CC BY
1
ИННОВАЦИОННЫЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ЭКСТРАКТА СЕМЯН SILYBUM MARIANUM (L.) ПРОИЗРАСТАЮЩЕЙ В ТУРКМЕНИСТАНЕ И ИХ КАЧЕСТВЕННЫХ
ПОКАЗАТЕЛЕЙ
Т.Ш. Дурдыев, преподаватель Г.А. Соегов, студент A.A. Бердиев, преподаватель И. Гурбанов, канд. хим. наук
Г.А. Керимов, канд. фармацевт. наук, старший преподаватель
Государственный медицинский университет Туркменистана имени Мырата Гаррыева (Туркменистан, г. Ашхабад)
DOI:10.24412/2500-1000-2024-10-2-25-31
Аннотация. В статье определяются особенности лечебных свойств и фармакологические качественные показатели расторопши пятнистой. Расторопша пятнистая (Silybum marianum (L.) Gaertn.) - лекарственное растение, относящееся к одноименному роду семейства Астровые или Сложноцветные (Asteraceae Dumort.). Во всем мире встречается 2, а в Туркменистане 1 вид этого растения. Целью научно-исследовательской работы явилось Определение качественных показателей семян расторопши путем фармакогностических исследований и инновационный метод получения сухого экстракта семян расторопши пятнистой произрастающей в Туркменистане. Для исследования семена расторопши были привезены из Сумбарского ущелья этрапа Махтумкули Балканского велаята.
Ключевые слова: Расторопша, Silybum marianum, флавонигнаны, микроскопия, спектрофо-тометрия, хроматография.
Расторопша пятнистая (Silybum marianum (Ь.) ОаеЛп.) - лекарственное растение, относящееся к одноименному роду семейства Астровые или Сложноцветные (Asteraceae Битой.). Родиной расторопши пятнистой считается территория Средиземного моря, но до настоящего времени она культивировалась и распространилась по всему миру. Научные данные свидетельствуют о более чем двухты-сячелетней истории применения лечебных свойств семян расторопши. Во всем мире встречается 2, а в Туркменистане 1 вид этого растения [1-3].
Семена расторопши считаются уникальным источником биологически активных соединений. В их составе обнаружены флаво-лигнановые соединения, органические и жирные кислоты, белки и смолы. Применение растения в лечении болезней печени, селезенки и желудочно-кишечного тракта, а также использование в качестве гепатопротектора при различных отравлениях и повреждениях в медицине и фармацевтической промышленности зависит от флавонолигнановых соединений в её составе [4].
В зависимости от способности создавать особенности генотипа и условий произрастания, каждое растение содержит от 10 до 50 плодов, каждый плод содержит по 65-190 семян, масса 1000 семян - 20-30 г. Одно растение способно дать около 6000 семян со всхожестью до 94%. Растение считается умеренно устойчивым к засухе и холоду, его можно выращивать в регионах, где продолжительность холодного сезона в среднем не превышает 150 дней. При температуре ниже -10°С растение погибает. Сбор плодов осуществляют с конца августа по начало октября. Средняя урожайность 10-15 ц/га [4-6].
По научным данным, созревшие семена расторопши содержат примерно 7% воды, 2030% липидов, 20-30% белков, 0.038% токоферола, 0.63% стероловых и флавонолигнано-вых соединений [6].
Содержание масла в семенах в среднем равно 20-30%, в их составе олеиновая кислота (23-36.7%), линолеин (39.7-54%), палмитин (7-10.2%), стеарин (6.9%), арахидин (3.6%) и бегеновые кислоты (2.5%), в том числе и остатки линоленовой и эйкозеновой кислот.
Также в составе масла выявлены фосфолипи-ды, фитостеролы и витамин Е [5].
Основным ответственным за проявление фитотерапевтических и фармакологических свойств расторопши является силимариновое биоактивное соединение. Это флаволигнано-вое соединение образовано из составных частей флавоноидов, таких как: силикристин, силидианин, силибин и изосилибин. По количеству силибин содержится в 50-70% смеси и является основным составным компонентом силимарина, далее следуют силикристн, силидианин и изосибилин. Флавоноидная часть состоит из таксифолинового флавонона. Они образуются в результате свободно-радикального присоединения таксифолина и кониферилового спирта в растительной клетке [7; 8].
