CC BY
227
УДК 619:616.98.578.828.11л
Использование полимеразной цепной реакции в диагностике лейкоза КРС
Л.Н. Чижова, к. б. н.
Д.Е. Белов, асп.
Важное экономическое значение в животноводстве имеет проблема лейкоза крупного рогатого скота. Но до настоящего времени все еще не решен вопрос прижизненной диагностики, что позволило бы предотвратить значительные прямые потери от опухолевидных форм лейкоза. Нет полной ясности в отношении путей передачи возбудителя болезни и формирования механизма устойчивости к этому заболеванию (Бурба Л.Г., Вахилов А.Ф., Горбатов В.А., 1988).
Существующие методы диагностики (РИД, гематологический) не в состоянии обнаружить всех инфицированных животных по причине отсутствия либо низкого уровня антител. Серологические тесты могут дать также неоднозначный результат на ранних стадиях заболевания животных, которые, например, персистентно инфицированы вирусом диареи КРС, что обусловлено снижением синтеза lg G1, а также в случае обнаружения инфекции у телят с колостральным иммунитетом, родившихся от BLV-инфицированных коров (Ballagi-Pordany A., Klintevall K., Merza M. et al., 1992). Кроме того, при иммунологической диагностике возникают ложные положительные результаты. Иногда они обусловлены высоким содержанием иммуноглобулинов в сыворотке крови некоторых животных, что может быть связано с различными патологиями (хроническим артритом или травматическим перитонитом и др.). Неспецифическая реакция наблюдается в сыворотке крови вакцинированных животных, что также связано с высоким содержанием lg G ( Klintevall K., Berg A., Svedlund G. et al., 1993).
Задачей наших исследований на первом этапе явилось сравнительное изучение РИД- и ПЦР- диагностики. В настоящее время мы располагаем принципиально новым методом диагностики BLV, который дает возможность выявлять провирус лейкоза на ранних стадиях с высокой точностью, - методом
ПЦР - ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестриктных фрагментов).
Методика диагностики лейкоза КРС методом ПЦР.
Геном вируса лейкоза КРС содержит 8714 нуклеотидов и имеет следующую генетическую структуру: 5LTR -gag-pol-env-pXBL-3'LTR. Нами использовались праймеры к генам gag и env, каторые предположительно являются наиболее информативными, как показали работы Калашниковой Л.А., Дудина И.М., Глазко В.И., 2001.
Ген gag -нуклеотиды находятся в следующей позиции - 628-1806.
Ген env-позиция 4821-6368.
Состав общей смеси для ПЦР
Кол- во проб и- рок ДНК, мкл ПЦР, буфер dNTP мкл Объем смеси праймеров, мкл Объем Tag- поли- меразы, мкл Объем H2O, мкл Минера -льное масло, мкл Общий состав смеси, мкл
1 2,0 4,0 3,0 1,5 1,0 10,0 3,5 25,0
П Программа ПЦР:
горячий старт -95С-1мин 92С-50с
денатурация -94С-1мин отжиг праймеров-62С-1мин 55С-50с
35 циклов синтез-72С-1,5мин 72С-1мин
Оценка результатов ПЦР
Электрофорез амплификатов проводится в 1,5%-ном агарозном геле, содержащем 0,2 мкг/мл бромистого этидия .
Для пары праймеров GAG размер продукта ПЦР должен соответствовать размеру первичной последовательности провируса гена Gag бычьего лейкоза, если таковой присутствует в геноме анализируемого животного, и составлять 364пн.
Для пары праймеров ENV размер продукта ПЦР должен соответствовать размеру первичной последовательности провируса гена Env бычьего лейкоза, если таковой присутствует в геноме анализируемого животного, и составлять
367пн. (Калашникова Л.А., Дудин И.М., Глазко В.И., Рыжова Н.В., Голубина Е.П. 1999).
Результаты, полученные при электрофорезе, фиксируются с помощью цифровой видеокамеры Samsung. Снимки обрабатываются программами «Gel Analusis» и «Gel imadher». В качестве положительного контроля используется кровь трех гематологически больных коров после подтверждения диагноза методом ПЦР по обоим генам(gag и env).
На базе колхоза - племзавода им. Чапаева Кочубеевского района Ставропольского края проводятся исследования животных на носительство BLV с использованием ПЦР с целью сравнения полученных нами данных с результатами анализа РИД краевой баклаборатории. Образцы крови КРС помещали в пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта 0,1%-ный раствор гепарина. Пробы хранили при 40С не более 5...7 дней, для более длительного хранения их замораживали при -200С.
