CC BY
60
Копылов В.А., Никитенко И.Е., Гурьянов А.М.
Оренбургская государственная медицинская академия E-mail: vadkopl@rambler.ru
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТАБОЛИТА БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS 804 ПРИ АУТОДЕРМОПЛАСТИКЕ ОЖОГОВЫХ РАН
Проблема лечения ожогов является актуальной в настоящее время. Частота отторжения трансплантата после аутодермопластики остается высокой. Мы располагаем штаммом бактерий рода Bacillus, который продуцирует фактор роста фибробластов человека. В экспериментальной работе показано, что использование метаболита бактерий данного штамма при аутодермопластике существенно ускоряет адгезию трансплантата, снижает частоту его лизиса, а также значительно улучшает процессы репарации в области ожоговой раны.
Ключевые слова: ожоги, аутодермопластика, фактор роста фибробластов.
Успехи современной биологической и медицинской науки позволили выделить в лабораторных условиях группу пептидов, относящихся к фактору роста фибробластов (ФРФ). Они играют ключевую роль в пролиферации и дифференциации различных клеток и тканей [1] . У человека выделено 22 пептида, относящихся к ФРФ [2].
В настоящее время проводятся экспериментальные исследования для определения возможностей применения ФРФ в медицине. Получены данные об ускорении восстановления функций центральной нервной системы после ишемического повреждения [3,4], об улучшении заживления ожоговых ран [5]. Yao C. с соавт. [6] опубликовали данные о хорошем эффекте ФРФ в лечении длительно незаживающих ран.
Фактор роста фибробластов человека выпускается в США и странах Европейского Союза только для лабораторного применения. Для получения ФРФ используют рекомбинантные штаммы Escherichia ooli, Baculovirus. В эксперименте показана возможность получения ФРФ с помощью Bifidobacterium [7], трансгенных шелкопрядов^]. В экспериментальной работе мы получили продукты жизнедеятельности штамма бактерий Bacillus subtilis 804, которые содержат фактор роста фибробластов человека.
Целью работы явилось изучение влияние метаболита бактерий Bacillus subtilis 804 на заживление ожоговых ран после аутодермопластики в эксперименте на крысах.
Материалы и методы
Сорока крысам под фторотановым наркозом были нанесены глубокие контактные ожоги площадью 2% на предварительно выбритые участки в области спины. После формирования струпа на
7-9 сутки была выполнена некрэктомия, а после очищения ран - аутодермопластика. Трансплантат забирали с выбритого участка спины марочным способом. Двадцати крысам (опытная группа) при проведении кожной пластики непосредственно перед укладкой трансплантата рану орошали 1 мл метаболита бактерий Bacillus subtilis 804. Двадцати животным контрольной группы рану орошали 1 мл физиологического раствора.
Ежедневно выполнялись наблюдения за состоянием ран, степенью приживления трансплантата, а также регистрировалось потребление корма и воды, особенности поведения, масса тела животных.
На 10 сутки после аутодермопластики по 10 крыс из каждой группы были выведены из опыта с помощью летальной дозы фторотана. Производились морфологические исследования тканей области раны. За остальными животными производилось наблюдение до 1 месяца после кожной пластики.
Методика морфологических исследований. Кусочки тканей зафиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина. Фиксированные кусочки органов затем были обезвожены в спиртах возрастающей крепости и залиты парафином - целлоидином. С каждого объекта на ротационном микротоме изготовили серийные парафиновые срезы толщиной 6-8 мкм (по 10 стекол). Гистологические препараты окрасили гематоксилином Майера и эозином. Выполнили светооптическое изучение препаратов с увеличением в 400 и 900 раз.
Результаты и обсуждение
У животных группы контроля, которым наносился физиологический раствор, адгезия
произошла через 55,7±4,6 минут. В опытной группе адгезия трансплантата наступила через 3,4±0,5 минут, р<0,001.
На 10 сутки в группе контроля у четырех животных произошел лизис трансплантата -на вторые (две крысы), третьи и на четвертые сутки после кожной пластики.
