Сравнительное исследование методов стандартизации плодов расторопши silybum marianum Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.36+615.244+577.13 DOI 10.21685/2072-3032-2016-4-4

С. А. Буркуш, С. В. Чижов, Н. В. Фирстова, Н. Н. Глебова, А. В. Кузнецова

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТОДОВ СТАНДАРТИЗАЦИИ ПЛОДОВ РАСТОРОПШИ

SILYBUM MARIANUM

Аннотация.

Актуальность и цели. Расторопши пятнистой плоды Silybi mariani fructus -растительное сырье, используемое для производства лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) гепатопротекторного и антитоксического действия. Различный качественный состав флаволигнанов в сырье создает определенные трудности в его стандартизации. Целью работы было совершенствование подходов к стандартизации плодов расторопши пятнистой, сравнительная характеристика и гармонизация методик качественного и количественного анализа определения флаволигнанов.

Материалы и методы. Объектом исследования было лекарственное растительное сырье - плоды расторопши и шрот расторопши («Биокор»). Влажность сырья определяли на приборе Wile-65. Извлечение флаволигнанов из плодов расторопши проводили путем двух- и трехкратных экстракций 95 % этанолом при нагревании на кипящей водяной бане. Регистрацию спектров в УФ-области проводили на спектрофотометре СФ104. Реакцию комплексооб-разования флаволигнанов проводили с раствором AlCl3 (2 % в этаноле 96 %). В качестве стандарта использовали силибин (Merck).

Результаты. Проведены идентификация и количественное определение флаволигнанов в плодах расторопши и шроте расторопши («Биокор») спек-трофотометрическим методом. В качестве аналитических длин волн использованы 289 нм (собственное поглощение флаволигнанов) и 380 нм (поглощение комплекса флаволигнанов с AlCl3.

Выводы. Предложен метод идентификации флаволигнанов в плодах расто-ропши с использованием спектрофотометрии при двух длинах волн - 289 и 380 нм. Проведена сравнительная характеристика методов количественного определения флаволигнанов в плодах расторопши, установлено, что наиболее высокие показатели получаются при использовании метода ГФ13 (расчет по стандарту). Содержание флаволигнанов в плодах расторопши, выращенных в Пензенской области и регионах России, варьирует от 2,4 до 3,5 %, лекарственное растительное сырье соответствует фармакопейному качеству. Показано, что особая технология переработки плодов расторопши фирмы «Биокор» позволяет получать шрот с высоким содержанием флаволигнанов гепатопро-текторного действия.

Ключевые слова: расторопша, флаволигнаны, количественное определение, спектрофотометрия.

S. A. Burkush, S. V. Chizhov, N. V. Firstova, N. N. Glebova, A. V. Kuznetsova

A COMPARATIVE STUDY OF STANDARDIZATION METHODS FOR THE MILK THISTLE FRUIT (SILYBUM MARIANUM)

Abstract.

Background. The milk-thistle fruit (Silybum marianum L.) - is an excellent remedy to treat liver diseases. The aim of this work is to compare different spectrophotometry methods of milk-thistle fruit standardization.

Materials and methods. Milk thistle fruits were collected from farms in Penza region. The food supply made from milk thistle was designed by "Biokor" company. Extractions of milk thistle fruit flavonoids were performed by 95 % ethanol in a boiling water bath. Spectrophotometry assays in the ultraviolet region were used to identify and quantify milk thistle flavonoids.

Results. The article describes two spectrophotometry assays determining the flavonoid content in the milk-thistle. Application of both procedures to milk thistle has revealed different flavonoid contents.

Conclusions. Based on the own flavonoid absorption (279 nm) the suggested method showed higher flavonoid concentration then the method which involves measurement of flavonoid-aluminum chloride (AlCl3) complexation at 380 nm. The spectrophotometry assay based on aluminum chloride complex formation was successfully applied to flavonoids analysis in milk-thistle samples from different areas of Russia. The food supply from milk thistle designed by "Biokor" company have been proved to deliver a high amount of flavonoids.

Key words: milk-thistle, flavonoids, determination, spectrophotometry.

Введение

Расторопши пятнистой плоды Silybi mariani fructus - лекарственное растительное сырье, используемое для производства лекарственных препаратов и биологически активных добавок (БАД) гепатопротекторного и антитоксического действия. Silybum marianum легко культивируется промышленным образом в Пензенской области. Плоды расторопши пятнистой имеют богатый химический состав. Выделяют две группы фармакологически активных соединений расторопши. Первая группа - растительный флавоноидный комплекс с гепатопротекторной активностью. Гепатопротекторное действие фла-воноидов обусловлено их антиоксидантными, мембраностабилизирующими свойствами. Флавоноиды стимулируют синтез белка, что имеет большое значение для процессов регенерации в печени. Вторая группа - жирное масло, дерматопротекторное ранозаживляющее средство [1].

