CC BY
243
УДК 543.544
СОСТАВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И СТЕРОИДОВ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ
© В.В. Хасанов , Г.Л. Рыжова, К.А. Дычко, Т. Т. Куряева
Томский государственный университет, пр. Ленина, 36, Томск, 634050 (Россия) E-mail: [email protected]
Исследован состав входящих в триглицериды растительных масел насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, а также стероидов при помощи хромато-масс-спектрометрии. Показана возможность идентификации плохо разрешенных на неполярной капиллярной колонке пиков эфиров карбоновых кислот С18 разной степени ненасыщенности. Анализ состава стероидов позволяет определять источник жира, отличая растительные и животные жиры по содержанию холестерина. Наибольшим количественным изменениям в образцах подвержены минорные компоненты - карбоновые кислоты С 10-С 17.
Введение
Состав жирных кислот, входящих в триглицериды растительных масел, представляет интерес с точки зрения обнаружения различий между маслами разного происхождения.
При анализе «профиля липидов» масел достаточно широко используются как газовая хроматография (ГХ), так и жидкостная (ВЭЖХ). Разделение липидов в ВЭЖХ можно проводить и без предварительной пробоподготовки и омыления липидов, используя вариант с обращенными фазами (ОФ ВЭЖХ) и неполярным растворителем. Единственным затруднением этого метода является то, что для идентификации пиков приходится использовать неселективные детекторы, в частности, испарительный детектор светорассеяния (ELSD). Такой детектор не обладает линейностью отклика, и с целью устранения этого недостатка используются добавки в образец холестерина, образующего молекулярные ассоциаты с триглицеридами, а также нитрата серебра для повышения чувствительности анализа [1].
Известно и применение масс-спектрометрических детекторов с той же целью. Так, авторы [2] исследовали состав липидов рисового масла комплексной жидкостной хроматографией, включающей различные механизмы разделения (взаимодействие с ионом серебра и неводную ОФ ВЭЖХ). В качестве детектора использовался масс-спектрометр с химической ионизацией при атмосферном давлении (APCI-MS). Исследованиям липидов с помощью ВЭЖХ посвящено наибольшее число работ [3-5].
Затруднения при исследовании состава жирных кислот методом ГХ вызваны тем обстоятельством, что последние плохо разделяются на капиллярных колонках с неполярной неподвижной фазой (НФ). Для их разделения разработаны специальные полярные капиллярные колонки, однако и тут разделению мешают существенные количественные различия разных кислот в образцах, приводящие к маскировке пиков. Наибольшими возможностями по разделению ненасыщенных жирных кислот обладают углеграфитовые колонки [6]. Способы анализа жирнокислотного состава липидов жиров и масел по ГОСТу используют метод газовой хроматографии [7-8]. Развитие метода интерпретации хроматограмм при анализе жирных кислот методом ГХ описано в работе [9].
Экспериментальная часть
Подготовка образцов. В качестве образцов для исследований использованы пробы товарных растительных масел, выработанных из сои, кукурузы и подсолнечника. Для сравнения также были взяты образцы животного масла (коровье сливочное) и бутербродного маргарина «Мягкое масло».
* Автор, с которым следует вести переписку.
Образцы готовят для анализа в соответствии с указаниями ГОСТ Р 51486-99 [10].
В колбу вместимостью 100 см3 помещают навеску исследуемого образца масла массой 1 г и добавляют 10 мл 1% раствора метилата натрия в метаноле. Присоединяют к колбе обратный холодильник и нагревают до кипения на водяной бане в течение 15 мин. Затем в колбу добавляют 13 мл 1 М раствора серной кислоты в метаноле и нагревают еще 15 мин. После охлаждения колбы под струей воды в нее добавляют 25 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл и экстрагируют гексаном 2 раза по 10 мл. Объединенные экстракты промывают дистиллированной водой порциями по 7 мл до полного удаления кислоты по индикатору. Экстракт сушат фильтрованием через слой безводного сульфата натрия и используют для испытания.
Получение пробы для определения стероидов. Кипятят при нагревании 1 г пробы с 10 мл 0,5 н спиртового раствора гидроксида калия с обратным холодильником до полного омыления в течение часа. Затем добавляют 10 мл воды и нагревают до образования прозрачного раствора. После охлаждения все переносят в делительную воронку и извлекают неомыляемую часть петролейным эфиром два раза по 5 мл. Вытяжки объединяют и промывают 50%-ным спиртом, к которому прибавлено несколько капель раствора гидроксида калия, а затем, чтобы удалить следы перешедшего в петролейный эфир мыла, 50 % спиртом до тех пор, пока спирт не перестанет окрашивать фенолфталеин в красный цвет.
Условия анализа ГХ/МС. Разделение и идентификацию компонентов проводили на системе хромато-масс-спектрометрии фирмы Agilent, состоящей из газового хроматографа НР 6890 Plus и масс-спектрального детектора MSD 5973N.
