SISTEME TEHNOLOGICE INOVAȚIONALE ÎN PRELEVAREA ȘI PROCESAREA CORNEEI Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

ARTIcoLE oRIGINALE

^^ SISTEME TEHNOLOGICE ^^ INOVATIONALE iN PRELEVAREA SI PROCESAREA CORNEEI

Rezumat

Dispozitivele si instrumentariul folosite in prelevarea si procesarea corneei sunt si vor fi una din necesitatile folosite de Banca de ochi. Analiza aparatajului si instrumentariului modern pentru prelevarea si procesarea corneei necesita un progres tehnologic si informational ce tinde sa modernizeze toate tipurile de dispozitive pentru a spori calitatea corneei, ceea ce permite o stocare ex vivo mai indelungata, mentinand in acelasi timp viabilitatea straturilor corneei la nivel epitelial, stromal si endotelial. Bioreactoarele sunt dispozitive complexe care mentin depozitarea corneei ex vivo care sunt mai aproape de norma fiziologica. Multe studii arata ca aceste dispozitive direct sau indirect influenteaza activitatea celulelor.

Cuvinte-cheie: celule endoteliale, mediu de cultura, presiune intraoculara, celule epiteliale, stroma, bioreactor, banca de ochi

Summary

Innovative technological systems in cornea collection and processing

The devices and tools used in the cornea sampling and processing is and will be one of the requirements used by the Eye Bank. Analysis of modern corneal sampling and instrumentation requires technological and informational progress that tends to modernize all types of devices to induce increased corneal quality that provides longer ex vivo storage while maintaining the viability of corneal layers at the epithelial, stromal, and endothelial levels. Bioreactors are complex devices that maintain the storage of the cornea ex vivo that are closer to the physiological norm. Many studies show that the materials that are made of these devices directly or indirectly influence the activity of the cells.

Keywords: endothelial cells, culture medium, intraocular pressure, epithelial cells, stroma, bioreactor, eye bank

Резюме

Инновационные технологические системы в сборе и обработке роговицы

Устройства и инструменты, используемые для взятия проб и обработки роговицы, являются и будут одним из предметов первой необходимости, используемых Глазным банком. Анализ современных образцов роговицы и инструментов требует технологического и информационного прогресса, направленного на модернизацию всех типов устройств для повышения качества роговицы, что обеспечивает более длительное хранение ex vivo при сохранении жизнеспособности слоев роговицы на эпителиальном, стромальном и эндотелиальномуровнях. Биореакторы представляют

CZU: 617.713-089.843-74

Adrian COCIUG1, Olga MACAGONOVA2,

Lilia DUMBRÀVEANU-,Valeriu CUSNIR- Viorel NACU2

1Banca de tesuturi umane, Chisinäu, Republica Moldova, 2Laboratorul de Inginerie Tisularä si Culturä Celularä, USMF „Nicolae Testemitanu", Chisinäu, Republica Moldova, 3 Catedra de oftalmologie si optometrie, USMF „Nicolae Testemitanu", Chisinäu, Republica Moldova

https://doi.org/10.52556/2587-3873.2022.1(92).05

собой сложные устройства, поддерживающие запасы роговицы ex vivo, близкие к физиологической норме. Многие исследования показывают, что эти устройства прямо или косвенно влияют на активность клеток.

Ключевые слова: эндотелиальные клетки, питательная среда, внутриглазное давление, эпителиальные клетки, строма, биореактор, глазной банк

Introducere

Corneea reprezintá fereastra ochiului nostru, permitând luminii sá ajungá la celulele senzoriale si face posibilá vizualizarea lumii mconjurátoare. La om, ea are o grosime de 0,5 mm, un diametru de 10-12 mm, o formá sfericá ce formeazá o putere refractivá a ochiului de 43 dioptrii. Din cauza leziunilor corneene sau a tulburárilor regenerative, infectioase, distrofice si inflamatorii, numeroase boli ale corneei duc la opa-citate si orbire. Actualmente, aproximativ 5,2 milioane de persoane au vederea afectatá. Corneea este printre cele mai reusite tesuturi transplantate [1]. Cu toate acestea, lipsa unui numár suficient de grefe corneene creeazá rânduri de asteptare, În special În tárile În curs de dezvoltare [2]. Mai mult, numárul donatorilor este În scádere din cauza schimbárilor demografice si a frecventei tot mai mari a interventiilor chirurgicale pe cornee. Cresterea numárului de transplanturi de cornee necesitá recrutarea mai multor donatori si stocarea tesuturilor corneene pentru o perioadá de timp mai mare de 30 de zile [3].

studierea corneei care are la bazá mentinerea viabilitátii celulare cu pástrarea transparentei este una din provocári pentru cercetátori. Acestia tind mereu sá implimenteze diverse metode si dispozitive necesare pentru diverse etape de prelevare si procesare a corneei care fac ca etapele date sá fie mai usoare, de scurtá duratá ce mentin maximal durata de viatá a celulelor sraturilor corneei [4] .