У всех крыс опытной группы трансплантат находился на месте пересадки, признаков некроза или лизиса не наблюдалось. При дальнейшем наблюдении в опытной группе у всех наступило заживление ран, в группе контроля - еще у двух крыс произошло нагноение раны и отторжение трансплантата (на 13 и 15 сутки). Таким образом, заживление ран в опытной группе произошло у 100% животных, в контрольной группе - лишь у 14 (70%) крыс.
После нанесения ожога прибавки массы тела у крыс обеих групп не наблюдалось в течение недели; на 14 день прибавка массы составила в контрольной группе - 7,3± 0,9 г за неделю, в опытной - 7,4± 1,9 г; в последующие две недели прибавка массы составила в контрольной группе 15,4± 0,8 г, а в опытной - 15,5± 0,9 г. Во всех случаях р>0,5, что указывает на несущественность различий между группами.
При гистологическом исследовании обнаружено, что из десяти контрольных животных только у четырех после фиксации и проводки материала аутотрансплантаты были тесно связаны с подлежащей тканью. В условиях опыта все пересаженные кусочки оказались прочно фиксированными с местом пересадки.
В условиях контроля на10 сутки после пересадки кожи отмечена активизация процесса пролиферации в краевых участках раны. Митотическая активность клеток базального и шиповатого слоев выросла до 45,8±0,5 %% по сравнению с участками, удаленными от этой зоны (18,3±0,4%). Полной эпителизации в зоне пересадки нет. По краю раны увеличилось число соединительнотканных сосочков, что свидетельствовало о повышении активности соединительной ткани. Из-за выраженного в ране деструктивного процесса не происходило оптимальной миграции клеток эпидермиса. В соединительной ткани вблизи краев раны наблюдалась полиморфноядерная инфильтрация. В эпителии аутотрансплантата, находя-
щегося в центре раны, были видны явления ваку-олярной дистрофии, а в подлежащей незрелой соединительной ткани - много эозинофилов. При изучении препаратов животных группы контроля обращала на себя внимание значительная, по сравнению с опытом, выраженность деструктивных процессов.
В условиях опыта на 10 сутки после аутотрансплантации неэпителизированными оставались микроскопических размеров участки, находящиеся под струпом, где наблюдалась активная миграция клеток базального слоя, в ходе которой клетки снижали способность к синтезу кератина, и, следовательно, к образованию контактов с дермой. Этот процесс продолжался до тех пор, пока эпителиальные клетки не встречались с кератиноцитами аутотрансплантата. Под тонким покрывающим эпителиальным пластом располагалась уже более зрелая волокнистая соединительная ткань в которой преобладали фибробласты и миофибробласты. Последние активно уменьшали размеры раны.
Особый интерес представляла новообразу-ющаяся соединительная ткань в условиях опыта. Наряду с активным ангиогенезом и активным синтезом коллагеновых волокон, возросло число фибробластов на условной единице площади по сравнению с контролем. Кроме того, оказалось значительно увеличенным число тучных клеток, деятельность которых могла быть связана с интенсификацией ими процесса во-локнообразования. Кроме того, у опытной группы животных в формирующейся соединительной ткани обнаруживались гигантские макрофаги, подобные остеокластам. В условиях контроля подобной картины не наблюдалось.
Выводы
Таким образом, при клинических наблюдениях выявлено, что однократное использование метаболита бактерий Bacillus subtilis 804 при кожной пластике существенно ускоряет адгезию трансплантата и снижает частоту его лизиса.
Данные гистологического исследования показывают, что у крыс, которым применялся данный метаболит, происходит полное приживление трансплантата, и идут активные процессы регенерации в области раны.
31.03.2011
Список литературы:
1. Batcher R.T., Niehrs C. Fibroblast growth factor signaling during early vertebrate development // Endocr. Rev. - 26 (1). - P. 63-77.
2. Finklestein S.P., Plomaritoglou A. Growth factors. in Miller L.P. and Hayes R.L., eds. Co-edited by Newcomb J.K. // Head Trauma: Basic, Preclinical, and Clinical Directions. John Wiley and Sons, Inc. New York. - P. 165-187.
3. Вада К., Сугимори Г., Бхайд П. Влияние основного фактора роста фибробластов на прогениторные клетки головного мозга после перманентной фокальной ишемии у крыс // Stroke (Инсульт). - 2004. - №1. - С. 21-23.
