CC BY
128
УДК 616.155.392.8-036.11:612.6.052.4
ДЕТЕКЦИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ йЫМГзЛ ПРИ ОСТРЫХ МИЕЛОИДНЫХ ЛЕЙКОЗАХ МЕТОДОМ ПРЯМОГО АВТОМАТИЧЕСКОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ
Виноградов А.В., Резайкин А.В., Сергеев А.Г.
Цель исследования - определить частоту точечных мутаций гена DNMT3A при острых миелоид-ных лейкозах (ОМЛ) методом прямого автоматического секвенирования.
Материал и методы. Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 34 больных ОМЛ в возрасте от 21 до 64 лет, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематоло-гическом центре (г. Екатеринбург) в период с 2012 по 2014 г., из них с морфологическим вариантом ОМЛ М0 - 3 пациента, М1 - 1, М2 - 12, М3 - 3, М4 - 10, М5 - 2, М6 - 1, М7 - 1 пациент, бла-стная плазмацитоидная дендритоклеточная опухоль обнаружена у одного больного. Выделение тотальной РНК из лейкозных клеток проводили методом сорбции на силикагелевом носителе либо методом лизиса клеток с последующим связыванием РНК из раствора с мембраной (силикой) в миницентрифужной колонке с последующей обратной транскрипцией. Участки кДНК, соответствующие экзонам 18-26 гена DNMT3A, амплифицировали методом полимеразной цепной реакции. Детекцию мутаций гена DNMT3A проводили методом прямого автоматического секвенирования с использованием генетического анализатора ABI Prism 310.
Результаты. Функционально значимые точечные мутации гена DNMT3A обнаруживались в 5,9% проб, во всех случаях - при ОМЛ, развившихся в исходе миелодиспластического синдрома, и были представлены несинонимичными нуклеотидными заменами. Частота детекции указанных мутаций при морфологических вариантах ОМЛ М2 и М4 без хромосомных аберраций и точечных мутаций гена ТР53 составляла 14,3%, что сопоставимо с данными многоцентровых международных исследований. Наряду с мутациями гена DNMT3A в указанных образцах определялись точечные мутации генов NPM1, KRAS, WT1. Во всех наблюдениях ОМЛ с мутациями гена DNMT3A ассоциировались с низкой эффективностью стандартной программной полихимиотерапии цитора-бином в сочетании с антрациклиновыми антибиотиками и неблагоприятным прогнозом.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: точечная мутация, острый миелоидный лейкоз, ген DNMT3A, прямое автоматическое секвенирование.
Министерство здравоохранения Свердловской области, г. Екатеринбург Уральский государственный медицинский университет, г. Екатеринбург
РЕЗЮМЕ
Введение
давно, однако лишь в 2010 г. T.J. Ley et al., используя технологию полногеномного секвенирования ДНК, установили, что мутации гена DNMT3A выявляются в 22,1% случаев ОМЛ, при этом более половины выявленных миссенс-мутаций приводили к повреждению остатка аргинина в 883 позиции метилтрансферазного домена белка dnmt3a [1]. Наибольшая частота мутаций DNMT3A обнаружена в цитогенетической группе ОМЛ промежуточного риска (диплоидный кариотип бластов), наименьшая - при ОМЛ со специфическими хромосомными транслокациями t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11), а также инверсией inv(16)(p13;q22), ассоциированными с благоприятным прогнозом [2, 3]. В последующих исследованиях было установлено, что
Гены семейства БЫМТЗ (БЫМГЗА - район 2p23.3, БЫМТЗБ - 20q11.21) кодируют ферменты - ДНК-метилтрансферазы, катализирующие метилирование нуклеотидных остатков ДНК, а именно необратимый перенос метильных групп от S-аденозил-метионина на цитидин, находящийся в специфическом ДНК-контексте (CpG-островки), обусловливая эпигенетическую модификацию экспрессии генов. Нарушение процессов метилирования ДНК при острых миелоид-ных лейкозах (ОМЛ) было обнаружено достаточно
И Виноградов Александр Владимирович, тел. 8-343-270-1899; e-mail: [email protected]
мутации гена DNMT3A являются ранним генетическим событием, приводящим к предлейкемической трансформации гемопоэтических клеток-предшественников, что может клинически манифестировать миело-диспластический синдром (МДС) или хроническое миелопролиферативное заболевание (ХМПЗ), сравнительно быстро трансформирующиеся в ОМЛ, и ассоциированы, таким образом, с неблагоприятным прогнозом [3-5]. Однако, несмотря на то что мутации DNMT3A оказались достаточно широко распространенными при МДС, ХМПЗ и ОМЛ, их выявление не нашло широкого применения в практической онкоге-матологии из-за отсутствия доступных коммерческих тест-систем и алгоритмов детекции.
