Мутационный профиль острых миелоидных лейкозов у больных пожилого и старческого возрастов Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

DOI: 10.23868/201912027

мутационный профиль острых миЕлоидных лейкозов у Больных пожилого и старческого возрастов

А.В. Виноградов1, 2, А.В. Резайкин1, С.В. Сазонов1, 3, А.Г. Сергеев1, М.Ю. Капитонова4

1 Уральский государственный медицинский университет, Екатеринбург, Россия

2 Свердловская областная клиническая больница № 1, Екатеринбург, Россия

3 Институт медицинских клеточных технологий, Екатеринбург, Россия

4 Университет Малайзии Саравак (ЮНИМАС), Малайзия

mutation LANscApE of acute MYELoiD LEuKEMiA IN ELDERLY pATiENTs

A.V. Vinogradov1, 2, A.V. Rezaykin1, S.V. Sazonov1, 3, A.G. Sergeev1, М-Y. Kapitonova4

1 Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russia

2 Sverdlovsk Regional Clinical Hospital N 1, Ekaterinburg, Russia

3 Institute of Medical Cell Technologies, Ekaterinburg, Russia

4 University Malaysia Sarawak (UNIMAS), Malaysia

e-mail: a.vinogradov@egov66.ru

Молекулярно-генетический профиль острых миелоидных лейкозов (ОМЛ) в возрастной группе пациентов старше 60 лет имеет особенности, обусловленные старением кроветворных клеток-предшественниц.

Цель исследования — определить частоту мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 и WT1 у больных острыми миелоидными лейкозами в возрастной группе старше 60 лет.

Анализировали пробы костного мозга и периферической крови 54 больных ОМЛ (возраст 60 лет и старше), которые были распределены по группам в соответствии с морфологическим вариантом ОМЛ: МО — 2 пациента, М1 — 6, М2 — 27, М3 — 2, М4 — 11, М5 — 1, М6 — 3, острый миелофиброз — 1, бластная плаз-мацитоидная дендритоклеточная опухоль — 1. Детекцию мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 и WT1 проводили методом прямого автоматического секвенирования.

В обследованной группе преобладали больные ОМЛ из подгрупп неблагоприятного (33,3%, n=18) и неуточ-ненного (42,6%, n=23) цитогенетического прогнозов. Дополнительный анализ биоматериала пациентов с использованием технологии прямого автоматического сек-венирования позволил в 38,9% (n=21) случаев обнаружить скрытые патогенетически значимые мутации, в том числе у 3 больных (27,3%) — в подгруппе промежуточного, у 11 (61,1%) — неблагоприятного и у 7 (30,4%) — неуточненно-го цитогенетического прогнозов. С наибольшей частотой выявлялись мутации в генах ТР53 (20,0%) и FLT3 (18,4%), частота прогностически значимых мутаций остальных исследованных генов не превышала 10,0%: NRAS — 7,7% (n=2), KIT — 5,9% (n=2), NPM1 — 5,4% (n=2), DNMT3A — 9,1% (n=1). Молекулярные изменения в кодирующей последовательности гена WT1 в биообразцах (n=26) не определялись, в т. ч. в 8 пробах пациентов ОМЛ с хромосомными аберрациями, ассоциированными с неблагоприятным прогнозом. Множественные (две и более) функционально значимые мутации были обнаружены в 11,1% проб (n=6). При этом наиболее часто в кооперации участвовали мутации гена FLT3, в том числе FLT3 ITD — в 4 случаях.

Выявление критических генных мутаций методом прямого автоматического секвенирования в 35,9% случаев (n=10) позволило уточнить прогностическую стратификацию ОМЛ из групп неуточненного и промежуточного прогнозов. Во всех указанных наблюдениях определялись генные мутации, ассоциированные с неблагоприятным прогнозом. В целом, по результатам цитогенетического и дополнительного молекулярно-генетического исследований, благоприятный прогноз общей вероятностной выживаемости был установлен в 2 наблюдениях (3,7%), промежуточный — в 9 (16,7%), неблагоприятный — в 27 (50,0%), неуточненный — в 16 (29,6%).

ключевые слова: мутация, острый миелоидный лейкоз, пожилой и старческий возраст, ген DNMT3A, ген FLT3, ген KIT, ген NPM1, ген NRAS, ген TP53, ген WT1, прямое секвенирование.

The molecular genetic landscape of acute myeloid leukemia (AML) have specific features in elderly patients, and these features correlates with hematopoietic progenitor cells senescence.

