CC BY
72
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И БИОЛОГИЯ
УДК 616-001.41:616-003.93
© В.А. Миханов, В.С. Полякова, Р.А. Абземелева, Е.И. Шурыгина, 2013
В.А. Миханов, В.С. Полякова, Р.А. Абземелева, Е.И. Шурыгина ЗАЖИВЛЕНИЕ ГЛУБОКИХ СКАЛЬПИРОВАННЫХ РАН КОЖИ
ПОД ДЕЙСТВИЕМ МЕТАБОЛИТОВ КУЛЬТУРЫ BACILLUS SUBTILLIS 804
ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Оренбург
Изучены структурно-функциональные аспекты биостимулирующего влияния метаболитов культуры Bacillus subtilli s 804 на процессы репаративного гистогенеза при заживлении глубоких скальпированных ран кожи. Показано, что применение метаболитов культуры Bacillus subtillis 804 в виде однократного послеоперационного орошения раны обеспечило оптимизацию функций клеток - эффекторов репаративного процесса, что послужило основой для становления адекватных эпидермально-соединительнотканных отношений и способствовало ускоренному заживлению ран с формированием функционально и косметически более качественного рубца.
Ключевые слова: раны кожи, репаративная регенерация, Bacillus subtillis 804.
V.A. Mikhanov, V.S. Polyakova, R.A. Abzemeleva, E.I. Shurygina DEEP DISSECTED SKIN WOUNDS HEALING UNDER THE ACTION OF BACILLUS SUBTILLIS 804 METABOLITES
The work studies the structural and functional aspects of biostimulating influence of Bacillus subtillis 804 metabolites on reparative histogenesis in the healing of deep dissected skin wounds. The use of Bacillus subtillis 804 metabolites in a single postoperative wound irrigation is shown to ensure optimization of functions of repair process cells - effectors that was the basis for the development of adequate relations between epidermis and connective tissue and helped to accelerate the healing of wounds with formation of a functionally and cosmetically better scar.
Key words: skin wounds, reparative regeneration, Bacillus subtillis 804.
Изучение проблем репаративной регенерации является одной из фундаментальных задач биологии и медицины [1,3]. При регенерации поврежденных тканей ведущую роль играет группа пептидов, относящихся к фактору роста фибробластов (ФРФ) [2,4,5,6,8]. Биотехнологическими методами ростовые факторы могут быть получены в количествах, достаточных для их применения с лечебной целью, и ведутся попытки создания рецептур, включающих в свой состав ростовые факторы. Однако современные методы получения ростовых факторов характеризуются трудоемкостью и дороговизной [7]. В 2009 году в эксперименте сотрудниками кафедры травматологии и ортопедии ОрГМА под руководством профессора В.И. Никитенко были получены продукты жизнедеятельности бактерий штамма Bacillus subtilis 804, стимулирующие рост фибробластов (ФБ) человека в культуре. На основе данных метаболитов в 2011 году В.И. Никитенко разработал и зарегистрировал препарат "Винфар" (свидетельство на товарный знак № 433087 от 23.03.2011), выпускаемый в настоящее время ООО "Бакорен".
Цель работы - изучение влияния метаболитов культуры Bacillus subtillis 804 на процессы репаративного гистогенеза при заживлении глубоких скальпированных ран кожи крыс.
