CC BY
56
HayKOBHH BicHHK .HHyBMET iMeHi C.3. I^H^Koro, 2017, t 19, № 77
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^oHaibHoro ymBepcnreTy BeTepHHapHoi' MeguuHHH
Ta 6ioTexHonoriH iMeHi C.3. I^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet7736
ISSN 2518-7554 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 61:575.1.577.21[543.054:543.635.28]
Використання молекулярно-бтлопчних методiв дослiджень у прикладних
галузях ветеринарних наук
Б.1. Назар1, С.Д. Мурська1, Д.Ф. Гуфрiй2, Б.В. Гутий2 [email protected]
1Державний науково-до^дний контрольний тститут ветеринарних препаратiв та кормових добавок,
вул. Донецька, 11, м. Львiв, 79019, Укра'та;
2Львiвський нацюнальний унiверситет ветеринарног медицини та бютехнологт iменi С.З. Гжицького,
вул. Пекарська, 50, м. Львiв, 79010, Украна
У статт1 висвгтлено тформацгю про використання невеликог кглькостг молекулярних методгв дослгдження в прикладних галузях ветеринарних наук. Також розглянуто основнг пгдходи та напрямки в роботг сектору молекулярно-бюлоггчних дослгджень ДНДК1 ветпрепарат1в та кормових добавок. Об'ектами дослгджень молекулярной бгологи являються конкрет-т макромолекули - насамперед бглки та нуклегновг кислоти, найпростгшг форми живого - гзольованг клтини, ядра, орга-ногди клтин, хромосоми, вгруси та бактерп. Застосування генног технологи для анал1зу якостг харчових продуктгв для людей та кормгв для тварин зумовлено потребою в чутливому, швидкому та точному методг. Поширеним е використання методу ПЛР для тдикацй та гдентифжацп збудникгв харчових токсикогнфекцт. На основг ПЛР розроблено методи для аналгзу продуктгв, що виготовлеш за використання трансгенних мгкрооргашзмгв. Актуальним використанням ПЛР е визначення антибготико-резистентностг клгшчних штамгв збудникгв тфекцшних захворювань, створення можливостг кглькгсного облгку резуль-тат1в для контролю динамгки тфекцшного процесу, правильного вибору тактики лгкування г оцтки ефективностг за-стосовуваних лгкувальних засобгв. Важливим напрямом використання ДНК-технологш е виявлення продуктгв, отриманих тсля використання генно-тженерних методгв. Таким чином, за допомогою молекулярно-бгологгчних методгв дослгджень сектор молекулярно-бгологгчних дослгджень може виконувати таю завдання: виявлення, гдентифгкацгя та кглькгсне визначення вмгсту генетично модифгкованих оргатзмгв; гдентифгкацгя видовог приналежностг бглкгв тваринного похо-дження в премгксах, кормових добавках та кормах для тварин; проведення монторингових дослгджень вмгсту генетично модифгкованих оргатзмгв та ДНК жуйних в премгксах, кормових добавках та кормах для тварин зггдно зг щоргчним Планом монторингу кормгв, кормових добавок та премгксгв; в перспективг дгагностування тфекцшних (бактерш) та пара-зитарних збудникгв у сгльськогосподарських тварин та визначення антибготикорезистентностг клгшчних штамгв збудникгв тфекцшних захворювань.
Ключовi слова: молекулярнг методи дослгджень, метод ПЛР, видова диференцгацгя бглкгв тваринного походження, генетично модифгкованг оргашзми, трансгеннг мгкрооргатзми.
Использование молекулярно-биологических методов исследования в прикладных областях ветеринарных наук
Б.И. Назар1, С.Д. Мурська1, Д.Ф. Гуфрий2, Б.В. Гутый2 [email protected]
'Государственный научно-исследовательский контрольный институт ветеринарных препаратов и кормовых добавок, ул. Донецкая, 11, г. Львов, 79019, Украина
2Львовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий имени С.З. Гжицкого,
ул. Пекарская, 50, г. Львов, 79010, Украина
Citation:
Nazar, B., Murska, S., Gufrij, D., Gutyj, B. (2017). The use of molecular biological research methods in applied fields of veterinary science. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 19(77), 166-169.
