Детекция точечных мутаций гена Kit при острых миелоидных лейкозах с использованием технологии прямого автоматического секвенирования Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

726

БИОЛОГИЯ

УДК: 616-006.446.8

ДЕТЕКЦИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИИ ГЕНА KIT ПРИ ОСТРЫХ МИЕЛОИДНЫХ ЛЕЙКОЗАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ ПРЯМОГО АВТОМАТИЧЕСКОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

© А. В. Виноградов*, А. В. Резайкин, А. Г. Сергеев

Уральский государственный медицинский университет Россия, 620028 г.Екатеринбург, ул. Репина, 3.

Тел.: +7 (343) 268 36 48.

E-mail: vinogradov-av@russia. ru

Цель исследования - разработать технологию детекции и определить частоту точечных мутаций гена KIT при острых миелоидных лейкозах (ОМЛ) с использованием метода прямого автоматического секвенирования. Установлено, что функционально значимые мутации гена KIT обнаруживались в 9.4% проб при морфологических вариантах ОМЛ М1, М2 и М5. Наряду с мутациями гена KIT, в 7.5% проб определялись точечные мутации генов FLT3, NPM1, NRAS и хромосомные аберрации (транслокация t(8;21)(q22;q22), трисомии хромосом 8 и 21).

Ключевые слова: точечная мутация, острый миелоидный лейкоз, ген KIT, прямое автоматическое секвенирование.

Актуальность

Мутации гена KIT являются одним из наиболее распространенных вторичных генетических событий при острых миелоидных лейкозах, обусловливающих неблагоприятный прогноз, в т.ч. у больных с транслокацией t(8;21) и инверсией inv(16) [1]. Однако, технология детекции этих мутаций, пригодная для использования в практической онкогематологии, до сих пор не разработана, что затрудняет прогностическую стратификацию пациентов на этапе назначения химиотерапевтиче-ского лечения и планирования пересадки костного мозга и/или стволовых кроветворных клеток.

Цель работы - разработать технологию детекции и определить частоту точечных мутаций гена KIT при острых миелоидных лейкозах с использованием метода прямого автоматического секвени-рования.

Материалы и методы исследований

Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 53 больных ОМЛ в возрасте от 18 до 82 лет, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематологическом центре в период с 2008 по 2012 г. Среди них с морфологическим вариантом ОМЛ М0 по FAB-классификации наблюдалось двое пациентов, М1 - 2, М2 - 22, М3 -5, М4 - 14, М4эо - 3, М5 - 1, М6 - 3, острый мие-лофиброз - 1.

Выделение тотальной РНК из лейозных клеток проводили методом сорбции на силикагелевом носителе с последующим проведением реакции обратной транскрипции для получения кДНК. Два участка гена KIT, включавшие экзоны 7-12 (1154 -1980 п.н.) и 16-19 (2198 - 2635 п.н.), клонировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров KIT1-F (5' CCG AAG GAG GCA CTT ACA C 3'), KIT1-R (5' GCA GGC TCC AAG TAG ATT CA 3'), KIT2-F (5' CAA CCA

AGG CCG ACA A 3') и KIT2-R (5' ACT TAG AAT CGA CCG GCA TT 3'). Анализ продуктов амплификации проводили методом электрофореза с последующей детекцией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе.

Секвенирование кДНК проводили на автоматическом генетическом анализаторе ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США) по прямой (праймеры KIT1-SF, 5' TCA ATG CTG CCA TAG 3', и KIT2-SF, 5' TGA CTC CCG CCA TCA 3') и обратной (праймеры KIT1-R и KIT2-R) последовательностям, согласно рекомендациям производителя. Сопоставление сегментов, выравнивание и сравнение последовательностей нуклеотидов и аминокислот проводили с использованием компьютерной программы MEGA, версия 3.1 [2].

Также в исследуемой группе всем пациентам выполнен цитогенетический и/или молекулярно-генетический анализ (ПЦР на t(8;21), inv(16), t(15;17), t(9;22), аномалии 11q23). Кроме того, во всех пробах с использованием технологии прямого автоматического секвенирования на наличие мутаций исследованы экзоны 12-15 и 19-21 гена FLT3, в 46 - экзоны 9-12 гена NPM1, в 35 - экзоны 1-4 гена NRAS, в 43 - экзоны 4-11 гена ТР53, в 33 -экзоны 6-9 гена WT1 в соответствии с ранее описанной методикой [3].