Материал и методы
Экспериментальные исследования проводили на 40 крысах-самцах линии «Вистар» массой 180,0 ± 10,0 г. Все исследования на животных были выполнены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1984), «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (1986), «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза СССР от 13.11.1984 г. № 724). После удаления волосяного покрова на спине животных в стерильных условиях под ингаляционным наркозом были выполнены скальпированные раны площадью 2,25 см2, глубиной до гиподермы. Животные были разделены на 2 группы по 20 крыс: 1-я - опытная, в которой зону раневого дефекта кожи однократно орошали 1,0 мл препарата «Винфар» в дозе метаболитов культуры Bacillus subtillis 804, равной 0,015 мкг/кг веса крысы; 2-я - контрольная, животным которой на рану наносили 1,0 мл физиологического раствора. Животных выводили из опыта на 3-и, 7 и 11-е сутки после нанесения раны кожи. Забой и взятие материала осуществлялись согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». У опытных и контроль-
ных животных иссекали участки кожи с послеоперационными ранами и подлежащими тканями. Кусочки тканей фиксировали в 10% растворе формалина, забуференного по Лил-ли, затем обезвоживали в этаноле возрастающей крепости и заливали в целлоидин-парафин по общепринятой методике. Гисто-срезы толщиной 5-6 мкм после депарафини-зации исследовали при помощи световой микроскопии с применением гистологического (окраска гематоксилином и эозином и по Майеру), гистохимического (окраска по Мал-лори, толуидиновым синим), иммуногистохи-мического (выявление экспрессии белка Ki-67, коллагена I - III типов) методов исследования и морфометрии. С помощью программы оптического анализа ImageJ 1.46h по цифровым микрофотографиям проводили морфо-метрическую оценку эпидермиса и дермы (подсчёт объемной плотности сосудов микро-циркуляторного русла, коллагеновых волокон (КВ), аморфного вещества, клеток). При оценке экспрессии Ki-67 рассчитывали индекс пролиферации (ИП) по формуле: ИП= (n+/N)x100%, где n+ - число меченых ядер,
N - общее число ядер в базальном и шиповатом слоях в поле зрения микроскопа (на микрофотографии). В ходе иммуногистохимиче-ского исследования использовали монокло-нальные антитела и систему визуализации фирмы BioGenex, США. При проведении статистической обработки результатов вычисляли средние значения абсолютных и относительных величин (М), ошибки средних величин (т) и критерий Стьюдента. Различия считали достоверно значимыми при уровне вероятности р<0,05.
Результаты и обсуждение
Область раневого дефекта кожи крыс в контрольной группе на 3-и сутки характеризуется интенсивной воспалительной реакцией в фазе экссудации: на фоне массивной нейтрофильной инфильтрации (полиморфно-ядерные лейкоциты (ПЯЛ) достигают 19,4±1,3% от всех тканевых компонентов) и интерстициального отека (что отражается в увеличении объемной плотности аморфного вещества до 36,5±1,3%) обнаруживается небольшое количество макрофагов (МФ) (табл.1).
Таблица 1
Соотношение объемной плотности тканевых структур соединительной ткани в области раневого дефекта кожи крыс опытной и
контрольной групп на 3-и сутки репаративного процесса
Компоненты ткани Срок репарации - 3-и сутки
контроль опыт
Аморфное вещество, % 36,5±1,3** 17,9±1,5**
Клетки (ФБ, ПЯЛ. МФ, тучные клетки и лимфоциты), % 36,2±1,4* 25,6±1,4*
ФБ ПЯЛ МФ ФБ ПЯЛ МФ
7,4±1,2** 19,4±1,3*** 2,4±0,1** 13,2±1,5** 3,2±0,2*** 7,3±0,8**
Волокнистые структуры, % 23,8±1,5** 37,7±1,4**
Сосуды, % 3,5±0,3*** 18,8±1,3***
* Уровень вероятности достоверной разницы между опытом и контролем данного срока р<0,05. ** Уровень вероятности достоверной разницы между опытом и контролем данного срока р<0,01. *** Уровень вероятности достоверной разницы между опытом и контролем данного срока р<0,001.
Активно продолжается лейкодиапедез. Эпителизация в большинстве случаев отсутствует или нарастающий эпителий не покрывает полностью раневой дефект кожи (рис.1).
-- ___
1 > .т - _ - ~ f 'А „ /,
4
О* V-С' 4 ^
« * —>- - - . _ Д
Рис.1. Контрольная группа, 3-и сутки: 1-ПЯЛ; 2-МФ; 3-ФБ; 4КВ; 5-струп (детрит); 6-эпителий. Окраска гематоксилином и эозином и по Майеру. Общ. ув. х 300
Рис.2. Опытная группа, 3-и сутки: 1-ПЯЛ; 2-МФ; 3-ФБ; 4-КВ; 5-струп (детрит); 6-эпителий. Окраска гематоксилином и эозином и по Майеру. Общ. ув. х 300
Регенерирующая ткань раневого дефекта на 3-и сутки уже очищена от детрита, который представлен струпом на поверхности раны, по этой причине он не учитывался нами при проведении подсчета объемной плотно-
сти тканевых структур соединительном ткани в области раны.