Цель исследования - определить частоту точечных мутаций в теш DNMT3A при ОМЛ методом прямого автоматического секвенирования.
Материал и методы
Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 34 больных ОМЛ в возрасте от 21 до 64 лет, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематологическом центре (г. Екатеринбург) в период с 2012 по 2014 г. Среди них с морфологическим вариантом ОМЛ М0 по классификации ВОЗ [6] наблюдалось 3 пациента, М1 - 1, М2 - 12, М3 - 3, М4 - 10, М5 - 2, М6 - 1, М7 - 1 пациент, бластная плазмацито-идная дендритоклеточная опухоль обнаружена у одного больного.
Всем пациентам выполнено цитогенетическое (G-banding) и (или) молекулярно-генетическое (поли-меразная цепная реакция, ПЦР) исследование. Методом прямого автоматического секвенирования исследованы на наличие молекулярных повреждений экзо-ны 18-26 гена DNMT3A. Кроме того, в 32 образцах методом прямого автоматического секвенирования исследованы на наличие мутаций экзоны 7-12, 16-19 гена KIT и экзоны 12-15, 19-21 гена FLT3, в 31 - экзоны 1-4 гена NRAS и экзоны 6-9 гена WT1, в 30 - экзоны 4-11 гена ТР53 и экзоны 9-12 гена NPM1, в 18 - экзон 13 гена ASXL1 и экзоны 1-4 гена KRAS, в соответствии с ранее описанными методиками [7-9].
Выделение тотальной РНК из лейкозных клеток проводили методом сорбции на силикагелевом носителе либо методом лизиса клеток с последующим связыванием РНК из раствора с мембраной (силикой) в мини-центрифужной колонке с помощью комплекта реагентов QIAamp RNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Германия). Реакцию обратной транскрипции с целью получения кДНК проводили с использованием ревертазы M-MLV и гексануклеотидных праймеров со случайной последовательностью нуклеотидов («РЕВЕРТА-L», ЦНИИ
эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва). Целевые участки исследуемых генов клонировали методом ПЦР в виде одного фрагмента с помощью праймеров, разработанных на основе депонированных в GenBank (ЫСВГ) нуклеотидных последовательностей
(NM_175629, транскрипционный вариант 1 гена DNMT3A) и представленных в табл. 1. Анализ продуктов амплификации выполняли методом электрофореза с последующей детекцией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе.
Т аб л и ц а l
Последовательности праймеров для амплификации и секвенирования экзонов 18-26 гена DNMT3A
Название Последовательность Область применения
DNMT-F 5' GCACAAGGGTACCTACGG 3' Амплификация экзонов 18—26
DNMT-R 5' TTAACTTTGTGTCGCTACCTCA 3'
DNMT-S1 5' TTCTTCGCTAATAACCAC 3' Секвенирование
DNMT-S2 5' CCATGGGCGTTAGTGACA 3'
Секвенирование кДНК проводили на автоматическом генетическом анализаторе ABI Prism 310 по прямой и обратной последовательностям с использованием праймеров DNMT-S1 и DNMT-S2 согласно рекомендациям производителя. Сопоставление сегментов, выравнивание и сравнение последовательностей нуклеотидов и аминокислот осуществляли с использованием компьютерной программы MEGA, версия 5.0 [10].
Для проверки статистических гипотез применяли точный критерий Фишера. Доверительные интервалы (ДИ) для средних частот генных и хромосомных мутаций определены с вероятностью 95% на основе биномиального распределения.