По результатам многолетних исследований было подтверждено, что силимариновая биодобавка, полученная из семян расторопши, не вызывает никаких побочных явлений, кроме незначительных расстройств желудочно-кишечного тракта, также выявлена ее очень низкая общая токсичность. Благодаря высокой степени безопасности и лечебных свойств расторопши, в 1970 году Всемирная организация здравоохранения одобрила силимари-новый флаволигнановый комплекс растороп-ши пятнистой в качестве лекарственного средства с гепатопротекторными свойствами [5].
Согласно фармакопеям Европы и США, нормой считается содержание 1.5-2% силима-рина в плодах расторопши. Тем не менее, имеются многочисленные научные доказательства того, что количество силимарина в семенах может различаться в зависимости от генотипа и условий произрастания растения. По некоторым данным, его количество достигает до 0.62-2.25%, 2-4%, а иногда и 4.2-6%. По данным исследований, проводившихся в нашей стране, есть научные данные с показателями 4.09% при экстрагировании семян растения ацетоном [2].
В связи с повышением спроса на гепато-протекторы на основе силимарина, фармацевтическим предприятиям необходимо производить лечебные препараты из экстрактов семян расторопши. Очень важно в нашей стране проработать качественные показатели сырья,
используемого для получения экстрактов из местных лечебных растений.
Цель работы. Определение качественных показателей семян расторопши путем фарма-когностических исследований и инновационный метод получения сухого экстракта семян расторопши пятнистой произрастающей в Туркменистане. Для исследования семена расторопши были привезены из Сумбарского ущелья этрапа Махтумкули Балканского ве-лаята.
Получение сухого экстракта. Из-за наличия в семенах расторопши пятнистой до 2030% масла получение её экстракта представляет собой определенные трудности. Поэтому получение экстракта проводили в два этапа. Для проведения экстракции в лабораторных условиях использовали метод экстракции Сокслета. Сначала семена расторопши пятнистой были измельчены, просеяны и взвешены на аналитических весах по 100,0 г образцов размером 0,5-1 мм. Полученные пробы были помещены в экстрактор, раствором гексана экстрагировались и обезжиривались в течение 6 часов. Полученный экстракт был очищен выпариванием экстрагента на роторном испарителе. Выход масла составил в среднем 20%. Полученное масло хранили в холодильнике до испытаний. Обезжиренная часть была высушена в эксикаторе и помещена в экстрактор. Экстракцию проводили дважды в разных пробах, в качестве экстрагентов использовали 40% и 80% растворы спиртов. Продолжительность экстракции- 6 часов. Спирт полученного экстракта был полностью выпарен на роторном испарителе, в него добавили дистиллированную воду и снова концентрировали. Полученный насыщенный экстракт замораживали при - 45°С в течение 4-6 часов для лиофилизации. Затем проводили процесс лиофилизации при температуре - 45°С, в вакууме 26 Па, в течение 12-14 часов. В результате были получены светло-коричневые и желтовато-коричневые сухие экстракты с приятным запахом, влажностью менее 5%.
Использованные приборы: измельчитель, аналитические весы, сушильный шкаф, муфельная печь, аппарат Сокслета, магнитная мешалка, роторный выпариватель, вакуум-фильтр, сепаратор, световой микроскоп, спектрометр, жидкостный хроматограф.
Микроскопическое исследование. Исследование семян расторопши было проведено посредством микроскопа Carl Zeiss Imager M2
(рис. 1). Изображения обработаны с помощью программного обеспечения ZenLite.
Рис. 1. Внешний вид и вид в поперечном разрезе семян расторопши пятнистой (х100)
Влажность. Влажность сырья была исследована согласно методике государственной фармакопеи РФ-ХШ (Ме§Ьге]1. Мот. е! а1., 2010; Государственная Фармакопея РФ, 2015). Коротко, 2 образца измельченного сырья с точной массой 3 г помещают в фарфоровые
тигли и высушивают в сушильном шкафу при температуре t=105°C в течение трех часов. Далее остужают в эксикаторе и по достижении постоянной массы взвешивают образцы. Влажность сырья вычисляют по формуле:
X =
(М - Мг) * 100
где М - масса сырья до высушивания; М1 -масса сырья после высушивания.