В статье освещено информацию об использовании небольшого количества молекулярных методов исследования в прикладных областях ветеринарных наук. Также рассмотрены основные подходы и направления в работе сектора молекуляр-но-биологических исследований ГНИКИ ветпрепаратов и кормовых добавок. Объектами исследований молекулярной биологии являются конкретные макромолекулы - в первую очередь белки и нуклеиновые кислоты, простые формы живого -изолированные клетки, ядра, органоиды клеток, хромосомы, вирусы и бактерии. Применение генной технологии для анализа качества пищевых продуктов для людей и кормов для животных обусловлено потребностью в чувствительном, быстром и точном методе. Распространенным является использование метода ПЦР для индикации и идентификации возбудителей пищевых токсикоинфекций. На основе ПЦР разработаны методы для анализа продуктов, изготовленных за использование трансгенных микроорганизмов. Актуальным использованием ПЦР является определение антибиотикорезистент-ности клинических штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, создание возможности количественного учета результатов для контроля динамики инфекционного процесса, верного выбора тактики лечения и оценки эффективности применяемых лекарственных средств. Важным направлением использования ДНК-технологий является выявление продуктов, полученных после использования генно-инженерных методов. Таким образом, с помощью молекулярно-биологических методов исследований сектор молекулярно-биологических исследований может выполнять следующие задачи: выявление, идентификация и количественное определение содержания генетически модифицированных организмов; идентификация видовой принадлежности белков животного происхождения в премиксах, кормовых добавках и кормах для животных; проведения мониторинговых исследований содержания генетически модифицированных организмов и ДНК жвачных в премиксах, кормовых добавках и кормах для животных согласно ежегодного Плана мониторинга кормов, кормовых добавок и премиксов; в перспективе диагностирования инфекционных (бактерий) и паразитарных возбудителей в сельскохозяйственных животных и определения антибиотикорезистентности клинических штаммов возбудителей инфекционных заболеваний.
Ключевые слова: молекулярные методы исследований, метод ПЦР, видовая дифференциация белков животного происхождения, генетически модифицированные организмы, трансгенные микроорганизмы.
The use of molecular biological research methods in applied fields
of veterinary science
B. Nazar2, S. Murska1, D. Gufrij2, B. Gutyj2 [email protected]
'State Research Control Institute of Veterinary Preparations and Feed Additives Donetsk str., 11, Lviv, 79019, Ukraine;
2Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
Pekarska str., 50, Lviv, 79010, Ukraine
The article deals with the information on the use of small amounts of molecular research methods in applied fields of veterinary science. Is also considered the main approaches and directions in the sector work ofmolecular biological research GNIKI of veterinary medicines and feed additives. The objects of researches of molecular biology are specific macromolecule - especially proteins and nucleic acids, the simplest form of living - isolated cell nucleus, organelles of cells, chromosomes, viruses and bacteria. The use of gene technology to analyze food quality for people and feeding stuffs for animal is due to the need for sensitive, rapid and accurate method. Using the PCR method is common for indication and identification of the causative agents of food poisoning. Based on the PCR it was developed methods for analyzing the products, which were made for the use of transgenic microorganisms. The actual use of the PCR is the determination of clinical strains antibiotic resistance of infectious diseases, creating the possibility of quantifying results account to control the dynamics infectious process, the correct choice of treatment and evaluating the effectiveness of used medicines. An important direction of the application of DNA technology is to identify products obtained after using genetic engineering techniques. Thereby, by means of molecular biological research methods the sector of molecular biological studies can perform the following tasks: detection, identification and quantification of the content of genetically modified organisms; identification of plant species of animal protein in premixes, fodder additives and animal feed; conducting monitoring investigations the content of genetically modified organisms and ruminant DNA in premixes, feed additives and animal nutrition according to an annual monitoring plan of feed, feed additives and premixes; in the future diagnosing infectious (bacteria) and parasitic exciter in farm animals and determination of antibiotic resistance in clinical strains of infectious diseases.