Aim: to estimate the frequency of mutations in DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 and WT1 genes in AML patients in elderly.

Bone marrow and peripheral blood samples obtained from 54 AML patients aged over 60 years old. Distribution of the patients according to FAB-classification was as follows: AML M0 — 2, M1 — 6, M2 — 27, M3 — 2, M4 — 11, M5 — 1, M6 — 3, acute myelofibrosis — 1, blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm — 1. Detection of mutations in DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 and WT1 genes performed by automatic direct sequencing technique.

In the study group were more common patients with unfavorable (33.3%, n=18) and unspecified (42.6%, n=23) cytogenetics. The average frequency of functionally significant mutations in all investigated genes among the treated AML patients was 38.9% (n=21), including 3 cases (27.3%) with normal karyotype, 11 cases (61.1%) with unfavorable cytogenetics, 7 cases (30.4%) with unspecified karyotype. Average frequency of mutations in TP53 gene exons 4-11 was 20.0%, FLT3 gene exons 12-15 and 19-21 18.4%, DNMT3A exons 18-26 — 9.1%, NRAS gene exons 1-4 — 7.7%, KIT gene exons 7-12 and 16-19 — 5.9%, NPM1 gene exons 9-12 — 5.4% (n=2), DNMT3A — 9.1% (n=1). Multiple point mutations in investigated genes were detected in 11.1% AML specimens (n=6, usually FLT3 gene mutations, including FLT3 ITD in 4 cases). Additional gene mutations detection using direct sequencing allowed to clarify the prognostic stratification of AML from groups of unspecified and intermediate prognosis in 35.9% (n=10). In all cases, they were associated with an unfavorable prognosis. Thus, using of cytogenetic and additional molecular genetic research, a favorable prognosis of overall survival was established in 2 cases (3.7%), intermediate — in 9 cases (16.7%), unfavorable — in 27 cases (50.0%), and unspecified — in 16 (29.6%).

Keywords: acute myeloid leukemia, elderly, DNMT3A gene, FLT3 gene, KIT gene, NPM1 gene, NRAS gene, TP53 gene, WT1 gene, sequencing.

Введение

Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) — это злокачественные новообразования крови, заболеваемость которыми увеличивается с возрастом, достигая максимума в группах больных пожилого и старческого возраста. Они развиваются вследствие соматических мутаций в ключевых прото- и антионкогенах кроветворных клеток-предшественниц, характеризуются сложной клональной архитектурой и динамическими изменениями молекулярно-генетического профиля в процессе онкогенеза [1]. Так, мутации генов NPM1, FLT3, NRAS возникают на поздних стадиях онкогенеза и связаны с клинической манифестацией лейкоза. Напротив, мутации в генах DNMT3A, ASXL1, TET2 появляются, как правило, на ранних стадиях злокачественной трансформации и могут длительно персистировать в фазе ремиссии, обусловливая риск развития рецидивов. При этом некоторые мутации могут определяться в лейкоцитах периферической крови здоровых доноров задолго до манифестации заболевания, и их частота также коррелирует с возрастом. Указанный феномен характеризуется как «клональный гемопоэз с неопределенным потенциалом» и ассоциирован с повышенным риском развития лейкозов с частотой 0,5-1,0% в год [1-3].

Цель исследования — определить частоту мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 и WT1 у больных ОМЛ в возрастной группе 60 лет и старше.

Материал и методы

Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 54 больных ОМЛ в возрасте 60 лет и старше после получения информированного согласия, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематоло-гическом центре в период 2009-2018 гг. Среди пациентов было 26 мужчин (48,1%) и 28 женщин (51,9%). Средний возраст больных составлял 67,7±1,8 лет.

Диагностику ОМЛ проводили в соответствии с рекомендациями вОз [4, 5]на основании клинической картины, цитологического анализа крови и костного мозга, цитохимического и иммунофенотипического исследований. По показаниям выполняли трепанобиопсию подвздошной кости с последующим гистологическим и иммуногистохи-мическим анализом [6]. Морфологический вариант ОМЛ определяли согласно франко-американо-британской (FAB) классификации [7], в соответствии с которой пациенты были распределены по подгруппам: М0 — 2 пациента, М1 — 6, М2 — 27, М3 — 2, М4 — 11, М5 — 1, М6 — 3, острый миелофиброз — 1, бластная плазмацитоидная дендритоклеточная опухоль — 1.