Условия хроматографического разделения: колонка капиллярная DB-5ms (5% дифенил и 95% диметил-полисилоксан, толщина фазы 0,25 мкм) размером 30 м х 0,25 мм. Начальная температура термостата колонки - 40 °С; выдержка при начальной температуре - 1 мин; программирование температуры - от 40 до 210 °С со скоростью 15 °С/мин, от 210 до 280 °С со скоростью 5 °С/мин. Выдержка при конечной температуре -20 мин. Газ-носитель-гелий, 1 смз/мин (постоянный расход). Проба 0,2 мкл без деления потока (лайнер НР 5062-3587 splitless), испаритель - 280 °С. Температура испарителя и интерфейса детектора - 280 °С.
Идентификация соединений осуществлялась вручную, сравнением масс-спектров соединений с библиотечными (Wiley275 и NIST98) масс-спектрами. Степень совпадения масс-спектров указана в таблице 2 в графе МС, %.
Обсуждение результатов
Как уже отмечалось, достичь удовлетворительного разделения метиловых эфиров ненасыщенных кислот С18 с 1-3 кратными связями невозможно на обычной капиллярной колонке с неполярной привитой фазой. Типичная хроматограмма метиловых эфиров приведена на рисунке 1. Метиловые эфиры ненасыщенных кислот С18 выходят в промежутке времени 15,85-16,20 мин, и их разрешение на хроматограмме по полному ионному току (ПИТ) неудовлетворительно (рис. 2). Совсем иная картина наблюдается на переработанной хроматограмме, построенной по ионам, соответствующим молекулярным пикам, представленным на рисунке 3. На ней количество каждого изомера может быть легко определено интегрированием. Регистрация по иону с m/z=294 дает три максимума, соответствующих, вероятно, цис-транс изомерам линолевой (С 18:2) кислоты.
Количественные данные по содержанию компонентов получены, исходя из площадей пиков на хроматограмме по молекулярным ионам. Масс-спектры эфиров карбоновых кислот имеют достаточно интенсивные пики молекулярных ионов (15-20%), достаточные как для обнаружения соответствующих соединений в режиме селективного мониторинга (SIM), так и для количественного определения отдельных соединений в условиях недостаточного разрешения на хроматограмме по ПИТ. Так, масс-спектры метиловых эфиров стеариновой (С18:0), олеиновой (С18:1), линолевой (С18:2) и линоленовой (С18:3) кислот имеют молекулярные ионы с соотношением m/z=298, 296, 294 и 292 соответственно (рис. 4 А-Г). Площади пиков, построенных по молекулярным ионам, корректируются в соответствии с их относительной интенсивностью в масс-спектрах, полученных на приборе при той же калибровке масс-анализатора. В качестве стандартного соединения используется эфир стеариновой кислоты.
Результаты состава жирных кислот липидов растительных масел, а также масла, изготовленного на основе коровьего, и искусственного «мягкого масла» приведены в таблице 1.
Таким образом, состав жирных кислот включает соединения от декановой до тетракозановой кислот. Можно заметить, что масла растительного происхождения (образцы 3-5) практически не содержат в остатках триглицеридов жирных кислот с числом атомов углерода менее 16. Основную долю кислот составляют ненасыщенные олеиновая (С18:1) и линолевая (С18:2). А вот линоленовую кислоту (С18:3) удалось обнаружить в незначительных количествах лишь в соевом масле (обр. 3). Доля диеновых кислот С18:2 примерно в 1,5 раза превышает долю олеиновой кислоты С18:1. В образцах твердых жиров (обр. 1-2) это соотношение меняется на противоположное. Кроме того, сумма ненасыщенных кислот С18 в твердых жирах примерно вдвое меньше, но одновременно вырастает доля насыщенных кислот С12, С14 и С16.
Состав искусственной смеси жиров (обр. 1), продающейся под названием «мягкое масло», не повторяет ни один из рассмотренных ранее образцов. Поскольку в его составе не было обнаружено холестерина, являющегося непременным компонентом животного жира, «мягкое масло», вероятно, не содержит даже примеси животных жиров. Состав его жирных кислот напоминает растительные жиры. Искусственное масло, вероятно, представляет собой смесь маргарина и растительного масла. Остается только неясным источник кислот С 10-С 15 в «мягком масле». Кислоты с нечетным числом атомов углерода С13 и С15 в жирах естественного происхождения не обнаруживаются в столь заметных концентрациях.
Состав стероидов в исследуемых образцах приведен в таблице 2.
