CC BY
51
PEMEOULJM 2007 март
ВОПРОСЫ ПОТРЕБЛЕНИЯ ЛС
Д.ЮЛОГУНОВ, к.б.н., Б.С.НАРОДИЦКИЙ, д.м.н., проф., АЛ.ГИНЦБУРГ, академик РАМН, вице-президент РАМН, ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН
Молекулярно-генетические технологии
Мировое сообщество постоянно находится в ожидании возникновения новых эпидемий или даже пандемий (примером может служить мощный общественный резонанс, связанный со вспышками таких инфекций, как SARS, птичий грипп, сибирская язва, эбола и др.), в связи с чем разработка современных средств защиты от патогенов является одной из важнейших его задач.
Одним из наиболее надежных способов защиты населения от патогенов является вакцинация. На сегодняшний день созданы вакцины против 34 социально значимых инфекций. Применение этих вакцин в медицинской практике привело к снижению уровня заболеваемости дифтерией, корью, столбняком, туляремией, полиомиелитом и явилось причиной исчезновения такой опасной инфекции, как оспа. Однако, несмотря на очевидные успехи вакцинопрофилактики, созданы только 34 вакцины, тогда как для остальных более чем 400 известных патогенов человека эффективных превентивных средств пока не создано.
ЗАЩИТЫ ОТ ПАТОГЕНОВ
По данным ВОЗ около 11 млн. (19%) из 57 млн. человек, умерших в 2002 г., погибли от инфекционных заболеваний [WHO, 2004]. Такие впечатляющие масштабы воздействия патогенов на человеческую популяцию объясняются как минимум двумя причинами. Перенаселенность территорий и развитость транспортных коммуникаций создают благоприятные условия для быстрого распространения особо опасных инфекций не только в пределах одного или нескольких соседствующих государств, но и на географически отдаленных территориях.
Как известно, эффективность вакцинации связана с индукцией протективно-го гуморального и/или клеточного иммунного ответа, который в свою очередь определяется особенностями структуры антигенов патогенов, против которого происходит вакцинация, а также характером взаимодействия микроорганизма с системой врожденного иммунитета. В настоящее время успешно используются вакцины против патогенов, вызывающих остро текущие инфекции. Для латентных или хронических заболеваний, вызываемых такими возбудителями, как ВИЧ, герпес-вирус человека, вирус гепатита С, микобактериями туберкулеза и др., а также для болезней, вызываемых микроорганизмами, характеризующимися внутривидовой изменчивостью (серологические варианты, антигенный дрейф или сдвиг, смена вариантов специфических
New molecular and genetic technologies of protection against pathogenes are considered. According to the results of the current clinical trials, we assume that manufacturing of new medicines for genetic immunization against rabies and HPV (human papilloma virus) is to be started in 3 to 5 years, and genetic vaccines against malaria and tuberculosis will be available in 6 to 8 years.
D. LOGUNOV, B. NARODITSKY, A. GINTSBURG, Gamaleya Research Institute for Epidemiology and Microbiology. The molecular and genetic technologies of protection against pathogenes.
антигенов), эффективных профилактических вакцин не создано. Очевидно, что для получения превентивных препаратов против этих инфекций необходимо детальное понимание биологии и патогенеза каждого конкретного возбудителя и разработка индивидуальных подходов создания профилактических и терапевтических препаратов. Успехи в таких областях знаний, как молекулярная биология, иммунология и микробиология, способствовали разработке новых и перспективных направлений защиты от патогенов. Особого внимания заслуживают следующие три направления: 1) генно-инженерные профилактические вакцины и терапевтические средства защиты от патогенов, 2) иммуномодуляторы, способные активировать систему иммунитета через активацию Толл-подобных рецепторов, 3) средства пассивной иммунизации (гуманизированные моноклональные антитела). Генно-инженерные вакцины подразделяются на 2 типа: субъединичные (про-тективные антигены различных возбудителей, экспрессированные в дрожжах или Е.соН) и генетические. «Генетические» вакцины в свою очередь делятся на ДНК-вакцины и вакцины (рис. 1), базирующиеся на вирусных и бактериальных векторах (реже в качестве системы экспрессии используются растительные клетки). В отличие от большинства традиционных инактивированных вакцин, «генетические» вакци-
ЭКОНОМИКА И МАРКЕТИНГ. ВОПРОСЫ ПОТРЕБЛЕНИЯ ЛС
21
март 2007 РЕМШ1ШМ
Различные стратегии получения генно-инженерных вакцин
ГЕНОМ ВОЗБУДИТЕЛЯ ИНФЕКЦИИ
Ген протективного антигена (целевой ген)
Клонирование целевого гена в плазмидный вектор
Синтез антигена в клетках растений
Различные стратегии получения генно-инженерных вакцин базируются на использовании приемов клонирования генов, ответственных за синтез различных белков патогена, в плазмидные векторы, которые обеспечивают реализацию необходимой генетической информации в микроорганизме-про-дуценте (целевой белок, выделенный из продуцента в дальнейшем используется для вакцинации) или в вакцинируемом организме (реже в качестве системы экспрессии используются растительные клетки). Промотор — участок связывания РНК-полимеразы. Используется для инициации транскрипции целевого гена. PolyA — сигнал полиаденилирования. Является необходимым элементом для терминации транскрипции и полиаденилирова-ния транскрипта целевого гена.