В настоящее время методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) установлено, что в плодах расторопши присутствует около десятка различных флаволигнанов. Наибольший интерес с точки зрения биологической активности представляют силибин, силидианин и силикристин (смесь этих веществ получила название «силимарин»), для которых установлена уникальная гепатопротекторная активность [2]. Показано, что различные популяции расторопши пятнистой, выращенные в разных регионах России и Европы, содержат флаволигнаны в различных количествах и соотношениях. Различный качественный состав флаволигнанов в сырье создает определенные трудности в его стандартизации [3].

Целью работы было совершенствование подходов к стандартизации плодов расторопши пятнистой, сравнительная характеристика и гармонизация методик качественного и количественного анализа определения флаво-лигнанов.

Материалы и методы

Объектом исследования было лекарственное растительное сырье -плоды расторопши, выращенные в Пензенской области и регионах России, и шрот расторопши («Биокор»). Плоды заготавливали в июле. Влажность сырья определяли на приборе Wile-65. Извлечение флаволигнанов из плодов и шрота расторопши проводили путем двух- и трехкратных экстракций 95 % этанолом при нагревании на кипящей водяной бане. Для методики идентификации и количественного определения суммы флаволигнанов были изучены УФ-спектры спиртовых извлечений из данного сырья. Регистрацию спектров проводили на спектрофотометре СФ104. Реакцию комплексообра-зования флаволигнанов проводили с AlCl3 (2 % раствор в этаноле 96 %). В качестве стандарта использовали силибин (Merck).

Результаты исследования и их обсуждение

1. Доказательство подлинности плодов расторопши. Качество плодов расторопши регламентируется фармакопейной статьей ФС.2.5.0035.15 (ГФ13). Обычно в нормативной документации на растительное сырье приводится определение количественного содержания биологически активных веществ, обусловливающих фармакологическое действие лекарственного растительного сырья. Для плодов расторопши в ГФ13 приведены нормы содержания групп биологически активных веществ: сумма флаволигнанов в пересчете на силибин не менее 2,4 %, жирного масла не менее 15 %, экстрактивных веществ извлекаемых 80 % спиртом не менее 4 %.

Силибин (рис. 1) - смесь двух диастереомеров - силибина А и силиби-на В - в соотношении, близком к 1:1. Сидидианин - изомер силибина. Эмпирическая формула силибина и силидианина: С25Н22О10, молекулярная масса -482,44.

он о

Силибин Силидианин

Рис. 1. Химическая структура силибина и силидианина

Флавоноиды ограниченно растворимы в воде и относительно термостабильны. Экстракцию флаволигнанов из плодов расторопши проводили 95 % этанолом при кипячении в течение 30 мин на водяной бане [4].

Новая Государственная фармакопея требует для идентификации флаволигнанов в плодах расторопши два этапа - спектрофотометрический анализ, который основан на определении максимума поглощения флаволигнанов (289 нм) и относительно трудоемкий метод тонкослойной хроматографии со свидетелем силибином. Мы предлагаем модифицированный спектрофото-метрический анализ спиртового извлечения из плодов расторопши - измере-

ние поглощения при двух длинах волн - 289 и 380 нм. Известно, что для фла-воноидов в УФ-спектре характерны собственные интенсивные полосы поглощения в области 240-290 нм. При реакции с AlCl3 образуются комплексные соединения за счет фенольных гидроксилов, хромофорная система фла-волигнанов меняется, что приводит к батохромному сдвигу основных максимумов поглощения (рис. 2).

б)

Рис. 2. Спектры поглощения флаволигнанов расторопши: а - собственное поглощение флаволигнанов расторопши, максимум поглощения - 279 нм; б - спектр поглощения комплексов флаволигнанов расторопши с AlCl3, максимум поглощения - 380 нм

Максимум собственного поглощения флаволигнанов расторопши -289 нм, при реакции с хлоридом алюминия наблюдали сдвиг максимума по-

глощения до 380 нм (рис. 2). Проведение реакции образования комплекса с AlCl3 не требует дорогостоящих реактивов и временных затрат, используется спиртовое извлечение из плодов расторопши, полученное ранее по официальной методике.