Результаты и обсуждение
Точечные мутации гена DNMT3A выявлены в двух пробах (5,9% при 95%-м ДИ от 1,6 до 19,1%) и были представлены в обоих случаях несинонимичными нуклеотидными заменами, приводящими к замене аминокислотного остатка в метилтрансферазном домене белка dnmt3a [11]. Первая проба, полученная от больного ОМЛ М2, который развился в исходе ХМПЗ, содержала точечную мутацию G2645A по второй позиции триплета CGC, приводящую к аминокислотной замене R882H (т.е. аргинина на гистидин в позиции 882). Указанная мутация была впервые описана A.M. Jankowska et al. при хроническом миеломоноци-тарном лейкозе (ХММЛ) [11]. Позднее в эксперименте J. Xu et al. было показано, что лабораторные животные, трансфецированные вектором, содержащим ген DNMT3A с заменой G2645A, развивали клинику заболевания, похожего на ХММЛ, что подтверждало роль
указанной мутации в формировании предлейкемическо-го фенотипа кроветворных клеток-предшественниц [12]. Наряду с мутацией в гене DNMT3A образец содержал также протяженную делецию кодирующей последовательности гена WT1 (с 1289 по 1372 нуклеотид, что соответствует экзону 8), наличие которой приводило к укорочению кодируемого белка Wt1 на 28 аминокислотных остатков. Вторая проба, полученная от больного ОМЛ М4, который развился в исходе ХММЛ, содержала точечную мутацию C2141G по второй позиции триплета ТСС, что приводило к аминокислотной замене S714C (т.е. серина на цистеин в позиции 714) в метилтрансферазном домене белка Dnmt3a. Наряду с указанной трансверсией в лейкемических клетках из этого образца определялась тетрануклеотидная инсерция в экзоне 12 гена NPM1 (так называемая ин-серция типа А [13]), а также две несинонимичные нуклеотидные замены в гене KRAS - G88C и А311С, приводящие, соответственно, к аминокислотным заменам D30H и К104Т в кодируемом белке. Таким образом, мутации гена DNMT3A были выявлены в обоих случаях при ОМЛ, трансформированных из предшествующих МДС и ХМПЗ, и кооперировались на молекулярном уровне с мутациями генов KRAS, NPM1 и WT1.
Сравнительно низкая частота выявления функционально значимых мутаций гена DNMT3A в исследуемой выборке может быть объяснена ее структурой. По данным литературы [2, 3] известно, что мутации DNMT3A ассоциированы с нормальным кариотипом, морфологическими вариантами ОМЛ М4 и М5, а также наличием тетрануклеотидных инсерций в экзоне 12 гена NPM1. В исследуемой выборке из 32 пациентов с кодирующей последовательностью экзонов 18-26 гена DNMT3A «дикого типа» в 13 случаях (40,6% при 95%-м ДИ от 23,9 до 55,0%) определялись структурные и (или) количественные хромосомные аберрации, в том числе в сочетании с точечными мутациями одного из исследуемых генов - 4 наблюдения, двух - 4, трех - 1 (тандемная дупликация в гене FLT3, несинонимичные трансверсии A1621C и C1288T в генах KIT и WT1 соответственно, табл. 2).
В пробах больных ОМЛ без хромосомных аберраций (n = 19) и кодирующей последовательностью экзонов 18-26 гена DNMT3A «дикого типа» в семи случаях (21,9% при 95%-м ДИ от 19,1 до 59,0%) также определялись мутации одного из исследованных методом прямого автоматического секвенирования гена (в том
Таблица 2
Результаты детекции точечных мутаций генов FLT3, KIT, NPM1, WT1, NRAS, KRAS, ASXL1 и хромосомных аномалий у больных с кодирующей последовательностью экзонов 18-26 гена DNMT3A ««дикого типа» (n = 32)
Ген Количество проб Частота мутаций, % (абс.) Кариотип в пробах, содержащих мутации (и) Комбинации с мутациями других генов (n) Морфологический подтип
FLT3 30 26,7 (8) Нормальный (3) +8 (1) К9;17) +8, -14 (1) К15;17), ^(9) (1) Мало митозов (2) NPM1 (3), KIT (3), WT1 (1), ASXL1 (1) М1, М2, М3, М4, М5, М6
KIT 30 23,3 (7) Нормальный (3) add(2q)(1) К15;17), ^(9) (1) add(1p), +6, +8 (1) Мало митозов (1) NPM1 (3), FLT3 (3), TP53 (1), WT1 (1) М1, М2, М3, М4, М6, ПДКО*
NRAS 29 17,2 (5) Нормальный (2) Комплексные аберрации (1) del(5q), del(15q) (1) 1(3;12), dup(1) (1) ASXL1 (2), KRAS (1) М0, М2, М7
WT1 29 3,5 (1) К15;17), Шу(9) (1) FLT3 (1), KIT (1) М3
NPM1 28 21,4 (6) Нормальный (4) Мало митозов (2) FLT3 (3), KIT (3) М1, М2, М4, М6
TP53 28 7,1 (2) Комплексные аберрации (1) Мало митозов (1) KIT (1) М2
ASXL1 17 23,5 (4) +8 (1) del(5q), del(15q) (1) Комплексные аберрации (1) Неизвестен (1) NRAS (2), FLT3 (1) М0, М2, М4
KRAS 16 6,3 (1)* 1(3;12), dup(1) (1) NRAS (1) М0
* ПДКО - бластная плазмацитоидная дендритоклеточная опухоль;