Всем пациентам было выполнено цитогенетическое и(или) молекулярно-генетическое исследование аспирата костного мозга: полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени на транслокации t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11), t(9;22)(q34;q11), инверсию inv(16)(p13;q22), аномалии сегмента 11q23. В 23 пробах костного мозга пациентов с ОМЛ уточнить вариант генетической поломки с применением цитоге-нетического и ПЦР-методов не удалось. Они, соответственно, были классифицированы как ОМЛ с неуточнен-ным кариотипом [8].

Детекцию криптических генных мутаций осуществляли с помощью технологии прямого автоматического секвенирования. Всего на наличие мутаций в кодирующих последовательностях экзонов 12-15 и 19-21 гена FLT3 в изучаемой выборке были протестированы 49 проб периферической крови и костного мозга, экзонов 4-11 гена ТР53 — 45, экзонов

9-12 гена МРМ1 - 37, экзонов 7-12 и 16-19 гена К1Т - 34, экзонов 1-4 гена МНДБ - 26, экзонов 6-9 гена - 26, экзонов 18-26 гена ОММТЭД -11. Праймеры, использованные для детекции мутаций в указанных генах, а также лабораторные протоколы исследований, описаны нами ранее [9, 10].

Проверку статистических гипотез проводили с применением точного критерия Фишера (П. Доверительные интервалы (ДИ) для средних частот мутаций генов определяли на основе биномиального распределения.

Результаты

Наиболее частым типом хромосомных аберраций в обследованной группе больных являлись комплексные хромосомные аберрации (22,2%, п=12, при 95% ДИ от 13,2 до 34,9%). В 20,4% случаев (п=11, при 95% ДИ от 11,8 до 32,9%) определялся нормальный кариотип лейкемических бластов. Специфические структурные аберрации хромосом, ассоциированные с благоприятным прогнозом, были выявлены в 2 пробах (3,7%, при 95% ДИ от 1,0 до 12,5%), в том числе транслокация №21 )^22^22) и транслокация ^15:17)^22^11) - по одному случаю (1,9%, при 95% ДИ от 0,3 до 9,9%). Изолированные специфические хромосомные аберрации, ассоциированные с неблагоприятным прогнозом, в исследуемой выборке не определялись. Неслучайная хромосомная аномалия трисомия хромосомы 8 была обнаружена в 4 образцах (7,4%, при 95% ДИ от 2,9 до 17,5%) при ОМЛ М2, М4 и бластной плазмацитоидной дендритоклеточной опухоли, случайные изохромосомы К7) и К7)(р10) - по одному случаю (1,9%, при 95% ДИ от 0,3 до 9,9%) при ОМЛ М2.

Патогенетически значимые для ОМЛ мутации в экзонах 4-11 гена ТР53 являлись наиболее частыми клинически значимыми криптическими генными мутациями, выявленными в исследуемой группе больных ОМЛ, они определялись в 9 биообразцах (20,0%, при 95% ДИ от 10,9 до 33,8%) при ОМЛ М2, М4, М6. В 7 биообразцах указанные аномалии были ассоциированы с комплексными хромосомными аберрациями (при ОМЛ М2, М4, М6), по одному случаю (при ОМЛ М2) - с нормальным и неуточненным кариотипом лейкемических клеток. В 7 пробах (15,6%, при 95% ДИ от 7,8 до 28,8%) были выявлены нуклеотидные замены (при ОМЛ М2, М4, М6), по одному случаю (2,2%, при 95% ДИ от 0,4 до 11,5%) - делеция и тандемная дупликация гена ТР53 (при ОМЛ М2). У одного пациента при ОМЛ М2 с кариотипом 45, ХУ, Се!(2ВД, 1зо(9ВД, г(12), с1е1(17) ВД, ас1(С(19)(р), -15 одновременно были обнаружены две транзиции в кодирующей последовательности гена ТР53 - с.292С>Т и с.817С>Т. Первая из них обусловливала замену р.98Р>Б в пролиновом домене белка р53, вторая - р.273П>С в ДНК-связывающем домене. Во всех остальных случаях определялись изолированные мутации, обусловливавшие инактивацию белка р53. Они были представлены тремя транзициями (с. 377А>Э, с. 659А>Э, с. 817С>Т), тремя трансверсиями (с. 395А>С, с. 733Э>Т, с. 84Ю>Т), фреймшифт-мутацией (с. 645СеЮ) и тандемной дупликацией 1 9 нуклеотидов, начиная с позиции 960 от начала кодирующей последовательности гена ТР53. Подробная характеристика мутаций в гене ТР53 у больных ОМЛ представлена в табл. 1.

