CC BY
127
УДК 615.32:54
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ШШ/ГОГЖ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПОНЕНТОВ ЖИРНЫХ МАСЕЛ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Белгородский
государственный
национальный
исследовательский
университет
О.О. НОВИКОВ Д.И. ПИСАРЕВ О.А. ВАНХИН
В статье представлены результаты изучения липофильных компонентов жирных масел, а именно триглицеридов и каротиноидов методом МЛЬБІ/ТОЕ/МЯ. В результате авторами установлено, что используя метод МЛЬБІ/ТОЕ/МЯ можно получить объём информации, позволяющий сделать объективный вывод о составе жирных масел и каротиноидов жирных масел. Кроме того, с помощью МЛЬБІ/ТОЕ/МЯ удалось проконтролировать результаты гидролиза триглицеридов и определить состав жирных кислот, формирующих жирные масла.
Ключевые слова: жирные масла, триацилглицериды, каротинои-е-таіі:потког@Ьяи.е^.ги ды, МЛЬБІ/ТО¥/МЯ.
Липиды формируют вместе с углеводами и белками главную массу органических веществ живой материи. Они присутствуют в организмах различного происхождения: растительных, животных, бактериальных. В высокой концентрации липиды (особенно фосфолипиды) обнаружены в различных органах животных и человека: головном и спинном мозге, крови, печени, сердце. Особенно велико содержание липидов в нервных тканях (20-25%). Липиды входят в состав всех структурных элементов клетки, в первую очередь, клеточных мембран и мембран субклеточных частиц. С участием липидов протекают такие важнейшие биохимические процессы, как передача нервного импульса, активный перенос через мембраны, транспорт жиров в плазме крови, синтез белка и другие ферментативные процессы, особенно связанные с цепью переноса электронов и окислительным фосфорилированием [1].
Растительные масла являются одними из наиболее часто употребляемых продуктов в пищевом рационе. Известно, что потребление растительных масел оказывает огромное влияние на физиологию человека, в том числе на липидный обмен, развитие хронических заболеваний и общее здоровье.
Жиры растительного происхождения являются источником эссенциальных жирных кислот. К эссенциальным относят линолевую, линоленовую, арахидоновую и некоторые другие полиненасыщенные жирные кислоты.
Из гамма-линоленовой и линолевой кислот образуются эйкозапентаеновая и деказагек-саеновая кислоты. Эти кислоты участвуют в регуляции метаболических процессов, синтезе про-стагландинов, в построении клеточных мембран. Они способствуют образованию митохондрий в клетках, понижают уровень холестерина и триглицеридов, уменьшают риск тромбообразова-ния, нормализуют работу желез внутренней секреции, регулируют менструальный цикл, помогают при климаксе, оказывают противовоспалительное действие, снижают артериальное давление [1, 3].
При отсутствии или недостатке таких кислот в организме холестерин образует с насыщенными жирными кислотами сложные эфиры, очень трудно окисляющиеся при обмене веществ. Вследствие химической стойкости они накапливаются в крови и откладываются на стенках артерий. При достаточном количестве эссенциальных жирных кислот в организме они образуют с холестерином сложные эфиры, которые при обмене веществ окисляются до низкомолекулярных соединений и легко выводятся из организма.
Для анализа триацилглицеридов применяются различные методы. Классические хроматографические методы являются наиболее часто используемыми. В их числе ГЖХ, ВЭЖХ, ТСХ и сверхкритическая жидкостная хроматография. Но, несмотря на их широкое распространение, они имеют ряд недостатков. Например, трудности с элюированием триацилглицеридов из колонок ВЭЖХ и ГЖХ, факторы отклика детектора, необходимые особенно для количественной оценки. Таким образом, для достижения полной аналитической картины используются сочетания хроматографических методов, требующих длительной пробоподготовки и собственно хроматографирования. Кроме того, эти виды анализа не позволяют выявить фактические триацилглицериды, а только общий процент индивидуальных жирных кислот. В этих методах определяются не сами жирные масла, а их метиловые эфиры, поскольку они менее по-
лярны, чем соответствующие жирные кислоты, и поэтому лучше совместимы с различными хроматографическими системами.
При анализе «профиля липидов» масел достаточно широко используются как газовая хроматография (ГХ), так и жидкостная - ВЭЖХ [4, 9]. Разделение липидов методом ВЭЖХ можно проводить и без предварительной пробоподготовки и омыления липидов, используя вариант с обращенными фазами (ОФ ВЭЖХ) и неполярным растворителем. Единственным затруднением этого метода является то, что для идентификации пиков приходится использовать неселективные детекторы, в частности, испарительный детектор светорассеяния (ELSD). Такой детектор не обладает линейностью отклика, и с целью устранения этого недостатка используются добавки в образец холестерина, образующего молекулярные ассоциаты с триглицеридами, а также нитрата серебра для повышения чувствительности анализа [7].
Известно и применение масс-спектрометрических детекторов с той же целью. Например, в работе [8] исследован состав липидов рисового масла комплексной жидкостной хроматографией, включающей различные механизмы разделения (взаимодействие с ионом серебра и неводную ОФ ВЭЖХ). В качестве детектора использовался масс-спектрометр с химической ионизацией при атмосферном давлении (APCI/MS).