Зола общая. Определение золы общей было проведено согласно методике государственной фармакопеи РФ-ХШ [11]. Высушенные и измельченные семена расторопши в количестве ровно 3 г равномерно распределяют по дну заранее подготовленного тигля. Испы-
М
туемые образцы аккуратно прогревают при температуре 100-105°С в течение одного часа, далее остатки образцов сжигают при температуре 550-650°С. Тигель остужают в эксикаторе, затем взвешивают. Общую золу в процентах семян расторопши вычисляют по формуле:
X =
Мг * 100 ~М7
где М1 - масса золы, г; М2 - масса сырья, г. Зола нерастворимая в соляной кислоте.
Определение золы нерастворимой в соляной кислоте было проведено согласно методике государственной фармакопеи РФ-ХШ [11]. Коротко, в тигель, содержащий остаток после определения общей золы, добавляют 15 мл воды и 10 мл кислоты хлористоводородной, раствор покрывают часовым стеклом, аккуратно кипятят в течение 10 минут и охлажда-
ют. Фильтруют через обеззоленный фильтр, промывают фильтр горячей водой до тех пор, пока фильтрат не станет нейтральным, затем фильтр сушат и сжигают при температуре слабого красного каления, после чего охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Процентное содержание золы нерастворимой в 10%-ной HCL, в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле:
X =
(шх — т) * 100 * 100 m2(100 — W)
где Ш1 - масса золы общей, г; Ш2 - масса сырья, г; ш - масса золы фильтра, г; W - потеря в массе сырья при высушивании, %.
Тонкослойная хроматография. Около 1.0 г измельченного сырья с размером частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм омещают в колбу объемом 50 мл и заливают 10 мл 96%-го спирта, затем умеренно кипятят на водяной бане в течение 30 минут. Полученный образец остужают и фильтруют через бумажный фильтр (экспериментальный раствор). Далее капают 10 мкл экспериментального раствора на силикагеле-вую прослойку пластинки хроматографа и рядом капают 20 мкл раствора силибина СО. Пластинку сушат на воздухе. Затем ее помещают в камеру хроматографа с раствором 4 хлор углеродно-ацетонитрила в соотношении 6:4. После прохождения потока растворителей через пластинку размером 20х20 см, образцы достают из камеры, высушивают до полного исчезновения следов растворителей и наблюдают в диапазоне длины волны 254 нм при УФ. Хроматограмма обрабатывается свеже-
приготовленным диазореактивом и выдерживается в сушильном шкафу при температуре 105°С в течение 5 минут. В хроматограмме испытуемого раствора зона всасывания определилась на уровне зоны всасывания силиби-на.
Экстрактивные вещества. Определение количества экстрактивных веществ сырья проводят согласно методике государственной фармакопеи РФ-ХШ [11]. Коротко, ровно 1.0 г измельченного сырья помещают в коническую колбу объемом в 250 мл и кипятят 50 мл 80%-го спирта в течение двух часов. Фильтруют через бумажный фильтр в колбу объемом 200 мл, после чего 25 мл фильтрата переливают в фарфоровую подставку и выпаривают на водяной бане. Затем подставку высушивают в сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянного веса, остужают и взвешивают. Проводятся 2 параллельных исследования. Количество экстрактивных веществ в процентах вычисляют посредством превращения в неизменное сырье по формуле:
X =
т* 200* 100 т2 * (100 — W)
где Ш - масса сухого остатка, г; Ш1 - масса сырья, г; W - потеря в массе сырья при высушивании, %.