Генетические изменения в экзонах 12-15 и 19-21 гена ПТ3, значимые для онкогенеза ОМЛ, были выявлены в 9 пробах (18,4%, при 95% ДИ от 1 0,0 до 31 ,4%) при морфологических вариантах М1, М2, М4 и М5. Среди них в 1 образце была обнаружена трансверсия с. 2479 А>Т (2,0%,

Таблица 1. Характеристика патогенетически значимых мутаций в гене ТР53, выявленных у больных ОМЛ пожилого и старческого возраста

Вариант по FAB

Кариотип

Мутация

Локализация мутации в гене

Локализация и тип мутации в белке

М2

46, ХХ

М2 >50, XXX (околотриплоидия)

М2 47, XY, del(3)(p12), del(5)(q31), add(17)(p13), -7, +21, +mar

М2 42, X, add(1)(q31), add(12)(q24), del(15)(p12), add(16)(p13), del(18)(?12), -3, -9, -13, -X

М2 Неуточненный (низкая митотическая активность)

М2 45, XY, del(2)(q), iso(9)(q), r(12), del(17)(q), add(19)(p), -15

М4 52, XYY, inv(3)(p12;q24), +1, +9, +11, +13, +19, +Y, +mar

М6 46, XX, del(5q)(3.2), add(18p)(1.1.3) or t(5;18) (q2.3;p1.1)/46, XX, del(17p)(1.2), add(18p) (1.1.3) or t(17;18)(p1.2;p1.1)/47, XX, del(5q) (3.2), add(18p)(1.1.3) or t(5;18)(q2.3;p1.1), +mar/46, XX

М6* 40-45, XY, del(4)(p14), -5, dup(7)(q11;q22), del(11)(q21), del(17)(p12),-19, +Ph, +mar1-4 [7]/ 41-45, XY, del(4)(p14), -5, del(6) (q23), dup(7)(q11;q22), del(11)(q21), +Ph, +mar1-3 [6]/ 40-45, XY, del(4)(p14),-5, dup(7) (q11;q22), del(11)(q21), inv(17)(q21;q25), -19, +Ph, +mar1-4 [5]/ 44, XY, del(4)(p14), -5, dup(7)(q11;q21), -19, +Ph [2]

c. 377 A>G

c. 395А>С

c. 645delG c. 841 G>T

TD

c. 292 C>T, c. 817 C>T

c. 733 G>T

c. 659А>G

c. 817 ^T

Экзон 5

Экзон 5

Экзон 6 Экзон 8

Экзон 9

Экзоны 4 и 8

Экзон 7 Экзон 6

Экзон 8

ДНК-связывающий

домен,

р.126 У>С

ДНК-связывающий

домен,

р.132 К>Т

ДНК-связывающий домен, фреймшифт

ДНК-связывающий

домен,

р.281 0>У

С-концевой/1\11_8 (сигнал ядерной локализации), фреймшифт

Пролиновый домен, р. 98 Р>Б, ДНК-связывающий домен, р. 273 Я>С

ДНК-связывающий

домен,

р.245 Э>С

ДНК-связывающий

домен,

р.220 У>С

ДНК-связывающий

домен,

p. 273 R>C

Примечание: *при ПЦР-исследовании транскрипт химерного BCR-ABL в пробе не выявлен

Таблица 2. Результаты исследования проб больных ОМЛ пожилого и старческого возраста с несколькими мутациями

Подтип

Характеристика выявленных мутаций в генах

по FAB DNMT3A FLT3 KIT NPM1 TP53 Кариотип

М1 WT ITD с. 1621А>С, с. 2586G>C Инсерция типа А WT Неуточненный

М4 с. 2645 G>A ITD WT WT WT Неуточненный

М5 WT ITD n. Del 1529-1774 WT WT Неуточненный

М2 NA ITD WT Инсерция типа Ural-2 WT Нормальный

М2 WT с. 1683 A>G с. 1621А>С, с. 2586G>C WT TD Неуточненный

М2 WT WT WT NA с. 292 c>T, с. 817 C>T 45, XY, del(2) (q), iso(9)(q), r(12), del(17)(q), add(19)(p),-15