15,80 16,00 16,20
Рис. 1. Типичная хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот по полному ионному току (ПИТ)
Рис. 2. Фрагмент хроматограммы по ПИТ. Разрешение пиков метиловых эфиров жирных кислот С18 низкое
Рис. 4 (А-Г). Масс-спектры метиловых эфиров жирных кислот С18:0 (А), С18:1 (Б), С18:2 (В) и С18:3 (Г). Таблица 1. Состав жирных кислот масел
Наименование
Содержание, в % от суммы всех
образец
1 2 3 4 5
С10 0,09 0,99 0 0 0
С12 2,32 9,53 0 0 0
С13 0,28 0 0 0 0
С14 1,56 4,63 0,04 0,00 0,07
С15 0,47 0 0 0 0
С16:1 0,07 0,15 0,11 0,17 0,14
С16 14,60 20,55 12,93 13,77 8,42
С17 0,07 0,07 0,1 0,10 0,07
С18:2 30,00 16,39 47,13 45,05 54,51
С18:1 41,11 27,9 29,65 31,78 25,09
С18:3 0,00 0 0,56 0,00 0,00
С18 8,11 6,08 6,07 3,42 6,83
С20:1 0,22 0,14 0,4 0,50 0,28
С20 0,39 0,25 0,51 0,73 0,45
С22 0,40 0,16 0,66 0,26 1,26
С24 0,08 0,05 0,19 0,24 0,37
Примечание. Заявленные производителем торговые названия образцов: 1 - искусственный жир под названием «мягкое масло»; 2 - масло коровье сорта «Крестьянское»; 3 - соевое масло; 4 - кукурузное масло; 5 - подсолнечное масло. Все образцы растительных масел обозначены производителями как рафинированные и дезодорированные.
Таблица 2. Состав стероидов исследованных масел
Содержание, (% от суммы стероидов)
№ Ковач Наименование образец МС,%
3 5 4 2 1
1 2596 Холест-5-ен-3-ол (холестерин) - — — S0,7 — 99
2 2632 Эргост-5-ен-3-ол (24-метилхолестерин) 16,3 13,1 13,1 — 19,9 99
3 26S7 Стигмаста-5,22-диен-3-ол (бета-стигмастерин) 12,1 4,S 5,7 — 19,9 90
4 2706 4,14-диметил-Эргоста-5,24(2S)диен-3-ол (обтусифолиол) - 9,S 2,5 — — 91
5 2731 Стигмаст-5-ен-3-ол (гамма-ситостерин, фукостерин) 41,7 45,S 54,S — 57,5 99
6 2759 Стигмаст-8(14)-ен-3-ол 3,1 9,7 — — — 91
7 2S16 9,19-циклоланост-24-ен-3-ол (циклоартенол) — — 5,1 — — 95
S 2S36 24-метилен-9,19-циклоланостан-3-ол (метиленциклоартанол) 2,5 7,2 7,3 — 1,5 93
9 2S41 4-метил-стигмаста-7,24(2S)-диен-3-ол (цитростадиенол) 5,9 11,0 — — 2,0 95
10 330S Токоферол- ацетат — — — 3,4 — 90
Холестерин, таким образом, можно обнаружить только в жирах животного происхождения (обр. 2). В продуктах на основе коровьего масла холестерин обнаруживается в подавляющих концентрациях. Кроме холестерина в образце обнаруживается ацетат токоферола. Растительные жиры не содержат даже следов холестерина, однако там имеется целый ряд родственных стероидов. Обращает на себя внимание близкий состав стероидов растительных масел и образца «мягкого масла».
Выводы
Для исследования трудноразделяемых в условиях ГХ изомеров эфиров карбоновых кислот С18 с разной степенью ненасыщенности была использована наиболее широко применяемая колонка с неполярной привитой фазой и режим детектирования по пикам молекулярных ионов.
Список литературы
1. Heron S., Dreux M., Tchapla A. Post-column addition as a method of controlling triacylglycerol response coefficient of an evaporative light scattering detector in liquid chromatography-evaporative light-scattering detection // Journal of Chromatography. A. 2004. №7. 1035(2). P. 221-225.
2. Mondello L., Tranchida P.Q., Stanek V., Jandera P., Dugo G., Dugo P. Silver-ion reversed-phase comprehensive twodimensional liquid chromatography combined with mass spectrometric detection in lipidic food analysis // Journal of Chromatography. A. 2005. №9. 1086(1-2). P. 91-98.
3. Resource site for lipid studies. http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm .
4. Buchgraber M. , Ulberth F., Anklam E. Capillary GLC: a robust method to characterize the triglyceride profile of cocoa butter - results of intercomparison study // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004. V. 52. P. 3855-3860.
5. Buchgraber M., Ulberth F., Emons H., Anklam E. Triacylglycerol profiling by using chromatographic techniques// European Journal of Lipid Science and Technology. 2004. V. 106. P. 621-648.
6. Gaudin K., Chaminade P., Baillet. A. Retention behavior of unsaturated fatty acid methyl esters on porous graphitic carbon // Journal of Separation Science. 2004. V. 27. P. 41-46.
7. Межгосударственный стандарт ГОСТ 30418-96. Масла растительные. Метод определения жирнокислотного состава. Введ. 01.01.98. Минск: Изд-во стандартов, 1996. 7 с.
8. ГОСТ Р 51483-99. Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме. Введ. 01.01. 2001. М., 2000. 8 с.
9. Рудаков О.Б. Развитие метода интерпретации хроматограмм при идентификации растительных масел // Химия растительного сырья. 2001. №4. С. 79.
10. ГОСТ Р 51486-99. Масла растительные и жиры животные. Получение метиловых эфиров жирных кислот. Введ. 01.01. 2001. М., 2000. 6 с.
Поступило в редакцию 25 июля 2006 г.
После переработки 14 сентября 2006 г.