Key words: molecular research methods, PCR, species differentiation of animal protein, genetically modified organisms, trans-genic microorganisms.
Вступ
Молекулярш методи дослвджень набувають дедалi бшьшо! популярносп у прикладних галузях ветерина-рних наук (Ashmarin, 1977; Osterman, 2002). Низка дисциплш аграрного профшю, так як селекщя, мж-робюлопя, вiрусологiя, ешзоотолопя, ветеринарно-саштарна експертиза, клшчна дiагностика та ш. вже не можуть обходитись без молекулярного «пвдтвер-дження» сво!х розробок i технологш.
Сьогодш можна видшити кшька основних напря-мiв у розробленш аграрних ДНК-технологш:
- дослщження геному сшьськогосподарських тва-рин на наявшсть продуктивних якостей для виршен-ня селекцшних проблем (MAS - marker assisted selection - селекщя за допомогою маркерiв);
- виявлення генетичних захворювань на раншх стащях розвитку;
- д1агностика шфекцшних захворювань альсько-господарських тварин i проведення ешзоотолопчного мониторингу;
- генетична «дактилоскошя» органiзмiв, створення генетичних паспортiв пород, видiв, таксономiчних груп;
- визначення стал ембрiонiв;
- контроль якостi альськогосподарсько! сировини i продуктiв харчування.
Деяш i3 наведених напрямiв не лише достатньою мiрою розроблено, а й упроваджено в практику аграр-них технологш, iншi - перебувають на стади науково! розробки i апробаци.
Результати та ix обговорення
На початку 2017 року в ДНДК1 ветпрепарапв та кормових добавок створено сектор молекулярно-бiологiчних дослОджень. Об'ектами дослОджень моле-кулярно! бюлогп е конкретнi макромолекули - насам-перед бшки та нукле!новО кислоти, найпростiшi фор-ми живого - iзольованi клiтини, ядра, органо!ди кль тин, хромосоми, вiруси та бактерп.
Застосування генно! технологи для аналiзу якосл харчових продуктiв для людей та кормiв для тварин зумовлено потребою в чутливому, швидкому та точному методь Поширеним е використання методу ПЛР для Ондикацп та щентифжацп збудник1в харчових токсикоiнфекцiй. Традицшш мiкробiологiчнi подходи до виявлення та щентифжаци бактерiй у харчових продуктах потребують гомогешзацп зразк1в у спеща-льному буферi, шкубацп культури на селективному та диференцшвальному середовищах, дослщження ко-лонiй мiкроскопiчними, бiохiмiчними чи iмунологiч-ними методами, тобто вимагають значних витрат часу (2-5 дiб). За використання ДНК-технологш результати можуть бути отримаш упродовж 1-2 днiв. Ниш вже вщпрацьовано методи виявлення сальмонели, кишково! палички, л1стери. У рядi кра!н (США, Шме-ччина, Франщя) цi методи е офiцiйними методами у дослОдженнях харчових продуктiв.
Вщносно новим напрямом використання ДНК-технологш у практицi тваринництва е видова дифере-нцiацiя бiлкiв тваринного походження у харчових продуктах i кормах, яш поддавались термiчнiй оброб-щ. Значення цього напряму суттево зросло у зв'язку з виявленням прюнних захворювань у сшьськогоспо-дарських та домашшх тварин.