** экспрессия гена NRAS не определялась, по-видимому, вследствие наличия транслокации t(3;12)(q25;p13).
числе в 2 образцах - тетрануклеотидные инсерции в экзоне 12 гена NPM1 при морфологическом варианте ОМЛ М4), в трех (9,4% при 95%-м ДИ от 5,5 до 37,6%) - двух генов (в том числе по одному случаю -NPM1 в комбинации с FLT3 либо KIT при ОМЛ М2 и М4 соответственно), в двух (6,3% при 95%-м ДИ от 2,9 до 31,4%) - трех генов (в обоих случаях - инсер-ции в экзоне 12 гена NPM1 в комбинации с точечными мутациями генов FLT3 и KIT при морфологических вариантах ОМЛ М1 и М6). Не выявлено хромосомных и генных мутаций у семи пациентов (21,9% при 95%-м ДИ от 10,3 до 36,8%), из них трое (9,4% при 95%-м ДИ от 3,0 до 23,0%) - ОМЛ М4 с диплоидным карио-типом, один (3,1% при 95%-м ДИ от 0,5 до 14,9%) -ОМЛ М4 с недостаточным количеством в исследуемом образце метафазных пластинок. Таким образом, частота детекции мутаций гена DNMT3A при морфологических вариантах ОМЛ М2 и М4 без хромосомных аберраций и мутаций гена ТР53 составляла в исследуемой выборке 14,3% (при 95%-м ДИ от 4,7 до 35,8%), т.е. была сопоставимой с данными международных многоцентровых исследований [2-4].
В обоих наблюдениях DNMT3A-позитивные больные ОМЛ имели неблагоприятный прогноз. Течение заболевания характеризовалось развитием первичной резистентности к стандартной программной полихимиотерапии цитарабином в сочетании с антрацикли-новыми антибиотиками, медиана наблюдения пациентов не превышала 6 мес.
Таким образом, использование метода прямого автоматического секвенирования для детекции точечных мутаций в экзонах 18-26 гена DNMT3A в образцах периферической крови и костного мозга может применяться в качестве дополнительной диагностической опции на этапе генодиагностики, стратификации прогноза и назначения таргетной эпигеномной терапии [14] больным ОМЛ.
Выводы
1. Средняя частота точечных мутаций, определявшихся в экзонах 18-26 гена DNMT3A методом прямого автоматического секвенирования, составляла при ОМЛ 5,9% (при 95%-м ДИ от 1,6 до 19,1%), а в морфологических подгруппах ОМЛ М2 и М4 без хромосомных аберраций и точечных мутаций гена ТР53 -14,3% (при 95%-м ДИ от 4,7 до 35,8%).
2. Наряду с мутациями экзонов 18-26 гена DNMT3A в исследуемых образцах определялись точечные мутации генов NPM1, KRAS и WT1, что может свидетельствовать о возможности молекулярной коопе-
рации их белковых продуктов в ходе злокачественной трансформации лейкемической клетки-
предшественника.
3. Наличие мутаций в экзонах 18-26 гена DNMT3A ассоциировалось с низкой эффективностью стандартной программной полихимиотерапии и неблагоприятным прогнозом ОМЛ.
Литература
1. Ley T.J., Ding L., WalterM.J., McLellan M.D., Lamprecht T, Larson D.E., Kandoth C., Payton J.E., Baty J., Welch J., Harris C.C., Lichti C.F., TownsendR.R., Fulton R.S., Doo-ling D.J., KoboldtD.C., SchmidtH., Zhang Q., Osborne J.R., Lin L., O'Laughlin M, McMichael J.F., Delehaunty K.D., McGrath S.D., Fulton L.A., Magrini V.J., Vickery T.L., Hundal J., CookL.L., Conyers J.J., Swift G.W., Reed J.P., Alld-redge P.A., Wylie T., Walker J., Kalicki J., Watson M.A., Heath S., Shannon W.D., Varghese N., Nagarajan R., WesterveltP., Tomasson M.H., LinkD.C., Graubert T.A., DiPersio J.F., Mardis E.R., Wilson R.K. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia // NEJM. 2010. V. 363, № 25. P. 2424-2433.