ны способны индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ, а также могут использоваться не только в превентивных, но и в терапевтических целях для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний, аллергических состояний, злокачественных новообразований.
Опыт работы исследователей различных стран с кандидатны-ми генно-инженерными вакцинами показывает, что наибольший протективный эффект наблюдается при комбинированном способе иммунизации (прайм-буст иммунизация). Первый этап — прайми-рование иммунного ответа (индукция клеточного иммунитета), второй этап — бустирование иммунного ответа (ин-
дукция гуморального иммунного ответа). При этом возможны различные комбинации прайм-буст агентов (ДНК-вакцина — рекомбинантный белок, ДНК-вакцина — рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный аденовирус — рекомбинантный белок и др). Активация сильного иммунного ответа при использовании системы прайм-буст иммунизации кандидатными генно-инженерными вакцинами была показана по отношению к патогенам, вызывающим туберкулез, герпес, малярию, СПИД и др.
В настоящее время в США и странах Европы десятки генно-инженерных вакцин находятся в различных фазах клинических исследований. Из них две находится на 3-й фазе клинических испытаний (вакцины против ВИЧ и папилломы). Три генно-инженерные вакцины (против вируса гепатита В, бор-релиоза и вируса бешенства) используются в медпрактике для вакцинации. Такое небольшое количество утвержденных и лицензированных генно-инженерных вакцин объяснить достаточно просто. История создания генно-инженерных вакцин насчитывает около 20 лет. С учетом того, что предклиничес-кие и клинические испытания новых вакцин занимают более 10 лет, очевидно, что в настоящий момент многие
22 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ ЗАЩИТЫ ОТ ПАТОГЕНОВ
ршшиим 2007 март
таблица® Стадии разработки и внедрения
генно-инженерных вакцин
Заболевание или патоген Носитель целевого гена Фаза клинических испытаний
РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ
Лайм-боррелиоз OspA (применяется)
Гепатит В HbsAg (применяется)
Гепатит В+ адъювант (CpG) HbsAg 2
Малярия LSA1, 3, MSP AMA1-антигены 1
Герпес типа 2 гликопротеин D (применяется)
ВИЧ gp120 1
Вирус Эбштейна-Барра поверхностный антиген 2
Вирус папилломы гибридный полипептид hsp-E7 3
H.pyLori VacA, CagA, NAP 1
ДНК-ВАКЦИНЫ
ВИЧ gag, env, nef, pol и др. 1
ВИЧ gag + 25 ЦТЛ-эпитопов 2
Малярия полиэпитопная 2
Гепатит В HbsAG 1
Гепатит С Кор-белки (доклинические)
Лихорадка Денге поверхностный антиген 1
Лихорадка Эбола поверхностные антигены 1
Герпес 2 типа гликопротеин D 1
Герпес 1 типа гликопротеин D 3
цитомегаловирус гликопротеин B 2
ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ
ВИЧ вирус оспы канареек (env gag pol) 3
ВИЧ вирус оспы канареек (env gag pol) + 25 ЦТЛ-эпитопов 2
ВИЧ аденовирус (gag env pol nef tat) 2b
Малярия поксивирус MVA (CSP+LSA-1) 2
Малярия аденовирус (LSA-1 или CSP) 1
Туберкулез аденовирус (ESAT, A85) 1
Грипп ^N1) аденовирус (нейраминидаза, гемагглютинин) 1
Вирус бешенства вирус осповакцины (gpG) —
генно-инженерные вакцины находятся на стадии испытаний или утверждения. В связи с этим, в ближайшие 5—10 лет ожидается внедрение в медпрактику целого ряда лицензированных генно-инженерных профилактических вакцин. В качестве свежего примера можно привести недавнее утверждение комитетом FDA (Food and Drugs Administration) новой генно-инженерной вакцины против герпес-вируса типа 2.
Несмотря на то, что многие генно-инженерные вакцины, проходящие испытания, несомненно, являются перспективными кандидатными средствами профилактики заболеваний, в настоящее время появляются дополнительные подходы к их усовершенствованию. Данные подходы базируются на основании результатов фундаментальных исследований, раскрывающих механизмы активации врожденного иммунитета и его влияния на развитие адаптивного иммунного ответа. Установлено, что ключевую роль в активации врожденного иммунитета играют Толл-подобные рецепторы, локализующиеся на различных иммунокомпе-тентных клетках и распознающих эво-люционно консервативные патоген-ас-социированные молекулярные структуры (ПАМС) (табл.). После связывания с ПАМС Толл-подобные рецепторы передают внутриклеточный сигнал на активацию синтеза цитокинов и ко-стиму-лирующих факторов. Различные Толл-подобные рецепторы активируют специфические сочетания цитокинов и ко-стимулирующих факторов, что в конечном итоге определяет тип и эффективность развивающегося приобретенного иммунного ответа. Понимание механизмов функционирования врожденной системы иммунитета позволяет осуществлять «рациональный дизайн» вакцин, основанный на комбинировании сигналов активации врожденного (ПАМС) и приобретенного иммунитета (антиген). Возможность активации системы врожденного иммунитета различными сочетаниями ПАМС дополнительно открывает путь для создания средств быстрой неспецифической защиты против неизвестных патогенов, в т.ч. и в случае актов биотерроризма. В ближайшем будущем
в исследовательских программах западных компаний планируется внедрение ПАМС в структуру (конъюгация с вакциной или композиция с ней) генно-инженерных вакцин.
