CC BY
120
ИННОВАЦИИ № 12 (110), 2007
Инновационные аспекты разработки нановакцин и диагностических тест-систем
А. Л. Гинцбург,
профессор, академик РАмН, вице-президент РАмН, директор института
В. Г. Лунин,
к. б. н., заведующий лабораторией биологически активных наноструктур
А. С. Карягина,
д. б. н., ведущий научный сотрудник лаборатории биологически активных наноструктур
Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук
Разработка новых технологий и подходов для создания безопасных, дешевых и высокоэффективных поливалентных вакцин является одной из важнейших задач современной медицинской науки. Мы предлагаем новый нанобиотехнологи-ческий подход производства вакцин, основанный на самосборке белковых компонентов на полисахаридной матрице. Использование аффинной самосборки лежит в основе высокоэффективной технологии одностадийной очистки и иммобилизации белка и конструирования нановакцины. Технология практически безынструментальна и характеризуется существенным удешевлением стоимости производства компонентов нановакцин и диагностикумов. Ожидается, что использование данной технологии приведет к повышению качества средств профилактики, лечения и диагностики инфекционных и онкологических заболеваний. На основе предлагаемой технологии в первую очередь будут разработаны вакцины для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка, листериоза, лептоспироза, а также многосайто-вые тест-системы для одновременного определения в крови специфических антител к инфекцион-
ным агентам вышеперечисленных особо опасных и социально значимых инфекций.
Development of new technologies and approaches for construction of safe, low cost and high effective polyvalent vaccines is of current importance. We present a new nanobiotechnological approach based on self assembling of protein components on polysaccharide matrix for vaccine production. Usage of affinity selfassembling technology will result in development of high effective onestage process of protein immobilization and purification and nanovaccine construction, which does not require any special equipment, and in essential reduction of prices for production of nanovaccines and testsystems components. This will stimulate the improvement of existing means for prophylaxis, medical treatment and diagnostics. Based on the proposed technology the vaccines for prophylaxis of whooping cough, diphtheria and tetanus, listeriosis, leptospirosis, as well as multisite testsystems for detection in blood of specific antibodies to the infection agents of cited dangerous and socially important diseases will be created.
Вакцины являются самым эффективным средством предупреждения инфекций. По данным Глобального альянса по вакцинам и иммунизации (GAVI), в год в мире регистрируется 14 млн смертей, связанных с инфекциями, из них около 3 млн обусловлены заболеваниями, которые могли быть предупреждены вакцинацией. В усло-
виях массовой иммунизации увеличивается объем и спектр используемых вакцинных препаратов, снижается заболеваемость соответствующими инфекциями (СDС, США) (табл. 1).
В то же время некоторые вакцинные препараты, дающие широкий спектр осложнений, дискредитируют саму идею вакцинации и затрудняют массовое
Таблица 1
Сравнение частоты заболеваний, предупреждаемых с помощью вакцин, и побочных эффектов вакцинации в США (данные СдС, Chen R.T, 2002).
Заболевание Число случаев заболеваний в год в довак-цинальную эру % снижений заболеваний к 2ОО1 г. Число случаев ПВО* в 2ОО1 г.
Дифтерия 175 885 99,99 2
Корь 503 282 99,98 108
Эпидемический паротит 152 209 99,80 226
Коклюш 147 271 96,30 5420
Паралитический полиомиелит 16 316 100 0
Краснуха 47 745 99,95 20
Синдром врожденной краснухи 823 99,8 2
Столбняк 1 314 97,9 27
Гемофильная инфекция тип В у детей до 5 лет 20 000 98,6 290
ВСЕГО случаев 1 064 854 99,43 6 095
ПВО (побочные эффекты вакцинации) 0 6095
ной необходимостью. Однако улучшить ситуацию с реактогенностью вакцины АКДС традиционными методами нельзя. Возможный вариант решения проблемы связан с конструированием вакцины, содержащей вместо инактивированной бактерии очищенные белковые компоненты коклюшной палочки, вызывающие защитный иммунитет.
