CC BY
278
Перспективы создания вакцин нового поколения1
Представляем вашему вниманию третью часть «Прогноза в области создания вакцин нового поколения для вакцинопрофилактики и вакцинотерапии инфекционных и неинфекционных болезней». Первые две части прогноза были опубликованы в журнале «Ремедиум» №№8,9, 2005. Полностью текст «Прогноза» опубликован на сайте http://www.remedium.ru
В настоящее время создание новых вакцин идет по пути усовершенствования классических и создания новых технологий на основе достижений геномики и про-теомики.
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ КЛАССИЧЕСКИХ ВАКЦИН
Работа ведется в нескольких направлениях:
1. Использование в качестве носителя анатоксинов с целью повышения им-муногенности бактериальных полисахаридов. В 2000 г. лицензирована семивалентная полисахаридная пневмококковая вакцина на основе дифтерийного анатоксина.
2. Создание поликомпонентных вакцин. Актуальность таких конструкций продиктована стремлением уменьшить число инъекций, получаемых ребенком, и снизить таким образом риск заражения вирусом гепатита В или ВИЧ-1, а также минимизировать затраты на организацию прививок. В 2000—2003 гг. зарегистрированы АКДС-вакцина с цельноклеточным коклюшным компонентом, объединенная с рекомбинантной вакциной против гепатита В; АКДС-вакцина с бесклеточным коклюшным компонентом, в которую включены рекомбинантная гепатитная В вакцина и
инактивированная полиомиелитная вакцина. В 2001 г. лицензирована комбинированная вакцина против гепатита А (инактивированная) и гепатита В (рекомбинантная). В Европе зарегистрированы две шестивалентные вакцины против дифтерии, столбняка, коклюша, полиомиелита (инактивированная), гепатита В и H. influenzae. При испытании на добровольцах эта вакцина вызывала более слабый гуморальный ответ на полисахарид H. influenzae. Поэтому в США эта вакцина не была признана пригодной для практики.
3. Возвращение к разработкам прошлого. В 2003 г. лицензирована трехвалентная гриппозная вакцина из холодоадаптированных температурочувствительных мутантов. Вакцина предназначена для интраназального применения.
МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ ДОСТИЖЕНИЙ | МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ
В течение практически 20 лет для создания новых вакцин использовали и используют рекомбинантные ДНК-технологии. Начало XXI века ознаменовалось активным развитием технологии по конструированию вакцин на основе достижений геномики и про-теомики.
Результаты использования рекомбинантных ДНК-технологий. Разные варианты рекомбинантной технологии использовали для создания вакцин против многих бактерий, вирусов и паразитов, патогенных для человека. Была изучена эффективность живых рекомбинантных вакцин, рекомбинантных белков, пептидов, рекомбинантных векторов и ДНК-вакцин.
В практику пока вошли только три препарата: рекомбинантная вакцина против гепатита В, рекомбинантная вакцина против болезни Лайма и детоксицированный коклюшный токсин, который включен в состав АКДС-вакцины, применяемой в Италии.
В настоящее время стало очевидным, что в большинстве случаев с помощью рекомбинантных технологий получают препараты, обладающие слабой иммуногенностью. Современная иммунология объясняет слабую иммуногенность продуктов, получаемых с помощью рекомбинантных технологий, тем, что они лишены па-тоген-ассоциированных молекулярных структур, распознавание которых необходимо для запуска ответа сначала врожденного иммунитета, а затем развития адаптивного иммунного ответа.
Прогнозируется, что рекомбинантные вакцины получат широкое применение в практике только тогда, когда для применения у людей будут лицензированы новые адъюванты, потенцирующие антигенную активность этих вакцин.
ДНК-вакцины. За последние 10 лет в вакцинологии сформировалось новое направление, основанное на принципе, когда в организм вводится не белок, а нуклеиновая кислота (ДНК или РНК). Это направление называют «генетической иммунизацией», «вакцинацией нуклеиновыми кислотами»,
1 Авторы прогноза: Воробьев А.А., д.м.н., проф., академик РАМН, руководитель кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития РФ; Егорова Н.Б., д.м.н., проф., ведущий научный сотрудник Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН; Захарова Н.С., к.м.н., руководитель лаборатории Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН; Курбатова Е.А., д.м.н., руководитель лаборатории Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН; Семенов Б.Ф., д.м.н., проф., директор Института вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН; Гинцбург А.Л., д.б.н., проф., академик РАМН, директор Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН; На-родицкий Б.С., д.б.н., проф., заместитель директора по научной работе Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН; Семенова И.Б., д.м.н., ведущий научный сотрудник Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН; Зверев В.В., д.б.н., проф., академик РАМН, директор Института вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе РАМН; Киселевский М.В., д.б.н., проф., руководитель лаборатории Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.
