26.2), E2A(19q13.3) (Cytocell), RARA(17q21), JAK2(9p24) (Kreatech), Translocation Probe — BCR/ABL t(9;22), AML1/ETO t(8;21), CBFB/ MYH11 t(16;16), PML/RARa t(15;17) (Cytocell), KMT2A/MLLT3 t(9;11), DEK/NUP214 t(6;9) (Kreatech), Deletion Probe — Del(5q), Del(7q),
P53 (Cytocell), Satellite Ennumeration Probe — Yq12, D8Z1 (Kreatech).
Результаты. Самую многочисленную группу составили ОМЛ с минимальными признаками миелоидной дифференцировки бластов — 24 человека (21,6 %). ХА выявлены у 9 человек (37,5 %): i(17q) в 2-х случаях, inv(16), +8, t(8;21) (q21; q22), add(9q),—7/del(7q), del(5q) у 2 пациентов в составе комплексного кариотипа, гипер-диплоидия, дополнительные локусы генов MLL, EVI1, BCR, ABL1, TAS2R1, EGR1 (выявлены только при FISH-исследовании). Больных с ОМЛ с миелоидной линейной направленностью без признаков созревания бластов — 17 человек (15,3 %). Из них аномалии выявлены у 10 пациентов (58,8%): inv(16),—17/del(17p) у 2 больных, t(8;21)(q21; q22), +11/11q по 2 случая,—7/del(7q), del(5q) по 4 случая, дополнительные локусы гена MLL, комплексный кариотип у 3 человек. У одного пациента делеция длинного плеча хромосомы 5 выявлена только при FISH-исследовании. В группе ОМЛ с созреванием 16 человек (14,4 %). Аберрации выявлены у 10 больных (62,5 %): +8 (4 случая, в одном из них выявлена только при FISH-исследовании), -X, inv(3)(q21q26), t(8;21) (q21; q22) у двоих пациентов, del(2q), del(9) (q22), +22,—7, del(7q), комплексный кариотип у 2 человек. С промиелоцитарным вариантом ОМЛ обследовано 15 больных (13,5 %). При СЦИ t(15;17)(q24; q21) обнаружена у 13 пациентов,