Таблица 2
Частота серьезных побочных эффектов вакцинации (данные ВОЗ, 2001)
*ПВО — поствакцинальные осложнения
проведение прививок (табл. 2). Как видно из таблицы 2, иммунизация вакцинным препаратом, предупреждающая заболевания коклюшем, дифтерией и столбняком (АКДС), наиболее часто приводит к тяжелым поствакцинальным осложнениям.
данная вакцина состоит из инактивированного патогена — коклюшной палочки и двух очищенных инактивированных токсинов белковой природы — столбнячного и дифтерийного. При этом наиболее реактогенным компонентом АКДС следует признать инактивированную коклюшную палочку. Это связано с тем, что инактивированный патоген — полноразмерная клетка бактерии, кроме вакцинноценных компонентов, на которые возникает иммунный ответ, несет на поверхности большое количество соединений, не нужных для формирования иммунитета и даже опасных для организма (рис. 1).
В соответствии с действующим в России календарем прививок (приказ Минздрава РФ № 229 от 27.06.2001 г.) АКДС является самой частой по применению вакциной. В возрасте до 18 месяцев вакцинацию проводят 4 раза. В 7 и 14 лет проводят вакцинацию против дифтерии и столбняка. Взрослым рекомендуется проводить такую вакцинацию каждые 10 лет.
таким образом, проведение вакцинации АКДС в полном объеме и, возможно, распространение ее на более старшие возрастные группы является насущ-
Вакцина Клинические проявления Частота
БЦЖ Лимфаденит Остеит Диссиминированная БЦЖ инфекция 1:1ООО — 1:1О ООО 1:3000 —1:100 000 000 » 1:1 000 000
Гепатит В Анафилаксия 1: 6-900 000
Корь, краснуха, паротит Фебрильные судороги Тромбоцитопения Тяжелые аллергические реакции Анафилаксия Энцефалопатия 1: 3ООО 1: 3О ООО 1:100 000 » 1: 1 000 000 < 1:1 000 000
Живая поли- омиелитная вакцина Вакциноассоциированный полиомиелит ■ для первой дозы и иммунодефицитных лиц ■ для последующих доз 1:2,4-3,3 000 000 1:750 000 1: 1 000 000
Столбняк Неврит плечевого нерва Анафилаксия 0,5-1:1 000 000 1:1 000-1:2,5 000 000
АКДС Пронзительный крик Судороги Гипотензивно-гипо-респонсивный эпизод Анафилаксия Энцефалопатия 1:15-1ООО 1:175О-1:12 5ОО 1:1ООО-1:33 ООО 1:5О ООО 1-1:1 000 000
Рис. 1. Принципы конструирования
субъединичны нановакцин
ИННОВАЦИИ № 12 (110), 2007
ИННОВАЦИИ № 12 (110), 2007
По данным международной организации «Всемирный союз по вакцинам и иммунизации», в настоящее время отсутствуют эффективные вакцины для предупреждения таких болезней, как СПИД, туберкулез и малярия, от которых только в 2005 г. умерло около 5 млн человек. Многие используемые вакцины, подобно АКДС, несомненно, нуждаются в модернизации с использованием современных биотехнологических подходов, что может существенно снизить возможность осложнений, связанных с их применением. Кроме того, в последнее десятилетие увеличилась заболеваемость, обусловленная теми инфекциями, с которыми человечество ранее успешно боролось. Этому способствовало появление лекарственно устойчивых форм микроорганизмов, увеличение числа пациентов с иммунной недостаточностью, увеличение миграции населения и др.
Объем продаж мирового рынка вакцин в 2004 г. составил 9,9 млрд долларов США. В последние годы во многих странах мира проводится интенсивная разработка принципиально новых вакцин. Считается, что в ближайшие годы вакцинный сектор фармацевтической промышленности будет интенсивно развиваться и через 10 лет составит 30 млрд долларов США.