КОНЪЮНКТУРА И ИССЛЕДОВАНИЯ
51
«ДНК-вакцинацией» и связывают с этим направлением революционные изменения в вакцинологии ближайшего будущего. Этот новый подход достаточно прост, дешев и, самое главное, дает возможность унифицировать методические подходы. После разработки относительно безопасных векторных систем, повышения эффективности доставки нуклеиновых кислот в ткани и обнаружения возможности длительной (до года) экспрессии чужеродной ДНК в трансформированных клетках in vivo стал ясен потенциал этой технологии в генотерапии и создании вакцинных препаратов. В 1993 г. было показано, что ДНК-вакци-нация формирует полноценный иммунный ответ, т.е. приводит к образованию антител (гуморальный ответ) и цитотоксических Т-лимфоцитов (клеточный ответ), и обеспечивает у животных высокий уровень защиты от вирусной инфекции.
Однако, прежде чем ДНК-вакцинация войдет в медицинскую практику, следует решить целый ряд вопросов, связанных с безопасностью введения таких препаратов в организм человека, изучить длительность индуцируемого ими иммунитета и последствия для иммунной системы нового способа представления антигена.
В настоящее время разработаны и испытываются ДНК-вакцины против инфекций, вызываемых вирусами гепатитов В и С, вирусом гриппа, вирусом лимфоцитарного хориоменингита, вирусом бешенства, вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом японского энцефалита, а также возбудителями сальмонеллеза, туберкулеза и некоторых паразитарных заболеваний (лейшманиоз, малярия). Выбор инфекций связан не только с их высокой актуальностью для человечества, но и с безуспешными попытками создать надежные вакцинные препараты классическими, широко используемыми в настоящее время методами. ДНК-вакцинация представляется одним из самых перспективных направлений в борьбе с раком.
Генетические вакцины, базирующиеся на вирусных и бактериальных
векторах. Данный подход предусматривает использование природного тропизма вектора (вируса или бактерии) по отношению к определенным типам клеток, что существенно увеличивает адресность доставки необходимой генетической информации и может быть использовано в терапевтических целях.
История использования вирусов в качестве вакцинных векторов насчитывает уже более десятка лет. За это время определились основные векторные системы, среди которых наибольшую популярность получили покс- и аденовирусные векторы (Ад).
Другим активно развивающимся направлением является генетическая вакцинация, базирующаяся на использовании бактериальных векторов. Главными преимуществами таких векторов являются их способность индуцировать гуморальный ответ в слизистых оболочках, что имеет первостепенную значимость при целом ряде заболеваний, а также возможность использования их для пероральной иммунизации. В качестве экспериментальных векторных систем были испытаны аттенуированные штаммы шигелл, сальмонелл и листерий.
Оценивая эффективность генетических вакцин, базирующихся на бактериальных векторах, следует отметить, что это, несомненно, перспективное направление требует дальнейшего изучения как с точки зрения его эффективности, так и безопасности.
Для всех генетических вакцин, базирующихся на вирусных и бактериальных векторах, существенным ограничением может стать наличие предсу-ществующего иммунитета. Преодоление этого негативного для иммунизации фактора возможно путем использования в качестве векторов микроорганизмов, относящихся к другим серо-типам.
Обратная вакцинология и протео-мика. Безуспешные попытки создания новых вакцинных препаратов против некоторых инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ-инфекция, гепа-
тит С, малярия, стрептококковая инфекция, а также бурное развитие в последнее десятилетие геномики, биоинформатики и протеомики привело к возникновению совершенно нового подхода к созданию вакцин, получившего название «обратная вакцинология» («reverse vaccinology»).
В современной литературе используют два понятия, характеризующие протеомику: функциональная и
структурная протеомика. Функциональная протеомика описывает количественные и качественные изменения при экспрессии белков во время дифференциации, пролиферации и сигнализации клеток; сопоставляет эти изменения с экспрессией генов.
Структурная протеомика идентифицирует молекулярные структуры, т.е. аминокислотные последовательности белковых молекул, вовлеченных в конкретный процесс, и соотносит эти данные с информацией об идентифицированных генах.
Предложенный термин «обратная вакцинология» четко выражает суть нового технологического приема. Если раньше при создании кандидатов на роль вакцин шли по нисходящей — от целого микроорганизма к его составляющим, то теперь предлагается противоположный путь — от генома к его продуктам.
Другим важнейшим критерием для отбора антигенов является анализ транскрипционной активности отдельных генов патогена, используя изучение микропостроения ДНК. Цель этой технологии — одновременное измерение уровней синтеза мРНК всех продуктов генов, экспрессирующихся в живой клетке. Для этих целей используется целый ряд методов, суть которых заключается в том, что на нейтральных носителях с помощью специально синтезированных фрагментов ДНК исследуются все возможные рамки считывания исследуемого патогена.