Количество семенного масла. Определение масложирового состава семян растороп-ши пятнистой произведено методом Сокслет экстракции. Семена расторопши измельчают в измельчителе, 5.0 г образца с размером частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм помещают в бумажный мешочек. Затем его помещают в Сокслет экс-
трактор и заливают туда 200 мл петролейного эфира. Экстракцию проводят в колбонагрева-теле при температуре около 80°С в течение 12 часов. Затем достают мешочек и после полного выветривания эфира высушивают в сушильном шкафу при температуре 80°С в течение 2 часов. Далее образец остужают и взвешивают на аналитических весах. Содержание жирного масла в процентах (А) в неизменном сухом остатке сырья вычисляют по формуле:
X =
(а1 — а2) * 100 * 100 а * (100 — W)
где а - масса сырья до экстракции, г; а1 -масса сырья вместе с мешочком до экстракции, г; а2 - масса сырья вместе с мешочком после экстракции, г; W - влажность сырья, %.
Определение количества флавонолигна-
нов. Определение количества флавонолигна-нов в составе сырья проводят согласно методике государственной фармакопеи РФ-XIII [11].
Раствор силибина СН. В колбе объемом 100 мл около 0.02 г. (точная навеска) силибина растворяют в 80 мл 96%-ного спирта, прогревают на водяной бане при температуре 70-80°С. После остывания раствора его доливают 96%-ным спиртом и перемешивают (раствор силибина А).
Семена расторопши измельчают в измельчителе и ровно 1.0 г сырья с размером частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещают в колбу со шлифом объемом 250 мл и добавляют 50 мл 96%-ного спирта. Колбу с образцом нагревают на водяной бане в течение 30 минут. Затем образец в колбе остужают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр в колбу
объемом 200 мл. Экстракцию повторяют трижды. После остывания фильтрата объем раствора в колбе дополняют до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают в колбу объемом 25 мл, дополняют объем до метки 96%-ным спиртовым раствором и перемешивают (раствор Б).
Оптическую плотность экспериментального раствора Б измеряют на УФ-спектрометре в диапазоне длины волны 289 нм в кювете с толщиной слоя в 10 мм (рис. 2). В качестве раствора для сравнения использовался 96%-ный спирт. Содержание суммы флаволигна-нов в пересчете на силибин в процентах в неизменном сухом сырье вычисляют по формуле:
X =
А* Ао* 25*200* 1* 100* 100 * Р Ао*а*25* 1* 100* (100 -W)* 100
где А-Б - оптическая плотность испытуемого образца; Ао - оптическая плотность стандартного образца силибина (СО); а - масса сырья, г; ао - масса стандартного образца
силибина (СО), г; Р - количество основного вещества в стандартном образце силибина (СО), %; Ж - влажность сырья, %.
Wavelength (rim)
Рис. 2. Ультрафиолетовый спектр силимарина в семени расторопши пятнистой
Данные, полученные по результатам ис- показателей семян расторопши приводятся в следований по определению качественных таблице.
Таблица. Качественные показатели семян расторопши пятнистой
Показатель Количество, % Стандарты фармакопеи, %
Влажность 4.9. не более 12 %
Общая зола 5.5 не более 6 %
Зола нерастворимая в 10%-ной соляной кислоте 3.8 не более 4 %
Масло семян 20.12 не менее 15 %
Суммарное количество флаволигнанов 3.2 не менее 2.4 %
Таким образом, фитохимический состав и качественные показатели семян расторопши пятнистой доказали соответствие стандартам ГФ.
Выводы
1. По анализу литературных данных был установлен повышенный полиморфизм в оболочках семян расторопши, а также изменение их цвета от светло-коричневого до коричневого и черного.
2. При микроскопическом исследовании на зокарпия от 1 до 10 рядов. Далее за слоем во-продольном и поперечном срезах семянки локнистых клеток расположена семенная ко-расторопши, видны семядоли, окруженные жура, представленная мощным слоем склере-толстым слоем, плотно сросшихся склереид, ид вытянутой формы с утолщенными стенка-заметных по естественной желтой окраске. ми.