Складнiсть визначення видово! приналежностi бь лка полягае в тому, що корми, як1 поддавались термОч-нiй обробцi (м'ясо-к1сткове борошно, рибне борошно, гранульованi комбiкорми, сухi i консервованi корми для копв i собак), мiстять денатурованi бшки, що повшстю втратили видову специфiчнiсть. Такi методи, як iмунодифузiя у гел1, iзоелектричне фокусуван-ня, що використовують для видово! вдентифшацп сирого м'яса, у цьому випадку непридатнi. Використання Р1Д не дае змоги визначити видову належшсть бшшв тваринного походження уже шсля термОчно! обробки за 80 °С протягом 30 хв. Тимчасом за допо-могою молекулярно-генетичних методiв, зокрема ПЛР, можна виявити 1% свинини, яка тддавалась
термiчнiй обробцi за температури 120 °С протягом 10 хвилин пiсля 30 циклiв амплОфОкацп i 0,1% - через 35.
Ниш розроблено тест-систему для визначення видово! приналежносп м'ясних iнгредiентiв у кормах i рибному борошш методом ПЛР, яка дае змогу виявити домшки м'ясного борошна з масовою часткою 0,1% у складi рибного борошна, визначити видову приналежшсть тканин жуйних тварин у комбжормах для сiльськогосподарських тварин i птицi, сухих i консервованих кормах для домашшх тварин, сирих м'ясних продуктах i продуктах, яш поддавались куль нарнiй обробщ.
На основО ПЛР розроблено методи для анал1зу продуктОв, що виготовлеш за використання трансген-них мжрооргашзмОв. Вже вщпрацьовано методи виявлення генетично модифшовано! культури Lactobacillus curvatus, яку використовують у складО закваски для ферментаци у ковбасному виробнищга, та культури Streptococcus thermophilus, яку використовують у складО закваски шд час виробництва йогурпв.
Сфера застосування ДНК-технологш у рослинниц-твО така ж широка, як i для сшьськогосподарських тварин. Ниш видОляють так основш напрями використання ПЛР у генетико-селекцшних дослщженнях:
- визначення фшогенетичних зв'язк1в мОж дикими та культурними видами рослин;
- класифжацОя селекцшного матерОалу;
- щентифжащя генотишв;
- маркування стшкосп до хвороб i шкодников;
- картування геному;
- аналОз якосп продукпв рослинного походження.
Важливим напрямом використання ДНК-технологш е виявлення продукпв, отриманих шсля використання генно -шженерних методОв. Найбшьшою мОрою це стосуеться продукпв рослинного походження, оскшьки отримання трансгенних тварин, незва-жаючи на майже 20-рОчний досвОд людства у !х конс-труюванш, залишаеться високоварпсною процедурою. Загалом генетично модифшованими були приб-лизно 70 рОзних видОв рослин. Це сприяе зменшенню на 25% внесения гербщидОв, на 5-10% - шдвищенню врожайносл культур. Хоча конкретних прикладОв серйозно! еколопчно! небезпеки трансгенних сорпв i пбридОв у природному середовищО не виявлено, !х потенцшна небезпека очевидна. Прогнози будуються наразО не на фактичних даних, а на основО загальнобь олопчних закономОрностей.
ХарчовО продукти, виготовлеш за використання генно-шженерних шдходОв, подОляються на 3 категорп:
1) харчовО продукти та харчовО шгредОенти, яш мютять в собО генетично модифшоваш оргашзми;
2) харчовО продукти та харчовО шгредОенти, виготовлеш Оз ГМО;
3) харчовО добавки чи ферменти, виготовлеш з допомогою генних технологш. Вщповвдно до вимог Свропейських правил, таш продукти повинш мати спещальне маркування.
Простота, велика чутливОсть, висока вОдтворюва-шсть сприяли швидкому перетворенню методу поль меразно! ланцюгово! реакци в один Оз найбОльш зруч-
HayKOBHH BicHHK .HHyBMET iMeHi C.3. f^HutKoro, 2017, t 19, № 77
hhx i nepcneKTHBHHx gna giaraocTyBaHHa iH^eKniHHHx Ta napa3HTapHux 36ygHHKiB y cinbcbKorocnogapcbKHx TBapHH. nepenix 6aKTepin i napa3HTapHHx 36ygHHKiB, gna BHaBneHHa axux y^e roTOBi n.HP-Ha6opH hh KOMno-HeHTH go TaKHx Ha6opiB, HHHi 3HaHHHH. ®axiBnaMH BeTepHHapHoi' MegunHHH po3po6neHo Tecr-cucTeMH gna giarHocTHKH BenHKoi' KinbKocri 3axBopMBaHb cepeg hhx TaKi aK KaMnino6aKTepio3, xnaMigio3, Toxconna3Mo3 TBapHH, canbMoHenbo3, cTa$inoKoxo3, Mixonna3Mo3 Ta iHmi.