Результаты исследований и их обсуждение

Точечные мутации гена KIT выявлены в 19 пробах (35.8%), и были представлены делециями (2 пробы, 3.8%) и нуклеотидными заменами (17 случаев, 32.1%). При этом в 14 пробах (26.4%) определялись только синонимичные замены, а в трех (5.7%), наряду с синонимичными, несинонимичные. В большинстве наблюдений (94.3%) количественно преобладал второй транскрипционный вариант гена KIT.

Функционально значимые, то есть приводящие к изменению структуры и функциональной

* автор, ответственный за переписку

ISSN 1998-4812

Вестник Башкирского университета. 2013. Т. 18. №3

727

активности кодируемого белка, мутации гена KIT обнаруживались в 5 случаях (9.4%) при морфологических вариантах М1, М2 (3 наблюдения) и М5. Делеции экзонов 10 и 11 гена KIT протяженностью с 1529 по 1774 позиции нуклеотидов определялись в двух пробах (3.8%) при ОМЛ М2 с транслокацией t(8;21)(q22;q22) и транзицией G38A экзона 1 гена NRAS, а также при ОМЛ М5 с внутренней тандем-ной дупликацией кодирующей последовательности юкстамембранного домена (ITD) гена FLT3.

Несинонимичная трансверсия A1621C в сочетании с синонимичной G2586C определялась при ОМЛ М2 с кариотипом 48, XX, +8, +21 и ОМЛ М1 с тетрануклеотидной инсерцией экзона 12 гена NPM1 и ITD FLT3. В одном случае при ОМЛ М2 в пробе одновременно присутствовали несинонимичные замены A1621C, A1636G, а также синонимичная транзиция Х1821С, при этом каких-либо других аномалий с использованием ПЦР-метода выявлено не было, а кариотип лейкозных клеток уточнить не удалось из-за отсутствия в препарате качественных метафазных пластинок.

Таким образом, в четырех наблюдениях (7.5%) при ОМЛ с функционально значимыми мутациями гена KIT определялись мутации других исследованных генов (FLT3, NPM1, NRAS) и хромосомные аберрации (транслокация t(8;21), трисомии хромосом 8 и 21). Одновременное выявление этих генетических аномалий свидетельствует, по-видимому, об эволюции лейкозного клона, несущего «условно-инициирующую мутацию» (например, t(8;21) или инсерцию экзона 12 гена NPM1), за счет нако-

пления дополнительных молекулярных повреждений, что может обусловливать снижение эффективности стандартной полихимиотерапии и неблагоприятный прогноз ОМЛ [4].

Заключение

Таким образом, с использованием разработанной тест-системы функционально значимые точечные мутации в экзонах 7-12 и 16-19 гена KIT определены в 9,4% ОМЛ. Наряду с мутациями гена KIT, в 7.5% проб определялись точечные мутации генов FLT3, NPM1, NRAS и хромосомные аберрации (транслокация t(8;21), трисомии хромосом 8 и 21), что может свидетельствовать об эволюции лейкоз-ного клона посредством накопления дополнительных молекулярных повреждений и обусловливать снижение эффективности стандартной химиотерапии и неблагоприятный прогноз ОМЛ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Testa U., Riccioni R. Deregulation og apoptosis in acute myeloid leukemia // Hematologica. 2007. V. 92. №1. P. 81-94.

2. Чемерис А. В., Ахунов Э. Д., Вахитов В. А. Секвенирова-ние ДНК. М.: Наука, 1999. 429 с.

3. Виноградов А.В. Разработка технологии детекции мутаций генов CDKN2A/ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 при острых миелоидных лейкозах // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые методы в онкологической практике», 25-26 июня 2013 г. Барнаул: АЗБУКА, 2013. С. 181-182.

4. Сергеев А. Г., Иванов Р. А. Генодиагностика лейкозов. Екатеринбург: УГМА, 1998. 39 c.

Поступила в редакцию 03.08.2013 г.