Перикарпий на поперечном срезе состоит из 4. За слоем склереид в оболочке семянки
слоев: кутикулы покрывающей, неоднород- расположена паренхима плода, представленный эпидермальный слой, который со сторо- ная полуразрушенными спавшимися клетка-ны основания семянки представлен неболь- ми. Кожура сращена с паренхимой внутрен-шими толстостенными слабо-пористыми ней части плода и состоит из нескольких ря-клетками. Устьица в эпидермисе отсутствуют. дов спавшихся клеток паренхимы семенной
3. Непосредственно за эпидермисом распо- кожуры, а также спаянного с ней остатка эн-ложен пигментный слой в один ряд тонко- досперма, представленного одним рядом стенных, рыхлых клеток с бурым содержи- крупных клеток, заполненных алейроновыми мым. За ним слой волокнистых клеток ме- зернами.
Библиографический список
1. Бердымухамедов Г. Лекарственные растения Туркменистана. - Ашхабад: Туркменская государственная издательская служба, 2010. Том I. - С. 89-90.
2. Дурдыев Т., Данатаров Б., Акмырадов А. Инновационный метод получения сухого экстракта из семян расторопши пятнистой // Инновационные технологии в Туркменистане. Научно-популярный электронный журнал. - 2023. - № 3 (3). - С. 147-150.
3. Никитин В.В., Гельдиханов А.М. Определитель растений Туркменистана. - Л.: Наука, 1988. - 680 с.
4. Росихин Д.В. Фармакогностическое исследование по обоснованию комплексного использования расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn.) // Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук. - Самара, 2018. - С. 84.
5. Щекатихина А.С., Гавриленко Р.В., Курченко В.П. оценка содержания изомеров флаволиг-нанов расторопши пятнистой в гепатопротекторных препаратах // Вестник БГУ. Сер. 2. - 2010. -№ 2. - С. 73-78.
6. Ancuta Cristina Raclariu-Manolica et al. Detecting and profiling of milk thistle metabolites in food supplements: A Safety-Oriented Approach by Advanced // Analytics/ Metabolites. 2023, 13, 440.
7. Bijak M. Silybin, a Major Bioactive Component of Milk Thistle (Silybum marianum L. Gaernt.) -Chemistry, Bioavailability, and Metabolism // Molecules. 10 November 2017, 22, 1942.
8. Gulden Dogan et al. Chemical Composition and Biological Activity of Milk Thistle Seeds (Silybum marianum (L.) Gaertn.) // International Journal of Nature and Life Sciences (IJNLS). - 2022. -Vol. 6(2). - Pp. 90-98.
9. Roberto Marceddu et al. Milk Thistle (Silybum marianum L.) as a Novel Multipurpose Crop for Agriculture in Marginal Environments: A Review // Agronomy. - 2022. - № 12. - P. 729.
10. Meghreji. Moin. et al. Validated method for Silymarin by Spectrophotometry in Bulk drug and Pharmaceutical formulations // J. Chem. Pharm. Res. - 2010. - № 2(1). - P. 396-400.
11. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIII издание. - Москва, 2015. Том I, II, III.
INNOVATIVE METHOD OF OBTAINING DRY EXTRACT OF SEEDS OF SILYBUM MARIANUM (L.) GROWING IN TURKMENISTAN AND THEIR QUALITY
INDICATORS
T.Sh. Durdyev, Lecturer
G.A. Soegov, Student
A.A. Berdiyev, Lecturer
I. Gurbanov, Candidate of Chemical Sciences
G.A. Kerimov, Candidate of Pharmaceutical Sciences, Senior Lecturer Myrat Garryyev State Medical University of Turkmenistan (Turkmenistan, Ashgabat)
Abstract. The article defines the peculiarities of therapeutic properties and pharmacological quality indicators of Milk thistle. Milk thistle (Silybum marianum (L.) Gaertn.) - is a medicinal plant belonging to the genus of the family Asteraceae Dumort. There are 2 species of this plant in the world and 1 species in Turkmenistan. The purpose of the research work was to determine the qualitative indicators of milk thistle seeds by pharmacognostic studies and an innovative method of obtaining dry extract of milk thistle seeds growing in Turkmenistan. For the study, thistle seeds were brought from Sumbar gorge of Makhtumkuli etrap of Balkan province.
Keywords: Milk thistle, Silybum marianum, flavonignans, microscopy, spectrophotometry, chroma-tography.