Хотелось бы подчеркнуть еще один аспект использования традиционной технологии производства вакцин. Традиционная технология связана с выращиванием и культивированием патогенных микроорганизмов — источников вакцинных компонентов, что определят необходимость обеспечения особых условий безопасности, для культивирования штаммов требуются дорогие питательные среды или специальные дорогостоящие куринные эмбрионы, выделение и очистка компонентов производится на основе сложных многостадийных процессов, требующих дорогого оборудования и сорбентов. При этом имеются многочисленные данные, свидетельствующие о том, что большинство поствакциналь-ных осложнений связано с недостаточной степенью очистки препаратов от яичных белков, компонентов клеток бактерий и вирусных частиц, а также антибиотиков, используемых в технологическом процессе наращивания патогенных штаммов.
Как в России, так и за рубежом имеется тенденция создания вакцин нового типа, так называемых субъединичных (нано) вакцин. Белковые компоненты таких вакцин получают на основе технологии рекомбинантных ДНК. При этом гены интересующих антигенов клонируют в непатогенные микроорганизмы (бактерии, дрожжи) и таким образом создают непатогенные продуценты рекомбинантных вакцинных белков. Примером такой вакцины является вакцина против гепатита Б, основной компонент которой — поверхностный антиген — производится в дрожжах. Очистка вакцинноценных компонентов от балластных дрожжевых белков, ДНК и РНК клетки-хозяина и токсичных липополисахаридов (в случае бактериального синтеза), а также формулирование этих компонентов в максимально иммуногенной и безопасной
форме представляет собой сложный многостадийный процесс. Наработка компонентов диагностикумов — также достаточно сложный технологический процесс.
В процессе производства современных конъюгированных вакцинных препаратов и диагности-кумов используются различные подходы для иммобилизации белков, как правило, основанные на химической пришивке. Эти подходы также многостадийны, трудоемки, дорогостоящи и небезопасны, с точки зрения обеспечения экологической безопасности производства.
В институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук предложен принципиально новый подход получения компонентов нановакцин и диагностикумов. инновационным аспектом данного подхода является разработанная учеными института технология очистки рекомбинантных (генно-инженерных) белков путем их спонтанного связывания и иммобилизации на полисахаридсодержащих носителях (сорбентах). Способность связываться с такими сорбентами придает рекомбинантным белкам встроенный в них специальный белковый модуль — полисахаридсвя-зывающий домен (ПСД). ПСД самопроизвольно и высокоэффективно взаимодействует с полисахаридсодержащими сорбентами по принципу «ключ к замку». При этом исходные антигенные свойства второго (основного) домена рекомбинантного белка при присоединении ПСД не нарушаются. Схема строения двухкомпонентного белка и его взаимодействия с полисахаридной матрицей (сорбентом) показана на рис. 2. Двухкомпонентные рекомбинантные белки
Рис. 2. Схема строения двухкомпонентного белка и его взаимодействия с полисахаридной матрицей (сорбентом). Справа показана пространственная структура (шариковая модель) рекомбинантной конструкции, состоящей из вакцинного белка-антигена, соединительного спейсера и полисахаридсвязывающего белка
нарабатываются с использованием непатогенных лабораторных штаммов бактерии. Использование технологии ПСД позволяет сделать процесс иммобилизации и очистки белковых антигенов — компонентов вакцин и диагностикумов — одностадийным и практически безынструментальным. Способ получения
свободных и иммобилизованных белков на основе технологии ПСД оригинален, высоко технологичен и получил высокую оценку при обсуждении с экспертами различных научно-исследовательских центров и компаний-производителей. Кроме того, технология ПСД обеспечивает экологическую безопасность производства, поскольку при этом снимается необходимость использования патогенных штаммов бактерий и вирусов и токсичных химических реагентов.
Предлагаемые для использования в качестве сорбентов полисахариды и продукты их модификации обладают низкой стоимостью и многообразием форм: сферическая, линейная, пленочная. Технологии получения различных форм сорбентов из целлюлозы, хитина, хитозана, различных видов гликанов достаточно просты и эффективны. Аффинное взаимодействие ПСД с соответствующим сахаросодержащим полимером характеризуется высокой прочностью, стабильным контактом в течение продолжительного срока в широком диапазоне растворов с различной концентрацией соли, кислотностью (pH 4-11) и температурой (0-70°С).