Установлено, что MALDI/TOF/MS можно использовать в анализе жирных кислот. Количественный анализ жирных кислот из пяти триацилглицеролов кокосового, пальмового масел, сала и масла какао проводился с использованием двух методов анализа: MALDI/TOF/MS и газовой хроматографии. Для газохроматографического анализа было использовано метилирование продуктов, в то время как для MALDI/TOF/MS анализа применяли омыление. При MALDI/TOF/MS условиях кислоты были обнаружены как аддукты с ионом натрия [RCOONa Na +](+). Количественным анализом газовой хроматографией соответствующих метиловых эфиров триацилглицеридов получены данные, которые коррелировали с MALDI/TOF/MS данными. Кроме того, способность MALDI/TOF/MS для обнаружения низких концентраций жирных кислот делает ее более чувствительной, чем классическая газовая хроматография [5].
Затруднения при исследовании состава жирных кислот методом ГХ вызваны тем обстоятельством, что последние плохо разделяются на капиллярных колонках с неполярной неподвижной фазой. Наибольшими возможностями по разделению ненасыщенных жирных кислот обладают углеграфитовые колонки [6].
Другой важной группой липидов являются каротиноиды. Из всех классов природных пигментов каротиноиды, по-видимому, наиболее широко распространены и, несомненно, принадлежат к числу наиболее важных соединений. Они обнаружены у всех представителей растительного царства, а также часто встречаются у микроорганизмов. Каротиноиды и их производные имеют большое значение для животных, поскольку являются основой зрительных пигментов, ответственных за восприятие света и различение цветов [2].
Для идентификации каротиноидов в растительном сырье используют физикохимические методы, в первую очередь, УФ-спектроскопию.
MALDI/TOF/MS первоначально использовался в основном для анализа белков и пептидов, синтетических полимеров и полисахаридов.
Таким образом, целью настоящего исследования является подтверждение использования метода MALDI/TOF/MS как легкого, быстрого и надежного способа идентификации триа-цилглицеридов и каротиноидов в растительных объектах.
Для установления возможности идентификации триацилглицеридов методом MALDI/TOF/MS использованы образцы широко используемых жирных масел облепихи крушиновидной - Hippophae rhamnoides, и шиповника - Rosa canina.
Указанные жирные масла в количестве по 0,5 д1 помещали в пробирки градуированные ёмкостью 1,5 мл, прибавляли по 1 мл смеси 0,1%-ного раствора кислоты трифторуксусной и ацетонитрила в соотношениях 7:1 и встряхивали на шейкере. Полученные растворы наносили на мишень «MTP 384 target plate matt steel TF» и после высыхания сверху наносили каплю матрицы - а-цианокоричной кислоты. После высушивания проб мишень помещали в масс-спектрометр и регистрировали масс-спектры испытуемых образцов в диапазоне 400-1200 Da. Молекулярные массы сложных эфиров глицерина и высших жирных кислот должны находиться в диапазоне 800-1000 Da/ а также каротиноидов, которыми богаты испытуемые масла. Ка-ротиноиды обнаруживаются в диапазоне 460-600 Da.
Полученные спектры представлены на рис. 1-2.
На представленных рисунках присутствуют пики молекулярных ионов в диапазоне от m/z = 901 до 907 Da, хотя молекулярные массы триацилглицеридов лежат в пределах 878-882 Da. Это свидетельствует о том, что анализируемые триацилглицериды находятся в виде аддуктов с ионом натрия.
Рис. 1. Масс-спектр облепихового масла в диапазоне
Рис. 2. Масс-спектр розового масла в диапазоне
Присутствие интенсивных пиков ионов с зарядами m/z = 536,515, соответствуют молекулярной массе изомерных форм каротинов (альфа, бета, гамма), пики молекулярных ионов с m/z = 568,219 и 599,575, отвечают кислородным производным каротинов - ксантофиллам.
По полученным молекулярным массам ионов проведена идентификация триацилгли-церидов, то есть установлено, остатками каких жирных кислот этерифицирован глицерин. Результаты идентификации представлены в табл. 1.
Таблица 1
Результаты идентификации ТАГ в исследуемых объектах
m/z Формула триацилглицерида Жирные кислоты, входящие в состав триацилглицерида Число атомов углерода и двойных связей
877 ЛПЛ Линолевая, пальмитиновая 55:5
901 ЛЛЛ Линолевая 57:6
903 ЛОЛ Линолевая, олеиновая 57:5
905 ООЛ Олеиновая, линолевая 57:4
907 ООО Олеиновая 57:3
Л - линолевая кислота (18:2), О - олеиновая кислота (18:1), П - пальмитиновая кислота (16:0). Полученные данные свидетельствуют о присутствии во всех изученных ТАГ остатков
ненасыщенных жирных кислот - линолевой и олеиновой.