2. Thol F., Damm F., Lüdeking A., Winschel C., Wagner K., Morgan M., Yun H., Göhring G., Schlegelberger B., Hoelzer D., LübbertM., KanzL., Fiedler W., Kirchner H., Heil G., Krauter J., Ganser A., Heuser M. Incidence and prognostic influence of DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia // J. Clin. Oncol. 2011. V. 29, № 21. P. 2889-2896.
3.Marcucci G., MetzelerK.H., SchwindS., BeckerH., Maharry K., Mrozek K., Radmacher M.D., Kohlschmidt J., Ni-coletD., Whitman S.P., Wu Y.Z., Powell B.L., Carter T.H., Kolitz J.E., WetzlerM., CarrollA.J., BaerM.R., Moore J.O., Caligiuri M.A., Larson R.A., Bloomfield C.D. Age-related prognostic impact of different types of DNMT3A mutations in adults with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia // J. Clin. Oncol. 2012. V. 30, № 7. P. 742-750.
4. The Cancer Genome Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia // NEJM. 2013. V. 368, № 22. P. 2059-2074.
5. ShlushL.I., ZandiS., MitchellA., Chen W.C., Brandwein J.M., Gupta V., Kennedy JA., Schimmer A.D., Schuh A.C., Yee K.W., McLeod J.L., Doedens M., Medeiros J.J., Marke R., Kim H.J., Lee K., McPherson J.D., Hudson T.J., HALT Pan-Leukemia Gene Panel Consortium, Brown A.M., Yousif F., Trinh Q.M., Stein L.D., Minden M.D., Wang J.C., Dick J.E. Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia // Nature. 2014. V. 506, № 7488. P. 328-333.
6. WHO classification of tumors of haematopoietic and lym-phoid tissues / Swerdlow S. H., Campo E., Harris N. L., Jaffe E. S., Pileri S. A., Stein H., Thiele J., Vardiman J.W. Lyon: IARC, 2008. 439 p.
7. Виноградов А.В. Разработка технологии детекции мутаций генов CDKN2A/ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 при острых миелоидных лейкозах // Рос. онколог. журн. 2013. № 4. С. 34-35.
8. Виноградов А.В., Резайкин А.В., Ивлева Е.К., Сергеев А.Г. Разработка технологии детекции мутаций гена ASXL1 при острых миелоидных лейкозах методом прямого автоматического секвенирования // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биохимии и биотехнологии», 25-27 сентября 2013 г. Уфа: РИЦ БашГУ, 2013. С. 20-23.
9. ВиноградовА.В., Резайкин А.В., СергеевА.Г. Детекция мутаций генов KRAS и NRAS при острых миелоидных лейкозах с использованием технологии прямого автоматического секвенирования // Вестн. Башкир. ун-та. 2014. Т. 19, № 3. С. 845-847.
10. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28, № 10. P. 2731-2739.
11. Jankowska A.M., Makishima H., Tiu R.V., Szpurka H., Huang Y., Traina F., Visconte V., Sugimoto Y., Prince C., O'Keefe C., Hsi E.D., List A, Sekeres M.A., Rao A., McDevitt M.A., Maciejewski J.P. Mutational spectrum analysis of chronic myelomonocytic leukemia includes genes associated with epigenetic regulation: UTX, EZH2, and DNMT3A // Blood. 2011. V. 118, № 14. P. 3932-3941.
12.Xu J., Wang Y.Y., Dai Y.J., Zhang W., Zhang W.N., Xiong S.M., Gu Z.H., Wang K.K., Zeng R., Chen Z., Chen S.J. DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression / DNA methylation in hematopoietic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V. 111, № 7. P. 2620-2625.
13. ВиноградовА.В., РезайкинА.В., СалаховД.Р., Иощен-ко С.Е., Сергеев А.Г. Сравнительный анализ результатов типирования молекулярных повреждений гена NPM1 при острых миелоидных лейкозах с использованием прямого автоматического секвенирования и иммуноги-стохимического метода // Вестн. Урал. мед. академ. науки. 2013. № 4. С. 124-127.