Таким образом, установлена аналитическая длина волны поглощения комплексного соединения флавоноидов расторопши с AlCl3, максимум поглощения - 380 нм. Представлялось интересным использовать спектрофото-метрию при 380 нм для количественного определения флаволигнанов в плодах расторопши.

2. Исследование возможности количественного определения флаволигнанов двумя спектрофотометрическими методами. Для определения суммы флаволигнанов в плодах расторопши были использованы два метода. Первый способ (метод ГФ 13 ФС.2.5.0035.15) основан на измерении поглощения флаволигнанов при 289 нм, второй - на измерении поглощения при длине волны 380 нм за счет способности флаволигнанов образовывать окрашенный комплекс со спиртовым раствором алюминия хлорида [5, 6]. Сравнительная характеристика основных стадий методик приведена в табл. 1.

Обнаружено, что в плодах расторопши, выращенной в с. Царевщино (Пензенская область), при расчете по стандарту (спектрофотометрия, длина волны 289 нм) количественное содержание флаволигнанов немного выше (4,5 %), чем при расчете по удельному показателю поглощения силибина (4,3 %).

При определении флаволигнанов по измерению поглощения комплексного соединения с алюминия хлоридом при длине волны 380 нм содержание флаволигнанов еще ниже - 3,5 % (табл. 2). Следует отметить, что все результаты процентного содержания флаволигнанов соответствуют требованиям ГФ13 к качеству плодов расторопши (не менее 2,4 %).

Мы предполагаем, что различные результаты содержания флаволигна-нов в плодах расторопши при использовании разных методов и формул расчетов обусловлены тем, что в спиртовом извлечении присутствуют как минимум 7 различных флаволигнанов [2]. Определение суммы флаволигнанов по удельному поглощению и стандарту индивидуального силибина может давать различные значения.

Фирма «Биокор» организовала безотходное производство БАД из плодов расторопши. Эти БАДы (плоды, масло и шрот расторопши) входят в серию продуктов «Здоровая печень». В технологии шрот расторопши «Биокор» отсутствует стадия экстракции флаволигнанов из шрота (классическая технология), поэтому шрот «Биокор» обладает всеми свойствами экстракта (гепатопротекторное действие). Полученный подобным образом шрот рас-торопши «Биокор» обогащен клетчаткой, очищающей кишечник, стимулирующей его работу, благоприятствующей развитию микрофлоры. Кроме того, шрот богат витаминами, биологически активными веществами, микро-и макроэлементами.

Обнаружено, что содержание флаволигнанов в шроте расторопши «Биокор» 4,1 %, что на 20 % выше, чем в плодах расторопши. Особая технология переработки плодов расторопши фирмы «Биокор» позволяет получать шрот с высоким содержанием флаволигнанов гепатопротекторного действия.

§

п> Q. о' Q_

m

О

rô"

о п>

S

П> О

0 Q_

Q

а.

1

п>

П> 3

П>

а.

о'

3'

П>

Таблица 1

Сравнительная характеристика методов количественного определения флаволигнанов в плодах расторопши

Стадии анализа Спектрофотометрия при 2X9 нм ГФ 13 ФС,2.5.0035.15 Спектрофотометрия при 380 нм [5]

1 а 3 4

1 На анализ плодов расторопши 1 г (сито 1 мм) 1 г

2 Нагревание на кипящей водяной бане с обр. холодильником в колбе на 250 мл, 30 мин 3 раза по 50 ;мл спирта 95 %, 1 раз 100 КШ спирта этилового 96 Ц, 2 раз - 80 мл спирта

3 Отстаивание нет 10 Мин

4 Спиртовое извлечение фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой в мерную колбу на 200 мл доводят спиртом 95 % до метки (раствор А) фильтруют в мерную колбу на:200 мл доводят спиртом 96 Щ до метки (раствор А)

5 Фотометрируемый раствор 1,0 мл раствора А в мерную колбу вместимостью 25 мл,, доводят объем а.иртом ш Ш л о метки (раствор Б) 2,0 мл раствора А и помещают в пробирку, в эту же пробирку помещают 0,6 мл раствор А1С13 и 2,4 мл спирта этилового 96 (раствор В)

Инкубация 30 мин

6 Раствор сравнения спирт 95 °... 2,0 мл раствора А, 0,2 мл >с.. уксусной кислоты и ?.,() мл спирта этилового 95 %

7 Длина волны .289 нм 380 нм

8 Удельный показатель поглощения 450 (289 нм, силибин) 444 (289 нм, сипимарин [б]) 81,5 (при 380 им) 67,5 (при 380 нм) силидианина [5]

ю ■Jb.