Следующие свойства наночастиц из полисахаридов позволяют считать их перспективными, с точки зрения использования в качестве адъюванта для вакцин, усиливающего их иммуногенные свойства:
• Препараты полимерных полисахаридов нетоксичны, биосовместимы и биодеградируемы в организме человека.
• Полимерные сахара (хитин, глюкан, пептидог-ликан) или их производные обладают иммуномодулирующей активностью, связанной (а) с наличием специализированных рецепторов на поверхности клеток человека, распознающих их структуру и запускающих неспецифический иммунный ответ воспалительного типа, и (б) со способностью доставлять вакцинный компонент к клеткам иммунной системы.
• Вакцинный белок-антиген, имеющий в своем составе ПСД, связывается с сорбентом очень прочно, но не ковалентно. Это способствует постоянному, но медленному выходу антигена из комплекса с сорбентом за счет естественной диссоциации, обеспечивая тем самым пролонгированное взаимодействие компонентов вакцины с иммунной системой организма (депонирование), достаточное для индукции напряженного и продолжительного иммунного ответа.
• Специфическое взаимодействие ПСД с сорбентом может обеспечить очень высокую плотность упаковки белка-антигена на микрочастицах, что, в свою очередь, позволит уменьшить объем препарата для вакцинации и снизить вероятность возникновения нежелательных побочных реакций.
• использование для иммунизации наночастиц полимерных сахаров, сравнимых по размерам с микробными частицами, с прикрепленными к ним антигенами должно способствовать усиле-
нию иммунного ответа за счет эффекта «укрупнения — полимеризации» вакцинного компонента. В природе размер микробных частиц варьирует от размеров вирусов (40 нм и больше) до размеров самых крупных бактерий и грибов (1000 нм и больше). Частицы именно такого размера организм человека воспринимает в качестве мишеней, на которые должно быть направлено действие иммунной системы.
Предлагаемый подход состоит в создании нано-метровых вакцинных конструкций — нановакцин, которые содержат вакцинноценные белки, представленные во множестве копий на поверхности частиц размером 40-100 нм (рис. 1). Такие вакцинные наночастицы будут обладать безопасностью очищенных и синтетических вакцин и эффективностью, сравнимой с убитыми и даже живыми вакцинами.
Рис. 3. Принцип конструирования поливалентных нановакцин
хотелось бы подчеркнуть, что предлагаемая технология получения нановакцин позволяет создавать поливалентные препараты вакцин, защищающие одновременно от широкого спектра социально значимых или особо опасных заболеваний (рис. 3). Технология чрезвычайно лабильна и ввиду модульности компонентов позволяет легко модифицировать формулу вакцины в зависимости от конкретной эпидемиологической ситуации. Это придает такому способу получения вакцин особые преимущества при создании вакцин к патогенам с быстро меняющимися антигенными свойствами, например к вирусу гриппа.
Следует отметить, что иммунизация, основанная на применении сахаросодержащих сорбентов, впервые в мире была предложена А. Е. Гурвичем, работавшим в институте им. Н. Ф. Гамалеи с 1961 по 1986 год. им впервые были химически пришиты к целлюлозе, крахмалу и сефарозе вакцинные белки бактерий и изучены свойства полученных конъюгатов для стимуляции синтеза антител. Таким образом, именно в институте им. Н. Ф. Гамалеи выполнены пионерские работы в данной области.