4. Bendfeldt K., Radojevic V., Kapfhammer J. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier // J Neurosci. - 2007. - Mar 21;27(12). - P. 3260-3267.
5. Akita S., Akino K., Imaizumi T. Basic fibroblast growth factor accelerates and improves second-degree burn wound healing // Wound Repair Regen. - 2008. - Sep-Oct;16(5). - P. 635-641.
6. Yao C., Yao P., Wu H., Zha Z. Acceleration of wound healing in traumatic ulcers by absorbable collagen sponge containing recombinant basic fibroblast growth factor // Biomed Mater. - 2006. - Mar;1(1). P. 33-37.
7. Шкопоров А.Н. Разработка методов генетической модификации бифидобактерий с целью создания препаратов-пробиотиков нового поколения. Автореф. дисс. канд. мед. наук. Москва. - 2008. 24с.
8. Hino R., Tomita M., Yoshizato K. The generation of germline transgenic silkworms for the production of biologically active recombinant fusion proteins of fibroin and human basic fibroblast growth factor // Biomaterials. - 2006. - Nov;27(33). - P. 5715-5724.
Сведения об авторах:
Копылов Вадим Анатольевич, ассистент кафедры травматологии и ортопедии Оренбургской государственной медицинской академии, кандидат медицинских наук Никитенко Иван Евгеньевич, аспирант кафедры травматологии и ортопедии Оренбургской
государственной медицинской академии Гурьянов Андрей Михайлович, ассистент кафедры травматологии и ортопедии Оренбургской государственной медицинской академии, кандидат медицинских наук 460000, г. Оренбург, пр-т Победы, 1, тел. (3532) 313977, е-шаИ: vadkopl@rambler.ru
UDC 224 035.01
Kopylov V.A., Nikitenko I.E., Gurjanov A.M.
E-mail: vadkopl@rambler.ru
USING THE METABOLITE OF BACILLUS SUBTILIS 804 FOR DERMAL AUTOPLASTY OF BURN WOUNDS
The problem of burn treatment is very important. There is high incidence of graft rejection after autoplasty of burn wounds. We have the strain of Bacillus subtilis which produces human fibroblast growth factor. In experimental study is shown using the metabolite of these bacteria for dermal autoplasty result in acceleration of graft adhesion, decreasing incidence of graft rejection and improving reparative processes in the wound area.
Key words: burns, dermal autoplasty, fibroblast growth factor.
Bibliography:
1. Batcher R.T., Niehrs C. Fibroblast growth factor signaling during early vertebrate development // Endocr. Rev. - 26 (1). -P 63-77.
2. Finklestein S.P, Plomaritoglou A. Growth factors. in Miller L.P. and Hayes R.L., eds. Co-edited by Newcomb J.K. // Head Trauma: Basic, Preclinical, and Clinical Directions. John Wiley and Sons, Inc. New York. - P. 165-187.
3. Vada K., Sugimory G, Bhide P. Influence of basic fibroblast growth factor on progenitor cells of brain after permanent focal ischemia of rats // Stroke (Insult). - 2004. - №1. - P. 21-23.
4. Bendfeldt K., Radojevic V., Kapfhammer J. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier // J Neurosci. - 2007. - Mar 21;27(12). - P. 3260-3267.
5. Akita S., Akino K., Imaizumi T. Basic fibroblast growth factor accelerates and improves second-degree burn wound healing // Wound Repair Regen. - 2008. - Sep-Oct;16(5). - P. 635-641.
6. Yao C., Yao P., Wu H., Zha Z. Acceleration of wound healing in traumatic ulcers by absorbable collagen sponge containing recombinant basic fibroblast growth factor // Biomed Mater. - 2006. - Mar;1(1). P. 33-37.
7. Shkoporov A.N. Development of methods of genetic modification of Bifidobacteria for the purpose of making probiotic drugs of the new generation. Abstract of thesis candidat of medical science. Moscow. - 2008. 24 p.p.
8. Hino R., Tomita M., Yoshizato K. The generation of germline transgenic silkworms for the production of biologically active recombinant fusion proteins of fibroin and human basic fibroblast growth factor // Biomaterials. - 2006. - Nov;27(33). -P 5715-5724.