На 3-и сутки в опытной группе определяется эпителизация раны под струпом, эпителиальный пласт в 2-3 слоя (рис. 2). ИП ба-зальных кератиноцитов составляет 68,2±0,6%. Воспалительная реакция незначительная, с преобладанием отечного компонента над ин-фильтративным (ПЯЛ составляют 3,2±0,2%). Соотношение МФ и нейтрофилов увеличивается по сравнению с контролем и составляет 2,3:1 соответственно. Большее значение мак-рофагально-нейтрофильного индекса в опытной группе свидетельствует об изначально меньшей выраженности воспалительного процесса, более быстром очищении раны и переходе на следующие этапы заживления. Так, уже на 3-и сутки в опыте инициируется процесс образования грануляционной ткани
(ГТ), фибробластический дифферон гетероге-нен: наряду с юными ФБ отмечаются функционально активные формы. Благодаря синтетической деятельности ФБ состав межклеточного вещества уже характеризуется концентрацией и соотношением гликозаминогликанов (ГАГ) и гликопротеинов (I II), необходимыми для инициации процесса агрегации молекул коллагена в фибриллы, что подтверждается формированием тонких коллагеновых волокон толщиной до 2,3±0,3 мкм.
Развитие ГТ и полное закрытие раневого дефекта эпителием наблюдаются в контрольной группе на 7-е сутки. Однако наличие в ткани воспаления, недостаточная мак-рофагальная реакция задерживают эпителиза-цию (ИП 66,4±0,5 %), а также пролиферацию и дифференцировку ФБ (табл. 2).
Таблица 2
Соотношение объемной плотности тканевых структур соединительной ткани в области раневого дефекта кожи крыс опытной и контрольной групп на 7 и 11-е сутки репаративного процесса
Компоненты Срок репарации 7-е сутки 11-е сутки
ткани контроль опыт контроль опыт
Аморфное веще- 19,8±1,5* 12,3±0,3* 13,1±0,3** 6,2±0,6**
ство, %
Клетки (ФБ, ПЯЛ. 23,6±1,5 25,6±0,6 30,5±1,3** 16,5±0,8**
МФ, тучные клет- ФБ ПЯЛ МФ ФБ ПЯЛ МФ ФБ ПЯЛ МФ ФБ ПЯЛ МФ
ки и лимфоциты), 10,3±1,2 4,4±1,3 5,1±0,1 14,6±1,5 0,8±0,2 8,9±0,8 14,9±1,2 2,1±0,3 8,1±0,7 8,2±1,5 0,2±0,1 4,9±0,4
% * *** ** * *** ** ** *** ** ** *** **
Волокнистые 26,2±1,3** 39,8±1,7** 42,1±1,9*> 69,7±2,6*
структуры, %
Сосуды, % 30,4±1,3* 22,3±1,3* 14,3±0,7** 7,6±0,4**
* Уровень вероятности достоверной разницы между опытом и контролем данного срока р<0,05. ** Уровень вероятности достоверной разницы между опытом и контролем данного срока р<0,01. *** Уровень вероятности достоверной разницы между опытом и контролем данного срока р<0,001.
Тонкие КВ (2,8±0,2 мкм) в группе контроля на 7-е сутки представлены коллагеном III типа (рис. 3).
сосудов, постепенной деградации коллагена III типа и появлении зрелого коллагена I типа (рис. 4). Б» «.-
Рис.3. Контрольная группа, 7-е сутки. Иммуногистохимическая реакция на коллаген III типа (коллаген III - коричневого цвета, указан стрелками). Ув. х 300
7-е сутки в опытной группе характеризуются продолжением процесса интеграции коллагеновых фибрилл, что подтверждается достоверным (р<0,01 в сравнении с контролем) увеличением толщины КВ до 3,9±0,3 мкм. Примечательно, что в опыте на 7-е сутки уже инициируется процесс реорганизации ГТ, выражающийся в запустевании и редукции
ьЗЕЬШЙ 1 i •
Рис.4. Опытная группа, 7-е сутки. Иммуногистохимическая реакция на коллаген III типа (коллаген III - коричневого цвета, указан стрелками). Ув. х 300
В результате значительного увеличения пролиферативной активности эпителиоцитов (ИП 96,8±0,9 %), формируется до 6-7 слоев эпителия, что соответствует нормальной толщине эпидермиса кожи крысы (рис. 5).
В опытной группе на 11-е сутки в связи с завершением формирования эпителиального пласта, дифференцирующегося на все функ-
на 11-е сутки и 96,8±0,9 % в опыте на 7-е), что определяет замедление эпителизации и связано с нарушением созревания ГТ. Во-вторых, большая толщина КВ (4,1±0,4 мкм в контроле на 11-е сутки и 3,9±0,3 мкм в опыте на 7-е), обусловленная менее выраженной реакцией МФ и, таким образом, замедлением процессов коллагенолиза уже зрелых КВ коллагена III типа.