Примечание: функционально значимые мутации (в т. ч. гена KIT с. 1621А>С) выделены полужирным шрифтом, случаи выявления полиморфного аллеля гена ТР53 c. 215 C>G в таблицу не включены; WT — дикий тип (изменений кодирующей последовательности в сравнении с референсной не обнаружено), ITD — внутренняя тандемная дупликация, TD — тандемная дупликация, NA — исследование не проводилось

таблица 3. Частота выявления патогенетически значимых генных мутаций при ОМЛ

Частота мутаций в исследованных генах, %

Исследуемая группа -

DNMT3A FLT3 KIT NPM1 NRAS TP53 WT1

ОМЛ, возраст 15-45 лет [16] 7,1 21,9 10,0 10,7 13,0 0,0 11,1

ОМЛ, возраст 60 лет и старше 9,1 18,4 5,9 5,4 7,7 20,0 0,0

ОМЛ, возраст 65 лет и старше [17] 27,0 12,0 - 16,0 12,0 21,0 -

Примечание: «-» — исследование не проводилось

при 95% ДИ от 0,4 до 10,6%), в 8 (16,3% при 95% ДИ от 8,5 до 29,0%) — внутренние тандемные дупли-кациии (ITD) и инсерции, различающиеся по длине и локализации в кодирующих последовательностях юкстамембранного и киназного доменов. Во всех случаях выявленные ITD обусловливали чувствительность опухолевых клеток к ингибиторам тирозинкиназ I типа [11-13].

Кооперация FLT3 ITD с мутациями в других исследованных генах зафиксирована у 4 пациентов (44,4%, при 95% ДИ от 18,9 до 73,3%, табл. 2).

Частота детекции точечных мутаций в кодирующей последовательности экзонов 18-26 гена DNMT3A в исследуемой выборке составила 9,1 % (при 95% ДИ от 1,6 до 37,8%). Выявленная мутация была представлена транзицией с. 2645 G>A, обусловливавшей замену остатка аргинина на гистидин в позиции 882 кодируемого белка, и определялась при ОМЛ М4 с неуточненным кариотипом и FLT3 ITD (табл. 2).

Мутации в гене NRAS были найдены у 2 пациентов (7,7%, при 95% ДИ от 2,1 до 24,2%) при ОМЛ М2 и представлены, соответственно, функционально значимыми заменами с. 35 G>A и с. 181 С>А. Случаев их кооперации с другими молекулярными повреждениями зафиксировано не было.

Инсерции в экзоне 12 гена NPM1 были обнаружены у 2 пациентов при ОМЛ М1 и М2 (5,4%, при 95% ДИ от 1 ,5 до 1 7,7%) и соответственно, представлены мутациями типа А и Ural-2 [6]. Наряду с ними в пробах выявлялись дополнительные мутации—FLT3 ITD и трансверсия с. 1621 А>С в гене KIT (табл. 2). Проведенные статистические расчеты показали, что мутации генов NPM1 и FLT3 являлись неслучайными генетическими событиями, кооперация которых в онкогенезе ОМЛ обусловливала ухудшение прогноза общей выживаемости NPM1 -позитивных пациентов [6].

Структурные изменения в кодирующей последовательности гена KIT определялись в 12 пробах (35,2%, при 95% ДИ от 20,0 до 52,7%). Среди них в 8 случаях выявлялись изолированные синонимичные замены (23,5%, при 95% ДИ от 21,5 до 52,1%, с. 2586 G>C, с. 1638 A>G, с. 2394 С>Т), в 2 случаях (5,9%, при 95% ДИ от 1,6 до 19,1%) — несинонимичная замена с. 1621 А>С в сочетании с трансверсией с. 2586 G>C, по 1 случаю (2,9%, при 95% ДИ от 0,5 до 14,9%) — делеция (n. Del 1529-1774) в сочетании с трансверсией с. 2586 G>C и замена с. 1621 А>С в сочетании с транзициями с. 1636 A>G и с. 1821 Т>С. При ОМЛ М5, наряду с мутациями в гене KIT, определялась также мутация fLt3 iTd (табл. 2). В 2 образцах с трансверсиями с. 1621 A^ и с. 2586 G>C были обнаружены также клинически значимые изменения других прото- и антионкогенов: при ОМЛ М1, — инсерция типа А в гене NPM1 и мутация FLT3 ITD, а при ОМЛ М2 — тандемная дупликация в гене TP53 (табл. 2). По литературным данным трансверсия с. 1621 A^ является полиморфным