Однако этиологическим агентом лейкоза КРС является представитель семейства ретровирусов - вирус бычьего лейкоза (BLV). По строению генома, функциональной организации и характеру развития болезни BLV близок к таким ретровирусам, как вирус Т клеточного лейкоза человека - HTLV-1/2 и вирус иммунодефицита человека - Н1У(Попов А.Н., Адаричев В.А., Калачиков С.М. и др., 1993), что придает особое значение проблеме его изучения. В отличие от Т- клеточного лейкоза человека BLV поражает В- лимфоциты, встраиваясь в геном клетки хозяина в виде ДНК-копии (провируса) (Маслов М.В., Маслова С.В., 2001).
Вышеизложенное дает нам возможность предположить, что наибольшая концентрация провирусной ДНК будет содержаться именно в В-лимфоцитах. Основываясь на этом, для повышения чувствительности анализа методом ПЦР целесообразно выделить ДНК по измененной методике, а именно, провести выделение ДНК в два этапа. Первый этап предусматривает выделение лимфоцитов из цельной крови животного методом Вольфа, на втором этапе уже из этих лимфоцитов будет выделена ДНК. Нами было принято решение
выделить 12 проб ДНК из крови нетелей, участвующих в опыте, руководствуясь этим методом. В дальнейшем по результатам ПЦР - анализа будет проведено сравнение, которое даст нам возможность судить о том, достаточна ли чувствительность ПЦР-анализа для обнаружения провируса лейкоза по схеме:
КРОВЬ - ДНК либо необходимо прибегать к другой схеме:
КРОВЬ - ЛИМФОЦИТЫ - ДНК.
На следующем этапе планируется выявление животных, несущих в себе гены устойчивости или восприимчивости к BLV. На сегодняшний день известны аллели гена BoLA-DRB3, отвечающие за чувствительность и устойчивость крупного рогатого скота к лейкозу, вызываемому ВЛКРС. Немаловажен тот факт, что ген пролактина (PRL) у крупного рогатого скота находится на той же хромосоме (23q21), что и гены главного комплекса гистосовместимости, и тесно сцеплен с геном BoLA-DRB3. Это создает предпосылки выявления у КРС генотипов, обеспечивающих одновременно высокую молочную продуктивность и устойчивость к лейкозу, методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (ПЦР-ПДРФ) (Сулимова Г.Е., 2001).
Ген BoLA-DRB3 является одним из основных генов, определяющих иммунный ответ организма на вирусную инфекцию. Разные аллели этого гена играют различную роль в формировании устойчивости КРС к персистентному лимфоцитозу, вызываемому вирусом лейкоза КРС. В частности, были выделены и описаны аллели, определяющие устойчивость или восприимчивость КРС к этому заболеванию. В данном случае с использованием трех рестриктаз можно типировать более 50 аллелей этого гена, в том числе и аллели, определяющие устойчивость КРС к лейкозу (Удина И.Г., 2001).
После выявления животных с ценными генотипами нами будет рекомендован подбор родительских пар, сочетание генотипов которых в
будущем, возможно, даст начало принципиально новым линиям крупного рогатого скота красной степной и черно-пестрой пород, которые будут одновременно устойчивы к персистентному лимфоцитозу и обладать не только высокой молочной продуктивностью, но и высокой белковомолочностью.
Литература
1. Бурба, Л.Г. Лейкозы и злокачественные опухоли животных /Л.Г. Бурба, А.Ф. Вахилов, В.А. Горбатов. - 1988.
2. Калашникова, Л.А. Селекция 21 века: использование ДНК - технологий.
/Л.А.Калашникова, И.М.Дудин, В.И. Глазко. - 2001.
3. Калашникова, Л.А. ДНК - технологии оценки сельскохозяйственных животных /Л.А. Калашникова, И.М. Дудин, В.И. Глазко, Н.В. Рыжова, Е.П. Голубина. - 1999.
4. Кузнецова, Н.В. Радикально-термический способ лечения домашних животных с опухолями /Н.В.Кузнецова, Н.В.Кузнецов, Г.А. Симонян //Ветеринария, 1997. -№ 5.
5. Удина, И.Г. ДНК -технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных /И.Г. Удина. - 2001.