AKTyanbHHM BHKopucTaHHaM nHP e BH3HaneHHa aH-Tu6ioTHKope3HcTeHTHocTi KnrniHHHx mTaMiB 36ygHHKiB iH^eKuinHHx 3axBopMBaHb, cTBopeHHa Mo^gHBocTi KinbKicHoro o6niKy pe3ynbTaTiB gna Komponro gHHaMiKH iH^eKuinHoro nponecy, npaBHnbHoro BH6opy TaKTHKH niKyBaHHa i oniHKH e^eKTHBHocri 3acrocoByBaHHx nixy-BanbHHx 3aco6iB.
BlICIIOBK'll
TaKHM hhhom, 3a gonoMorow MonexynapHo-6ionoriHHHx MeTogiB gocnig^eHb ceKTop MonexynapHo-6ionoriHHHx gocnig^eHb Mo^e BHKoHyBaTH Taxi 3aBgaH-Ha:
- BuaBneHHa, igeHTH^ixania Ta KinbKicHe BH3HaneHHa BMicTy reHeTHHHo Mogu^ixoBaHHx opraHi3MiB (rMO).
- IgeHTH^iKaqia BHgoBoi' npHHane^Hocri 6inKiB TBapHHHoro noxog^eHHa b npeMiKcax, kopmobhx go6aBKax Ta KopMax gna TBapHH.
- npoBegeHHa MoHiTopHHroBHx gocnig^eHb BMicTy reHeTHHHo Mogu^ixoBaHHx opraHi3MiB (rMO) Ta AHK
^yHHHx b npeMiKcax, kopmobhx go6aBKax Ta KopMax gga TBapHH 3rigHo 3i mopinHHM ngaHoM MomTopHHiy KopMiB, kopmobhx go6aBoK Ta npeMiKciB.
- Bagiga^a Ta Bepu^iKama MeTogiB ga6opaTopHux gocgig^eHb BignoBigHo go pimeHHa eBponencbKoi KoMicii' 657/2002 Ta rnmux Ha^oHagbHux i Mi^HapogHux BHMor.
- Po3po6Ka Ta BugaHHa HayKoBHx Ta HayKoBo-MeToguHHHx пpaцb.
- y^acTb y payHgax npo^ecinHoro TecTyBaHHa aK Ha Mi^HapogHoMy piBHi - FAPAS, TaK i Ha
Ha^oHagbHoMy piBHi.
- npoBegeHHa ap6rrpa®HHx gocgig^eHb Ha BH3HaneHHa rMO Ta AHK TBapuHHoro noxog^eHHa.
- B nepcneKTHBi giarHocTyBaHHa iH^eK^HHux (6aKTepin) Ta napa3HTapHux 36ygHHKiB y cigbcbKorocnogapcbKux TBapHH Ta BH3HaneHHa aHTH6ioTHKope3ucTeHTHocTi KgirnnHux mTaMiB 36ygHHKiB iH^eK^HHux 3axBoproBaHb.
EiS^iorpa^inm iIOCII. lanim
Ashmarin, I.P. (1977). Molekuljarnaja biologija. Izdatel's-tvo Leningradskogo Universiteta. Leningrad (in Russian).
Osterman, L.A. (2002). Metody issledovanija belkov i
nukleinovyh kislot. M.: MCNMO (in Russian). PCR technology: principle and applications for DNA amplification; ed. H.Erlich. New York: W.H. Freeman and Company, 1992.
Cmammn nadiumm do peda^ii 30.03.2017