аллельным вариантом гена KIT, не имеющим самостоятельного прогностического значения при ОМЛ [14, 15], что подтверждается полученными нами результатами о случайном характере ее сочетания с другими функционально значимыми генетическими аномалиями при ОМЛ [16]. Делеция n. Del 1529-1774 в кодирующей последовательности экзонов 1 0 и 1 1 гена KIT, приводящая к утрате 82 остатков аминокислот в белке Kit, была описана нами ранее при ОМЛ М2 с транслокацией t(8;21)(q22;q22) и ОМЛ М4 с инсерцией типа А в экзоне 12 гена NPM1 [16]. По данным, опубликованным в работе [15], мутации в экзоне 1 1 гена KIT являются патогенетически значимыми, т. к. затрагивают участок рецептора, обеспечивающий ингибирование его аутофосфорилирования. Следовательно, в подобных случаях должен прорабатываться вопрос о назначении таргетного лечения ингибиторами тирозинкиназ I типа в рамках клинических исследований.

Структурные изменения в кодирующей последовательности гена WT1 в исследованных пробах (n=26) не определялись, однако в 3 образцах (11,5%, при 95% ДИ от 4,0 до 28,9%) при ОМЛ М2, М3 и М5 было найдено преобладание экспрессии транскрипционного варианта типа D, тогда как в остальных случаях транскрипты типа A и D выявлялись в эквивалентном количестве.

обсуждение

Функционально значимые мутации в кодирующих последовательностях экзонов 18-26 гена DNMT3A, 12-15 и 19-21 гена FLT3, 7-12 и 16-19 гена KIT, 1-4 гена NRAS, 9-12 гена NPM1 и 4-11 гена ТР53 были обнаружены с использованием технологии прямого автоматического секвенирования в 21 исследованной пробе от больных ОМЛ в возрасте 60 лет и старше (38,9%, при 95% ДИ от 27,0 до 52,2%), что коррелировало с ранее полученными результатами (табл. 3).

В целом оказалось, что с максимальной частотой при ОМЛ в возрастной группе пациентов 60 лет и старше определялись функционально значимые мутации в гене ТР53 (20,0%), что было существенно выше, чем у больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет (табл. 3) и сопоставимо с результатами исследования H. Dohner с соавт. (2018) [17]. Частота генетических изменений в гене FLT3 была сопоставима с таковой в ранее обследованной группе больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет [16], однако не превышала 20,0%. Имевшие патогенетическое значение при ОМЛ мутации в гене KIT выявлялись в группе больных ОМЛ старше 60 лет с частотой 5,9% (n=2, при 95% ДИ от 1,6 до 19,1%). Мутации в генах DNMT3A, NRAS и NPM1 обнаруживались с более низкой частотой (9,1 %, 7,7% и 5,4%, соответственно) по сравнению с результатами работы H. Dohner с соавт. (2018) [17]. Для мутаций гена DNMT3A и инсерций экзона 12 гена NPM1 это частично можно объяснить цитогенетическим профилем выборки (диплоидия определялась лишь в 20,4% наблюдений).

По две и более функционально значимые мутации в исследованных генах были обнаружены у 6 больных ОМЛ в возрасте 60 лет и старше (11,1% при 95% ДИ от 5,2 до 22,2%, табл. 2). У 3 больных при ОМЛ М1, М2, М4 и М5 была выявлена кооперация мутации FLT3 ITD с мутациями в генах KIT и NPM1 (по 2 случая), а также DNMT3A (1 случай, табл. 2). У одного больного при ОМЛ М2 с мутацией TD в гене TP53 ко-мутацией являлась трансверсия с. 1621А>С в гене KIT. У другого пациента при ОМЛ М2, были обнаружены одновременно две мутации в гене ТР53. Таким образом, только в пяти пробах (9,3%, при 95% ДИ от 4,1 до 20,0%) определялось по два патогенетически значимых при ОМЛ молекулярных события.