Чтобы установить состав жирных масел в проанализированных извлечениях, был проведён щелочной гидролиз триацилглицеридов. Продукты гидролиза подвергали масс-спектрометрированию. На полученных спектрах можно обнаружить присутствие жирных кислот в виде аддуктов с ионом натрия. Масс-спектрометрический профиль продуктов гидролиза во всех случаях оказался однотипным, поэтому на рис. 3 представлен унифицированный спектр жирных кислот, обнаруженных во всех образцах.
Состав жирных кислот, установленных в ходе масс-спектрометрического изучения, представлен в табл. 2.
Таблица 2
Результаты идентификации жирных кислот, полученных методом масс-спектрометрии
m/z Жирные кислоты, входящие в состав триацилглицерида Число атомов углерода и двойных связей
279 Пальмитиновая 16:0
301 Линоленовая 18:3
303 Линолевая 18:2
305 Олеиновая 18:1
335 Арахиновая 20:0
Согласно приведённым в табл. 2 результатам, во всех образцах установлено присутствие 5 жирных кислот как насыщенного ряда (пальмитиновая, арахиновая), так и ненасыщенного (олеиновая, линолевая, линоленовая).
Таким образом, в ходе настоящего исследования нами установлено, что, используя метод MALDI/TOF/MS, можно получить объём информации, позволяющий сделать объективный вывод о составе жирных масел и каротиноидов жирных масел. Кроме того, с помощью MALDI/TOF/MS удалось проконтролировать результаты гидролиза триглицеридов и определить состав жирных кислот, формирующих жирные масла.
Литература
1. Биохимия : учебник / Т. Л. Алейникова, Л. В. Авдеева, Л. Е. Андрианова [и др.] ; под ред. Е. С. Северина. - М. : ГЭОТАР-МЕД, 2003. - 784 с. - (XXI век).
2. Бриттон, Г. Биохимия природных пигментов / Г. Бриттон ; пер. с англ. В. Д. Цыдендамбаева ; под ред. М. Н. Запрометова. - М. : Мир, 1986. - 422 с.
3. Сравнительное экспериментальное изучение влияния масел семян ослинника, календулы, эхинацеи, лопуха на репаративные процессы в коже и слизистой оболочке желудка животных / А. И. Багинская, В. К. Колхир, Т. Е. Лескова [и др.] / / Сборник научных трудов / Рос. акад. с.-х. наук, Все-рос. науч.-исслед. ин-т лекарств. и аромат. растений (ВИЛАР) ; под общ. ред. В. А. Быкова. - М., 2006. -
Т. 17 : Химия, технология, медицина : материалы междунар. конф., посвящ. 75-летию образования Всерос. науч.-исслед. ин-та лекарств. и аромат. растений. - С. 437-443.
4. Buchgraber, M. Cluster Analysis for the Systematic Grouping of Genuine Cocoa Butter and Cocoa Butter Equivalent Samples Based on Triglyceride Patterns / M. Buchgraber, F. Ulberth, E. Anklam // J. Agric. Food Chemi. - 2004. - Vol. 52, № 12. - P. 3855-3860.
5. Comparative quantitative fatty acid analysis of triacylglycerols using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry and gas chromatography / C. Hlongwane, I. G. Delves, L. W. Wan [et al.] / / Rapid. Commun. Mass. Spectrom. - 2001. - Vol. 15, № 21. - P. 2027-2034.
6. Gaudin, K. Retention behavior of unsaturated fatty acid methyl esters on porous graphitic carbon / K. Gaudin, P. Chaminade, A. Baillet // J. Sep. Sci. - 2004. - Vol. 27, № 1-2. - P. 41-46.
7. Héron, S. Post-column addition as a method of controlling triacylglycerol response coefficient of an evaporative light scattering detector in liquid chromatography-evaporative light-scattering detection / S. Héron, M. Dreux, A. Tchapla // J. Chromatogr. A. - 2004. - Vol. 1035, № 2. - P. 221-225.
8. Silver-ion reversed-phase comprehensive two-dimensional liquid chromatography combined with mass spectrometric detection in lipidic food analysis / L. Mondelloa, P. Q. Tranchidaa, V. Stanekb [et al.] // J. Chromatogr. A. - 2005. - Vol. 1086, № 1-2. - P. 91-98.
9. Triacylglycerol profiling by using chromatographic techniques / M. Buchgraber, F. Ulberth, H. Emons [et al.] / / European Journal of Lipid Science and Technology. - 2004. - Vol. 106, № 9. - P. 621-648.
THE USE OF MALDI / TOF / MS FOR RESEARCH OF FATTY OILS COMPONENTS OF VEGETABLE ORIGIN
The article presents the results of a study of lipophilic components of fatty oils, namely triglycerides and carotenoids by MALDI / TOF / MS. As a result, the authors found that the method using MALDI / TOF / MS can get the amount of information that allows you to draw objective conclusions about the composition of fatty oils, fatty oils and carotenoids. Fur-
thermore, using MALDI / TOF / MS results under controlled hydrolysis of triglycerides and fatty acids to determine the composition , forming a fatty oil.
Key words : fatty oils, triacylglycerides , carotenoids , MALDI / TOF /
MS.
O.O. NOVIKOV D.I. PISAREV
Belgorod National Research University
e-mail:[email protected]