ИННОВАЦИИ № 12 (110), 2007
ИННОВАЦИИ № 12 (110), 2007
Данная технология может быть также использована для разработки нового поколения иммунологических диагностикумов — белковых биочипов, основанных на присоединении к подложке из целлюлозы рекомбинантного белка, состоящего из антигена (антитела) и целлюлозосвязывающего домена (ЦСД). Преимуществом таких белковых биочипов является то, что они не требуют никаких химических реагентов для иммобилизации антигена на подложке. Эта процедура обеспечивается за счет самопроизвольного взаимодействия ЦСД с целлюлозосодержащим носителем подложки. Следует подчеркнуть, что исследуемый антиген будет расположен относительно поверхности не вероятностно, а ориентирован строго оппозитно, поскольку связывание с подложкой (и ориентирование антигена) будет происходить с помощью ЦСД. Микрочипы на основе антигенов, соединенных с ЦСД, могут быть использованы для обнаружения специфических антител в биологических жидкостях. Аналогичным образом микрочипы на основе прикрепленных к подложке одноцепочечных антител к микроорганизмам могут быть использованы для обнаружениия патогенов в организме человека и в окружающей среде. Такие биочипы могут иметь различный формат — представлять собой планарные биочипы-стрипы, суспензионные биочипы, суспензионные чипы с магнитной сепарацией и др.
Результатом реализации предложенной идеи будет создание принципиально новой технологии производства компонентов кандидатных вакцин и диагностикумов, обеспечивающей низкую себестоимость, экологическую безопасность и единую технологическую схему производства, а также повышающей качество и улучшающей потребительские свойства вакцинных и диагностических препаратов.
Предложенным способом в ближайшее время планируется получить кандидатные генно-инженерные субъединичные нановакцины для профилактики коклюша, дифтерии и столбняка, туляремии, листе-риоза, лептоспироза, сибирской язвы, онкологических заболеваний — папилломы — и многосайтные диагностикумы типа биочипов, обеспечивающие одновременное тестирование в анализируемом материале специфических антител к возбудителям вышеперечисленных и других особо опасных и социальнозначимых инфекций.
Социально-экономические эффекты от использования возможных объектов для коммерциализации, основанных на результатах реализации предложенной технологии, будут заключаться в следующем:
• появление на рынке дешевых и эффективных профилактических и диагностических средств нового поколения будет способствовать улучшению качества жизни и здоровья населения, в особенности малообеспеченных слоев, для которых в настоящее время использование современных
дорогостоящих препаратов и методов анализа является недоступным;
• внедрение в медицинскую практику новых дешевых высокоэффективных вакцин приведет к общему оздоровлению населения, в результате чего сократится заболеваемость и снизится частота хро-низации заболеваний, в частности, у трудоспособной части населения. Это приведет к повышению качества и производительности труда, выполнению заданий к поставленному сроку, увеличению обьемов производства. Экономические расчеты показывают, что один рубль, вложенный в вакцинацию, дает экономический эффект от 2 до 25 рублей за счет перечисленных выше эффектов;
• внедрение в практику безынструментальной и не использующей токсичных реагентов и патогенных штаммов бактерий и вирусов схемы производства будет способствовать совершенствованию технологических процессов, с точки зрения повышения производственной безопасности (включая экологическую) при производстве вакцин и диагностикумов;
• предлагаемая технология предполагает практически полное извлечение целевых белков из бактериальных экстрактов таким образом, что в результате повышается комплексность и глубина переработки сырья, благодаря чему будет достигнуто значительное сокращение отходов производства;
• предлагаемые подходы позволят добиться существенного снижения материало- и энергоемкости производства;
• предлагаемая технология предполагает повышение уровня автоматизации производства вакцин и диагостикумов;
• предлагаемая технология необычайно лабильна, позволяет по единой технологической схеме получать самые разнообразные продукты, что будет обеспечивать гибкость производства; простота технологии, при которой очистка и иммобилизация продукта производится в одну стадию, будет способствовать сокращению производственного цикла.
Таким образом, предлагаемые для разработки
нановакцины характеризуются следующими свойствами:
— Нановакцины практически безопасны, поскольку содержат только вакцинноценные компоненты.
— Нановакцины нетоксичны, биосовместимы и био-деградируемы в организме.
— Самосборка компонентов вакцины решает проблему очистки, иммобилизации и концентрирования компонентов, обеспечивает стандартность получаемого продукта.
— Технология нановакцин позволяет получать многокомпонентные вакцины, защищающие одновременно от широкого спектра социально значимых или особо опасных заболеваний.