Выводы
1. Применение препарата «Винфар» лимитирует выраженность воспалительного процесса (вероятно, в связи с наличием антимикробных веществ в составе метаболитов Bacillus subtilis 804), что определяет раннюю миграцию МФ в зону повреждения и ускоренное очищение раневого дефекта.
2. Входящий в состав препарата ФРФ стимулирует миграцию в рану ФБ, их пролиферацию и дифференцировку, что обеспечивает формирование гетерогенного фибробла-стического дифферона уже на 3-и сутки после нанесения раны, а на 7-е сутки определяет перестройку ГТ с заменой беспорядочно ориентированных КВ, содержащих коллаген III типа, на функционально ориентированные пучки КВ с коллагеном I типа.
3. При местном применении «Винфар» стимулирует пролиферацию эпителиоцитов, способствуя ускоренному темпу формирования функционально и морфологически полноценного эпидермального пласта уже на 7-е сутки после альтерации.
Сведения об авторах статьи:
Миханов Василий Александрович - к.м.н., ассистент кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России. Адрес: 460000, г. Оренбург, Советская, 6. E-mail: vmikhanov@gmail.com.
Полякова Валентина Сергеевна - д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической анатомии ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России. Адрес: 460000, г. Оренбург, Советская, 6. E-mail profpolyakova@yandex.ru.
Абземелева Регина Асраровна - врач ординатор ГБУЗ Бюро СМЭ Оренбургской области. Адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Кирова, 40. Тел. 8(3532)77-08-31, е-mail info@orensme.ru.
Шурыгина Елена Ивановна - студентка лечебного факультета ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России. Адрес: 460000, г. Оренбург, Советская, 6. E-mail shuryginalena@mail.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аничков Н.Н., Волков К.Г. Морфология заживления ран. - М.: Медгиз, 1951. - 123 с.
2. Гончарова, В.П. Факторы роста фибробластов / В.П. Гончарова // Физиологический журнал им. Сеченова. - 1994. - Т.80. -Вып. 9. - С. 163.
3. Шехтер, А.Б. Грануляционная ткань: воспаление и регенерация /А.Б. Шехтер, Г.И.Берченко // Архив патологии. - 1978. - T.XL. - Вып.8. - С.20-28.
4. Akita S., Akino K., Imaizumi T. Basic fibroblast growth factor accelerates and improves second-degree burn wound healing // Wound Repair Regen. 2008. Vol. 16. № 5. P. 635-641.
5. Bendfeldt K., Radojevic V., Kapihammer J.Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier // J. Neurosci. 2007. Vol. 27. N° 12. P. 32603267.
6. Bottcher R.T., Niehrs C. Fibroblast growth factor signaling during early vertebrate development // Endocr. Rev. 2005. Vol. 26. № 1. P. 63-77.
7. Ornitz D.M. Fibroblast growth factors // Genon Biology. 2001. № 2. P.3005.1-3005.12.
8. Yao C., Yao P., Wu H., Zha Z. Acceleration of wound healing in traumatic ulcers by absorbable collagen sponge containing recombinant basic fibroblast growth factor // Biomed. Mater. 2006. Vol. 1. № 1 .P. 33-37.
циональные слои, ИП снижается до 64,6±0,4%. Собственно дерма представлена плотной волокнистой неоформленной соединительной тканью, матрикс которой содержит КВ коллагена I типа, преимущественно ориентированные вдоль ФБ и базальной мембраны в соответствии с функциональной нагрузкой на ткань. Вероятно, в связи с преобладанием коллагенолиза коллагена III типа над синтезом коллагена I типа наблюдается уменьшение средней толщины КВ (до 2,4±0,2 мкм), т.е. активность синтеза коллагена I типа и сборка КВ уступают деградации зрелых КВ, состоящих из коллагена III типа.
/
Рис.5. Опытная группа, 7-е сутки. 1-эпителий (пласт), 2-КВ: 3-кровеносные сосуды (капилляры). Гистохимическая окраска по Маллори. Ув. х 600
Морфологическая картина в контроле на 11-е сутки схожа с таковой в опыте на 7-е сутки, хотя и здесь можно отметить ряд отличий. Во-первых, меньшее значение ИП ба-зальных кератиноцитов (91,6±0,8% в контроле