.О

Nj О l-i CTl

§ П>

о, с -С с I

0 *

с

П>

1 Q

С

о 43 п>

3

с ■с

П>

о *

Q 50

П> О, С -С С I Q

LO U1

СП

Окончание табл. 1

1 2 3 4

Сумма флаволигнанов в пересчете на силибин, в процентах (АЗ по стандартному раствору /4 ■ ад ■ 25 ■ 200 -1-100 ■ 100-Р Ад - а-!25-1-100'-(100-й7)'100' А - оптическая плотность раствора Б испытуемого раствора;,/4о - оптическая плотность раствора Б СО; силибина; а - навеска сырья, г; а0 - навесжа 1'(> си-либина, щР- содержание основного вещества в СО еядибина, /'% П' - влажность сырья, %

Сумма флаволигнанов, в пересчете на силибин в процентах (X) по удельному показателю пошоще ния силибина ,, Л-200-25-100

5

го те

о

3 §

го о; о

Е §

■с

П> £

О"

><

(и

0 ГО

те

О,

те

1 С Сс

О

го §

N

о *

с Сс 43 те

со С

0

1

С 2 те

тз

-ч

о

о

те

П>

о. <0

<5" о

-ч

те <3 о'

3

Таблица 2

Спектрофотометрическое определение суммарного содержания флаволигнанов в плодах расторопши пятнистой

Длина волны максимума поглощения Содержание флаволигнанов, "ь

Плоды расторопши 289 4,3 (по удельному показателю поглощения) 4,5 (по стандарту силибина).

Плоды расторопши 380 3,5*

Шрот расторопши «Биркор»- 381 4,1*

Примечание. * Расчет по удельному показателю поглощения силидианина.

3. Сравнение содержания флаволигнанов в плодах расторопши, культивируемых в различных регионах России. Наименьшее содержание флаволигнанов было определено по методике, основанной на измерении поглощения комплексного соединения с алюминия хлоридом. Способ отличается быстротой по сравнению с методикой ГФ13, так как предусматривает двухстадийную спиртовую экстракцию в течение 30 мин на кипящей водяной бане вместо трехстадийной. Этот метод и был использован для оценки содержания флаволигнанов в плодах расторопши, выращенной в Пензенской области и других регионах России. Все образцы урожая 2014 г. по качеству соответствовали требованиям ГФ 13 (сумма флаволигнанов в пересчете на силибин должна быть не менее 2,4 %). Все образцы плодов расторопши соответствуют данному показателю (рис. 3). Содержание флаволигнанов в плодах расторопши, выращенной в разных регионах России, варьируется в относительно широких пределах от 2,4 до 3,5 %. Такой полиморфизм связан с раз-нокачественностью семян и существованием хеморас у 5". marianum [3].

Рис. 3. Содержание флаволигнанов (%) в плодах расторопши, выращенной в различных регионах России (2014)

Наибольшее количество флаволигнанов силибина обнаружено в плодах расторопши, выращенных в г. Каменке (Пензенская область).

Заключение

Предложен метод идентификации флаволигнанов в плодах расторопши с использованием спектрофотометрии при двух длинах волн - 289 и 380 нм.

Проведена сравнительная характеристика методов количественного определения флаволигнанов в плодах расторопши, установлено, что наиболее высокие показатели получаются при использовании метода ГФ13 (расчет по стандарту).

Содержание флаволигнанов в плодах расторопши, выращенных в Пензенской области и регионах России, варьирует от 2,4 до 3,5 %, лекарственное растительное сырье соответствует фармакопейному качеству.

Показано, что особая технология переработки плодов расторопши фирмы «Биокор» позволяет получать шрот с высоким содержанием флаво-лигнанов гепатопротекторного действия.

Список литературы

1. Loguercio, C. Silybin and the liver: From basic research to clinical practice / C. Loguercio, D. Festi // World J. Gastroenterol. - 2011. - № 17 (18). - P. 2288-2301.