14. Subramaniam D., Thombre R., Dhar A., Anant S. DNA methyltransferases: a novel target for prevention and therapy // Front. Oncol. 2014. № 1. P. 80.
Поступила в редакцию 24.11.2014 г.
Утверждена к печати 04.02.2015 г.
Виноградов Александр Владимирович (И) - канд. мед. наук, Министерство здравоохранения Свердловской области, отдел организации специализированной медицинской помощи, в том числе высокотехнологичной медицинской помощи; УралГМУ, лаборатория молекулярной диагностики (г. Екатеринбург).
Резайкин Алексей Васильевич - канд. мед. наук, Министерство здравоохранения Свердловской области, отдел организации специализированной медицинской помощи, в том числе высокотехнологичной медицинской помощи; УралГМУ, лаборатория молекулярной диагностики (г. Екатеринбург).
Сергеев Александр Григорьевич - д-р мед. наук, профессор, Министерство здравоохранения Свердловской области, отдел организации специализированной медицинской помощи, в том числе высокотехнологичной медицинской помощи; УралГМУ, лаборатория молекулярной диагностики (г. Екатеринбург).
И Виноградов Александр Владимирович, тел. 8-343-270-1899; e-mail: [email protected]
DNMT3A GENE POINT MUTATIONS DETECTION IN ACUTE MYELOID LEUKEMIA PATIENTS USING SEQUENCING TECHNIQUE
Vinogradov A.V., Rezaykin A.V., Sergeev A.G.
Sverdlovsk Regional Ministry of Health, Ekaterinburg, Russian Federation Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russian Federation
ABSTRACT
Aim: to estimate the frequency of DNMT3A gene exons 18-26 point mutations in acute myeloid leukemia (AML) patients (pts) using target automatic sequencing technique.
Material and Methods. Bone marrow and peripheral blood samples were obtained from 34 AML pts aged 21 to 64, who were treated in Sverdlovsk Regional Hematological Centre (Ekaterinburg) during the period 2012-2014. Distribution of the pts according to FAB-classification was as follows: AML M0 - 3, Ml - 1, M2 - 12, M3 - 3, M4 - 10, M5 - 2, M6 - 1, M7 - 1, blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm - 1. Total RNA was extracted from leukemic cells and subjected to reverse transcription. DNMT3A gene exons 18-26 were amplified by PCR. Detection of mutations in DNMT3A gene was performed by direct sequencing. Sequencing was realized using an automatic genetic analyzer ABI Prism 310.
Results. The average frequency of functionally significant point mutations in DNMT3A gene exons 1826 among the treated AML pts was 5.9%. They were detected in morphological subgroups M2 and M4
(according to WHO classification). The average frequency of DNMT3A gene exons 18-26 point mutations among the AML M2 and M4 pts without chromosomal aberrations and TP53 gene point mutations was 14.3%. In both cases there were samples in which DNMT3A gene mutations were accompanied by molecular lesions of NPM1, KRAS and WT1 genes. AML pts with DNMT3A gene exons 18-26 point mutations characterized by poor response to standard chemotherapeutic regimens and unfavorable prognosis.
KEY WORDS: point mutation, acute myeloid leukemia, DNMT3A gene, sequencing.
Bulletin of Siberian Medicine, 2015, vol. 14, no. 1, pp. 18-23
References
1. Ley T.J., Ding L., Walter M.J., McLellan M.D., Lamprecht T., Larson D.E., Kandoth C., Payton J.E., Baty J., Welch J., Harris C.C., Lichti C.F., Townsend R.R., Fulton R.S., Dooling D.J., Koboldt D.C., Schmidt H., Zhang Q., Osborne J.R., Lin L., O'Laughlin M., McMichael J.F., Delehaunty K.D., McGrath S.D., Fulton L.A., Magrini V.J., Vickery T.L., Hundal J., Cook L.L., Conyers J.J., Swift G.W., Reed J.P., Alldredge P.A., Wylie T., Walker J., Kalicki J., Watson M.A., Heath S., Shannon W.D., Varghese N., Nagarajan R., Westervelt P., Tomasson M.H., Link D.C., Graubert T.A., DiPersio J.F., Mardis E.R., Wilson R.K. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. NEJM, 2010, vol. 363, no. 25, pp. 2424-2433.