Определенный интерес в исследованной выборке вызывают результаты детекции генетических аномалий в пробах от пациентов с редкими гематологическими заболеваниями, относящимися к ОМЛ — острым миелофиброзом, острым промиелоцитарным лейкозом (ОПЛ) и бластной плазмоцитоидной дендритоклеточ-ной опухолью, т. к. сведения об их молекулярно-гене-тических особенностях у лиц пожилого и старческого возраста ограничены [1, 5, 17]. Так, в двух пробах от пациентов с ОПЛ (мужчины, возраст 60 и 62 года) мутаций в исследованных прото- и антионкогенах выявлено не было: у одного пациента цитогенетически определялась транслокация t(15;17)(q22;q21), а у другого — методами цитогенетики и ПЦР хромосомные поломки не обнаружились. Оба случая характеризовались ранней летальностью на фоне проведения индукционной полихимиотерапии, включающей полностью транс-ретиноевую кислоту. При остром миелофиброзе (женщина, 67 лет) также не удалось выявить значимых мутаций в генах FLT3, NPM1, KIT, TP53 и хромосомных аберраций цитогенетическим и ПЦР-методами. Также не были обнаружены значимые изменения в исследованных генах у больного бластной плазмоцитоидной дендритоклеточной опухолью (мужчина, 61 год), хотя в данном случае был определен аберрантный карио-тип лейкозных бластов (трисомия хромосомы 8). Для последних двух пациентов была характерна первичная резистентность опухолей к проводимому химиотера-певтическому лечению. Это свидетельствует о возможном участии в онкогенезе указанных разновидностей миелоидных лейкозов иных молекулярных событий, для детекции которых необходимо использовать технологии массового параллельного секвенирования.

В целом, в обследованной группе преобладали пациенты с неблагоприятным и неуточненным цито-генетическим прогнозом. Однако дополнительный

ЛИТЕРАТУРА:

1. Bullinger L., Döhner K., Döhner H. Genomics of Acute Myeloid Leukemia Diagnosis and Pathways. J. Clin. Oncol. 2017; 35(9): 934-46.

2. Desai P., Mencia-Trinchant N., Savenkov O. et al. Somatic mutations precede acute myeloid leukemia years before diagnosis. Nat. Med. 2018; 24(7): 1015-23.

3. Zink F., Stacey S.N., Norddahl G.L. et al. Clonal hematopoiesis, with and without candidate driver mutations, is common in the elderly. Blood 2017; 130: 742-52.

4. Vardiman J.V., Thiele J., Arber D.A. et al. The 2008 revision of the WHO classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood 2009; 114: 937-52.

5. Arber D.A., Orazi A., Hasserjian R. et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016; 127: 2391-405.

6. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Салахов Д.Р. и др. Сравнительный анализ результатов типирования молекулярных повреждений гена NPM1 при острых миелоидных лейкозах с использованием прямого автоматического секвенирования и иммуногистохимического метода. Вестник Уральской медицинской академической науки 2013; 4: 124-7. (Vinogradov A.V., Rezaykin A.V., Salakhov D.R. et al. Сomparative

анализ биоматериала пациентов с применением технологии прямого автоматического секвенирования позволил в 38,9% случаев выявить скрытые патогенетически значимые мутации исследованных генов, в т. ч. в 3 случаях (27,3%) — в подгруппе промежуточного, в 7 (30,4%) — неуточненного и в 11 (61,1%) — неблагоприятного прогнозов. При этом прогностическая стратификация ОМЛ ухудшалась у 9 пациентов (26,5%, при 95% ДИ от 14,6 до 43,2%) в группах промежуточного и неуточненного цитогенетического прогнозов. У остальных пациентов она не менялась, т. к. выявленные хромосомные аберрации были ассоциированы с неблагоприятным прогнозом.

Таким образом, по результатам цитогенетического и дополнительного молекулярно-генетического исследований благоприятный прогноз общей вероятностной выживаемости был установлен у 2 пациентов (3,7%, при 95% ДИ от 1,0 до 12,5%), промежуточный — у 9 (16,7%, при 95% ДИ от 9,1 до 28,8%), неблагоприятный — у 27 (50,0%, при 95% ДИ от 37,1 до 62,9%), неуточнен-ный — у 16 (29,6%, при 95% ДИ от 16,5 до 50,0%). Полученные данные необходимо учитывать для планирования и разработки персонализированных программ лечения больных ОМЛ пожилого и старческого возраста и включить технологии секвенирования в алгоритмы диагностики ОМЛ, предусмотренные национальными клиническими рекомендациями.

выводы

1. Кумулятивная частота детекции патогенетически значимых мутаций в генах DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS и ТР53 у больных ОМЛ пожилого и старческого возраста составляла 38,9%.