2. Куркин, В. А. Расторопша пятнистая - источник лекарственных средств (обзор) / В. А. Куркин // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - Т. 37, № 4. -С. 27-41

3. Щекатихина, А. С. Оценка содержания изомеров флаволигнанов расторопши пятнистой в гепатопротекторных препаратах / А. С. Щекатихина, Н. В. Гаври-ленко, В. П. Курченко // Вестник БГУ. Сер. 2. - 2010. - № 2. - С. 73-78

4. Государственная фармакопея Российской федерации. - XIII изд-е. - Т. III. - URL: http://193.232.7.120/feml/clinical_ref/pharmacopoeia_3/HTML/#594

5. Лекарственные растения Государственной фармакопеи. Фармакогнозия / под ред. И. А. Самылиной, В. А. Северцева. - М. : АМНИ, 2003. - 534 с.

6. Государственная фармакопея Республики Беларусь : в 3 т. Т. 3. Контроль качества фармацевтических субстанций / Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении ; под общ. ред. А. А. Шерякова. - Минск : Минский государственный ПТК полиграфии им. В. Хоружей, 2009. - 728 с.

References

1. Loguercio C., Festi D. World J. Gastroenterol. 2011, no. 17 (18), pp. 2288-2301.

2. Kurkin V. A. Khimiko-farmatsevticheskiy zhurnal [Chemical pharmaceutical journal]. 2003, vol. 37, no. 4, pp. 27-41

3. Shchekatikhina A. S., Gavrilenko N. V., Kurchenko V. P. VestnikBGU. Ser. 2 [Bulletin of BSU. Series 2]. 2010, no. 2, pp. 73-78

4. Gosudarstvennaya farmakopeya Rossiyskoy federatsii. XIII izd-e [State pharmacopeia of the Russian Federation. XIII edition]. Vol. III. Available at: http://193.232.7.120/feml/clinical_ref/pharmacopoeia_3/HTML/#594

5. Lekarstvennye rasteniya Gosudarstvennoy farmakopei. Farmakognoziya [Medicinal plants of State pharmacopeias. Pharmacognosy]. Eds. I. A. Samylina, V. A. Severtsev. Moscow: AMNI, 2003, 534 p.

6. Gosudarstvennaya farmakopeya Respubliki Belarus': v 3 t. T. 3. Kontrol' kachestva farmatsevticheskikh substantsiy [State pharmacopeia of the Republic of Belarus: in 3 volumes. Vol. 3. Pharmaceutial substances quality control]. Ed. by A. A. Sheryakov. Minsk: Minskiy gosudarstvennyy PTK poligrafii im. V. Khoruzhey, 2009, 728 p.

Буркуш Станислав Александрович технолог, ООО Фирма «Биокор» (Россия, г. Пенза, ул. Лермонтова, 3)

E-mail: info@biokor.ru

Burkush Stanislav Aleksandrovich Technologist, "Biokor" Ltd. (3 Lermontova street, Penza, Russia)

Чижов Сергей Владимирович управляющий, ООО Фирма «Биокор» (Россия, г. Пенза, ул. Лермонтова, 3)

E-mail: info@biokor.ru

Chizhov Sergey Vladimirovich Managing director, "Biokor" Ltd. (3 Lermontova street, Penza, Russia)

Фирстова Наталья Вадимовна

кандидат биологических наук, доцент, кафедра химии и теории и методики обучения химии, Педагогический институт имени В. Г. Белинского, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)

E-mail: nfirst@yandex.ru

Firstova Natal'ya Vadimovna Candidate of biological sciences, associate professor, sub-department of chemistry, theory and methods of teaching chemistry, Pedagogical Institute named after V. G. Belinsky, Penza State University (40 Krasnaya street, Penza, Russia)

Глебова Наталья Николаевна старший преподаватель, кафедра общей и клинической фармакологии, Медицинский институт, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)

E-mail: natali.glebova@gmail.com

Glebova Natal'ya Nikolaevna Senior lecturer, sub-department of general and clinical pharmacology, Medical Institute, Penza State University (40 Krasnaya street, Penza, Russia)

Кузнецова Анна Викторовна

кандидат химических наук, доцент, кафедра общей и клинической фармакологии, Медицинский институт, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)

E-mail: kuznetanna1@hotmail.com

Kuznetsova Anna Viktorovna Candidate of chemical sciences, associate professor, sub-department of general and clinical pharmacology, Medical Institute, Penza State University (40 Krasnaya street, Penza, Russia)

УДК 616.36+615.244+577.13

Сравнительное исследование методов стандартизации плодов расторопши Silybum marianum / С. А. Буркуш, С. В. Чижов, Н. В. Фирстова, Н. Н. Глебова, А. В. Кузнецова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2016. - № 4 (40). - С. 30-39. DOI 10.21685/2072-3032-2016-4-4