2. Thol F., Damm F., Lüdeking A., Winschel C., Wagner K., Morgan M., Yun H., Göhring G., Schlegelberger B., Hoelzer D., Lübbert M., Kanz L., Fiedler W., Kirchner H., Heil G., Krauter J., Ganser A., Heuser M. Incidence and prognostic influence of DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia. J. Clin. Oncol., 2011, vol. 29, no. 21, pp. 2889-2896.
3. Marcucci G., Metzeler K.H., Schwind S., Becker H., Maharry K., Mrozek K., Radmacher M.D., Kohlschmidt J., Ni-colet D., Whitman S.P., Wu Y.Z., Powell B.L., Carter T.H., Kolitz J.E., Wetzler M., Carroll A.J., Baer M.R., Moore J.O., Caligiuri M.A., Larson R.A., Bloomfield C.D. Age-related prognostic impact of different types of DNMT3A mutations in adults with primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia. J. Clin. Oncol., 2012, vol. 30, no. 7, pp. 742-750.
4. The Cancer Genome Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. NEJM, 2013, vol. 368, no. 22, pp. 2059-2074.
5. ShlushL.I., Zandi S., Mitchell A., Chen W.C., Brandwein J.M., Gupta V., Kennedy J.A., Schimmer A.D., Schuh A.C., Yee K.W., McLeod J.L., Doedens M., Medeiros J.J., Marke R., Kim H.J., Lee K., McPherson J.D., Hudson T.J., HALT Pan-Leukemia Gene Panel Consortium, Brown A.M., Yousif F., Trinh Q.M., Stein L.D., Minden M.D., Wang J.C., Dick J.E. Identification of pre-leukaemic haematopoietic stem cells in acute leukaemia. Nature, 2014, vol. 506, no. 7488, pp. 328-333.
6. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L., Jaffe E.S., Pileri S.A., Stein H., Thiele J., Vardiman J.W. WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC, 2008. 439 p.
7. Vinogradov A.V. Technology development of CDKN2A/ARF gene mutations detection, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 during acute myeloid leukemia. Rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal - Russian Journal of Oncology, 2013, no. 4, pp. 34-35 (in Russian).
8. Vinogradov A.V., Rezaikin A.V., Ivleva E.C., Sergeev A.G. Development of ASXL1 gene mutations detection technology in acute myeloid leukemia patients using direct sequencing method. Materials of Russian conference with international participation "Modern topics of biochemistry and biotechnology", 25-27 September 2013. Ufa, Bashkir State University Publ., 2013. Pp. 20-23.
9. Vinogradov A.V., Rezaikin A.V., Sergeev A.G. KRAS and NRAS genes point mutations detection in acute myeloid leukemia patients using sequencing technique. Bulletin BSU, 2014, vol. 19, no. 3, pp. 845-847 (in Russian).
10. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol., 2011, vol. 28, no. 10, pp. 2731-2739.
11. Jankowska A.M., Makishima H., Tiu R.V., Szpurka H., Huang Y., Traina F., Visconte V., Sugimoto Y., Prince C., O'Keefe C., Hsi E.D., List A., Sekeres M.A., Rao A., McDevitt M.A., Maciejewski J.P. Mutational spectrum analysis of chronic myelomonocytic leukemia includes genes associated with epigenetic regulation: UTX, EZH2, and DNMT3A. Blood, 2011, vol. 118, no. 14, pp. 39323941.
12. Xu J., Wang Y.Y., Dai Y.J., Zhang W., Zhang W.N., Xiong S.M., Gu Z.H., Wang K.K., Zeng R., Chen Z., Chen S.J. DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression. DNA methyla-tion in hematopoietic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2014, vol. 111, no. 7, pp. 2620-2625.
13. Vinogradov A.V., Rezaikin A.V., Salakhov D.R., Ioschen-ko S.E., Sergeev A.G. Comparative Analysis of NPM1 gene mutations detection results using sequencing and immunohistochemical technique. Bulletin of Ural Medical Academic Science, 2013, no. 4, pp. 124-127 (in Russian).
14. Subramaniam D., Thombre R., Dhar A., Anant S. DNA methyltransferases: a novel target for prevention and therapy. Front. Oncol., 2014, no. 1, p. 80.
Vinogradov Alexander V. (H), Sverdlovsk Regional Ministry of Health; Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russian Federation. Rezaykin Alexey V., Sverdlovsk Regional Ministry of Health; Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russian Federation. Sergeev Alexander G., Sverdlovsk Regional Ministry of Health; Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russian Federation.
H Vinogradov Alexander V., Ph. +7-343-270-1899; e-mail: [email protected]