2. С максимальной частотой у больных ОМЛ в возрасте 60 лет и старше определялись мутации в генах ТР53 (20,0%) и FLT3 (18,4%), частота клинически значимых мутаций остальных исследованных генов варьировала в диапазоне 5,4-9,1%, а мутации в гене WT1 не определялись.

3. Частота обнаружения множественных генных мутаций у больных ОМЛ в возрасте 60 лет и старше составляла 11,1%, наиболее часто в кооперации участвовали мутации гена FLT3.

4. Применение метода прямого секвенирования позволило уточнить прогноз у 26,5% больных ОМЛ из групп промежуточного и неуточненного цитогенетиче-ского прогнозов за счет выявления криптических мутаций в генах TP53, FLT3, KIT, NRAS, NPM1 и DNMT3A. Однако прогноз стандартного химиотерапевтического лечения ОМЛ во всех случаях ухудшался.

analysis of NPM1 gene mutations detection results using sequencing and immunohistochemical technique. Journal of Ural Medical Academic Science 2013; 4: 124-7).

7. Walter R.B., Othus M., Burnett A.K. et al. Significance of FAB subclassification of "acute myeloid leukemia, NOS" in the 2008 WHO classification: analysis of 5848 newly diagnosed patients. Blood 2013; 121: 2424-31.

8. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Изотов Д.В. и др. Применение технологии прямого автоматического секвенирования для детекции мутаций генов ASXL1, DNMT3A, FLT3, KIT, NRAS, TP53 и WT1 при острых миелоидных лейкозах с неуточненным кариотипом. Вестник Уральской медицинской академической науки 2016; 4: 38-51. (Vinogradov A.V., Rezaykin A.V., Izotov D.V. et al. ASXL1, DNMT3A, FLT3, KIT, NRAS, TP53 and WT1 genes mutations detection in acute myeloid leukemia with unspecified karyotype using direct sequencing technique. Journal of Ural Medical Academic Science 2016; 4: 38-51).

9. Виноградов А.В. Разработка технологии детекции мутаций генов CDKN2A/ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 при острых миелоидных лейкозах. Российский онкологический журнал 2013: 4: 34-5. (Vinogradov A.V. Technology development of CDKN2A/ARF, FLT3,

KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 gene mutations detection during acute myeloid leukemia. Russian Journal of Oncology 2013: 4: 34-5).

10. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г. Детекция точечных мутаций в гене DNMT3A при острых миелоидных лейкозах методом прямого автоматического секвенирования. Бюллетень сибирской медицины 2015; 14(1): 18-23.(Vinogradov A.V., Rezaikin A.V., Sergeev A.G. DNMT3A gene point mutations detection in acute myeloid leukemia patients using sequencing technique. Bulletin of Siberian Medicine 2015; 14(1): 18-23).

11. Smith C.C., Wang Q., Chin C.S. et al. Validation of ITD mutations in FLT3 as a therapeutic target in human acute myeloid leukemia. Nature 2012; 485: 260-3.

12. Verstraete K., Vandriessche G., Januar M. et al. Structural insights into the extracellular assembly of the hematopoietic Flt3 signaling complex. Blood 2011; 118: 60-8.

13. Breitenbuecher F., Schnittger S., Grundler R. et al. Identification of a novel type of ITD mutations located in nonjuxtamembrane domains of the FLT3 tyrosine kinase receptor. Blood 2009; 113: 4074-7.

14. Szatkowski D., Hellmann A. The overexpression of KIT proto-onco-gene in acute leukemic cells is not necessarily caused by the gene mutation. Acta Haematol. 2015; 133: 116-23.

15. Heldin C.H., Lennartsson J. Structural and functional properties of platelet-derived growth factor and stem cell factor receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013; 5(8): a009100.

16. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сазонов С.В. и др. Клинико-пато-генетическая характеристика мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 и WT1 у больных острыми миелоидными лейкозами в возрастной группе 15-45 лет. Гены и клетки 2018; 14(3): 72-7. (Vinogradov A.V., Rezaykin A.V., Sazonov S.V. et al. Clinical and pathological features DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 and WT1 genes mutations detection in acute myeloid leukemia patient aged 15-45 years old. Genes and Cells 2018; 14(3): 72-7).

17. Dohner H., Dolnik A., Tang L. et al. Cytogenetics and gene mutations influence survival in older patients with acute myeloid leukemia treated with azacitidine or conventional care. Leukemia 2018; 32(12): 2546-57.

Поступила: 28.052019