Третий подход к отбору кандидатов на роль вакцин базируется на проте-омной технологии, методы которой позволяют в значительной мере детализировать количественную и качест-
52
ПЕРСПЕКТИВЫ СОЗДАНИЯ ВАКЦИН НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ
венную характеристику белков в различных клеточных компонентах микроорганизма. В настоящее время разработан целый ряд методов выделения очистки и исследования белковых молекул. В протеомике используются практически все известные методы количественного и качественного анализа белков, начиная с обычного и двухмерного электрофореза, хроматографии, которые могут дать только предварительные характеристики молекулярной массы и количества белка в клетке. Однако полный переворот в протеомике произвел метод масс-спектрографии и его различные модификации. С помощью этого метода можно сейчас дать полную количественную и качественную характеристику белковых продуктов, определить принадлежность белка к той или иной группе, указать его локализацию в клетке.
Используя эти три стратегии, можно отобрать тот пул генов (белков), которые представляют определенный интерес для создания вакцинного препарата. Как правило, этот пул включает около 20—30% всех генов (белков) бактериального генома.
Эта отобранная группа нуждается в дальнейшей проверке на возможность вызывать протективный ответ в организме. Для этого необходимо экспрессировать отобранный антиген в различных гетерологичных системах и очистить его в необходимых количествах, для иммунизации животных.
Возможность идентифицировать сотни новых потенциальных кандидатов в вакцинные препараты, используя данные о полной геномной последовательности микроорганизма, может полностью революционизировать вак-цинологию.
Обратная транскрипция (reverse transcription). В последнее время довольно часто для подготовки вакцинных штаммов различных микроорганизмов прибегают к давно разработанной методике «сайт-направ-ленного мутагенеза». Для того чтобы получить аттенуированный штамм микроорганизма, в нуклеотидную по-
следовательность его генома искусственно вносят точечные мутации, не влияющие на антигенную структуру, но изменяющие другие свойства вируса (инфекционность, способность адаптации к росту на определенных линиях клеток и др.). Чтобы изменить нуклеотидную структуру какого-либо гена, искусственно синтезируют олигонуклеотиды, практически повторяющие последовательность гена с необходимой мутацией, и в определенных условиях синтезируют новый ген с необходимыми свойствами. Либо клонируют мутантный ген в геноме возбудителя. Именно таким способом в настоящее время предлагают создавать вакцинный препарат против вируса птичьего гриппа с антигенной структурой ЩШ. Имеются сообщения, что потребовалось всего 30 дней для создания методом обратной транскрипции кандидата в посевной штамм, планируемый для производства вакцины против ожидаемого пандемического вируса гриппа.
СПОСОБЫ УСИЛЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ПРОДУКТОВ
В настоящее время ни у кого не вызывает сомнения тот факт, что полученные методами ДНК-рекомбинации белки обладают слабой иммуногенно-стью. Прогнозируется, что продукты обратной вакцинации также будут демонстрировать недостаточную анти-генность. Поэтому разработка способов усиления иммуногенной активности генно-инженерных продуктов рассматривается как один из ключевых моментов развития новой вакци-нологии. Разработка идет в двух направлениях: создание и апробация разнообразных адъювантов и конструирование систем доставки антигена в организм.
Адъюванты. На протяжении многих десятилетий единственным адъювантом, применявшимся при создании вакцин, были гидроокись и фосфат алюминия. Однако их использование при конструировании новых вакцин, особенно тех, которые должны стиму-
лировать развитие иммунного ответа по №-1 типу, ограничено.
В России создан и разрешен для применения в практике биодеградируе-мый полимер с выраженной адъювантной активностью, получивший название полиоксидоний.
Весьма активно изучаются адъюванты микробного происхождения и их синтетические аналоги. Интерес к этой группе адъювантов обусловлен тем, что они взаимодействуют с ^эИ-подобными рецепторами клеток врожденного иммунитета и запускают процесс формирования адаптивного иммунитета.
Много внимания уделяется адъювантам, стимулирующим иммунный ответ слизистых покровов (мукозальные адъюванты).
В качестве адъювантов испытывают разнообразные биологически активные молекулы эндогенного происхождения. К ним относятся белки теплового шока (БТШ) и различные ци-токины.
Начаты клинические испытания индивидуальной противораковой вакцины, в состав которой входят пептиды опухоли конкретного пациента и БТШ.
Имеется ряд проблем, без решения которых внедрение новых адъювантов в практику невозможно. Для адъювантов, планируемых для конструирования оральных вакцин, необходимо убедиться, что они не нарушают толерантность кишечника к пищевым аллергенам.
Системы доставки антигенов.
Способность доставлять генно-инженерные продукты антиген-предъяв-ляющим клеткам выявлена у значительной группы соединений. К ним относятся микрочастицы, липосомы и виросомы. Помимо функции доставки антигена, эти соединения обладают адъювантной активностью. Кроме того, они способны доставлять и адъюванты. Наибольшее внимание сейчас привлекают водно-масляный адъювант МБ59 и иммуностимулирующие комплексы (КСОМ), а также виросомы.