Понятно, что вакцинация, в том случае, когда она возможна, является наиболее эффективным способом защиты от патогенов. Однако в медпрактике часто встречаются ситуации, связанные с неожиданно возникающими
вспышками инфекций, при которых требуются препараты немедленного блокирования распространения патогенов и их токсинов в организме. Аналогичные препараты могут потребоваться в случаях возможных актов биотерроризма. Свойствами, необходимыми для экстренной защиты от патогенов, обладают патогенспецифи-ческие антитела. Их использование в качестве терапевтического средства
ЭКОНОМИКА И МАРКЕТИНГ. ВОПРОСЫ ПОТРЕБЛЕНИЯ ЛС
23
РИСУНОК 2
| Специфичность Толл-подобных рецепторов по отношению
к различным эволюционно-консервативным патоген-ассоциированным
структурам (ЛПС, флагеллину, липопротеинам и др.)
БАКТЕРИАЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
Липопротеины Липоарабидоманнан ЛПС Флагеллин Т-90ПЙ11 Липотейхоевые кислоты Профилин
Зимозан (дрожжи)
V
TLR6
TLR2
TLR1 TLR4
МР2
ВИРУСНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
Неметили-рованная CpG ДНК
V
ДцРНК ОцРНК
TLR9
TLR3 TLR7/8
РИСУНОК 3
«Рациональный дизайн» вакцин, основанный на комбинировании сигналов активации врожденного и адаптивного иммунного ответа
ТРАДИЦИОННЫЕ АДЪЮВАНТЫ ген адъювант
Антиген-специфичный иммунный ответ
Избыточная воспалительная реакция
Неспецифический иммунный ответ Аутоиммунный ответ
адъювант
Преимущества:
+ Сигнал 1 (антиген) и сигнал 2 (ко-стимуляция) в одной и той же антигенпрезентирующей клетке ♦ Генетические или синтетические конструкции обеспечивают согласованность процесса (индукции про-тективного иммунитета)
4 Генетические или синтетические конструкции подходят для масштабного промышленного производства
антиген
защиты от патогенов (пассивная иммунизация) известно давно, но в настоящее время применяется только по жизненным показаниям, ввиду того, что в организм человека вводится специфическая сыворотка крови (обычно лошадей), которая может приводить к развитию сывороточной болезни. Принципиальное решение проблемы создания эффективных и безопасных протективных антител стало возмож-
ным после разработки технологии получения рекомбинантных гуманизированных моноклональных антител. Эта технология базируется на методах генной инженерии и нанобиотехнологии. При использовании данных методов в настоящее время создан целый ряд бактериальных продуцентов одноцепочечных гуманизированных моноклональных антител. Показано, что такие гуманизированные наноантитела
март 2007 РЕМШ1ШМ
являются эффективными при лечении различных типов опухолей и при блокировании распространения патогенов в организме человека. В ближайшем будущем ожидается появление большого количества новых гуманизированных антител для терапии опухолевых и инфекционных заболеваний. Дополнительно разрабатываются гуманизированные антитела — средства экстренной защиты от биотерроризма. В частности, в мире получен целый спектр гуманизированных антител против возбудителей особо опасных инфекций. Недавно были получены гуманизированные антитела, эффективно блокирующие развитие инфекции, вызванной сибиреязвенной палочкой. Данные антитела взяты на «вооружение» армией ФРГ.
В заключение следует отметить, что разрабатываемые для защиты от патогенов подходы (генно-инженерные вакцины и гуманизированные антитела) не являются абсолютно универсальными. Было бы ошибочным считать, что внедрение этих технологий в медицинскую практику позволит решить все проблемы, связанные с бактериальными и вирусными патогенами. В то же время нельзя оставаться на позициях и подходах традиционной вакцинопрофилактики. Уже сегодня понятно, что использование прогрессивных технологий позволяет решать конкретные и важные проблемы, связанные с разработкой про-филактичеких средств против особо опасных (сибиреязвенная палочка, вирус бешенства) и плохо культивируемых патогенов (вирус гапатита В, герпес-вирус 2 типа). По данным проходящих клинических исследований предполагается, что в течение 3—5 лет ожидается начало производства первых препаратов для генетической иммунизации человека против вируса бешенства, вируса папилломы, через 6—8 лет — вакцин от малярии и туберкулеза (рекомбинантная БЦЖ). В ближайшие 1—2 года будут созданы препараты гуманизированных антител против таких особо опасных патогенов человека, как туляремия, чума и бруцеллез.
Ф