ScopuI

Evaluarea aparatajului si instrumentariului modern pentru prelevarea si procesarea corneei.

Obiective

Crearea unor instrumentarii si dispozitive inovationale moderne utilizate la toate etapele de prelevare si procesare a corneei.

Evaluarea aplicárii dispozitivelor inovationale la calitatea morfologicá a corneei.

Determinarea unor sisteme tehnologice modem ne in conservarea cornei (reviul literaturii).

Evaluarea influentei dispozitivelor si instrumen-tariului modern in márirea duratei de conservare si calitatea morfologicá ale cornei.

Materiale si metode

Instr umentariu l brevetat a fost folosit in diverse etapx^ de; prelevare al procesara a comeeUe BTCU, irifa^-rioade etrr3-(sa2r,laarCco)^n(?(?-(¡^la 15ed^don^1or¡ (69,8% bárbcp'r 3(02% fume¡), cu varete cuprinseinfre 18 t¡91 dean¡,media de várstáfiinl 3ft,e¡.dtí ani.. (Corn<u<tl<r an fost preterate de la dorrator¡¡ rfin Cerstnrrl (Ce ocudi-ciná legalá (23,5%), spitale publice autorizate (67,6%) s¡ donaUori da organe W %). Cele ma¡ frecven0e ccuno alo dmceseltr denttorilor an ^88(¡ boWn cnr0¡oaascd|ore) trdumdt¡smeld c¡ (^o¡¡0 cerebrovasculare. Timpul de pástraoe a cnaucu): de le 3r5 la 1 r,8z¡le, <9(?u(Snd mediul de culturá a inlocuit depozitarea hipotermicá. Corneea a foso invalidatá in 2e,8% cJin c^zuri, cnre ais¡ fost c¡e-de ¡ofecHi serologlce r HesAgopozátiv, HCV-eozit¡¡\9, HIVdSIDA-1( ^Vttt contaminaría biologic^ (7,8%). ín total, 77,2% din tesutul corneean prelevat au 0cns9l¡o^oe|1i<^ peadre toansptant c¡e normi (d4(¡d°/r peetau ker^tdofklnaiiie 2,1% pentru keratoplastie

lamelard s¡ 1,3% pentru transplanturi nespecificate) si 22,80/o au eoot d¡atoutu.

La etapa de prelevare, s-a inventat in cadru L5bo1a8ordlu¡ ¡¡e in<:(|nreiii¡tí ¡¡sutará si (cultuc1 ^((.¡¡.cre d¡verue d¡seoz¡tiue, unul d¡n eld f¡¡ue ,,Dispouit¡vda sectionarn a rorrear (figerlle 0 s¡ 21 15r, eero peomit ccctionarea curneei Tutrro eUapá Uindcoufec9lonat din inox. Acest dispozitiv este eficient, deoarece poate fi folosit, reutilizat si este usor de sterilizat.

Figura 1.

Figura 2.

Figurile 1 si 2. Dispozitiv pentru sectionarea corneei, Brevet MD1048

Sursa: Cociug A., Macagonova O., Nacu V.: Patent. (MD) 1048. Device for cutting of the cornea. BOPI, nr. 6/2016, p.34.

La etapa de procesare a corneei in cadrul Bancii de tesuturi umane din Republica Moldova sunt fo-

losite o serie de dispozit¡ve utilízate, care au ca scop modelarea corneei si înlâturarea detriturilor pentru amárirezistenta la infecíale bactetiene si fungice. Unul din acestea efts Uispozitivul defixarea ^crune^i (fígurile 3 si 4t Xf^]r

Figura 3.

Figura 4.

Figurile3 si4. Dispozitivpentrufixareacorneei,Brevet MD1504

Sursa:Cociug A., Macagonova O., Nacu V.: Patent number 1504MD.Corneafixationdevice. BOPI,nr. 2/2021, p.52.

Dupáprocesare in salacuratá din cadru Bancii detesuturiumane(BTU),urmeazá etapadeevaluare morfologicáa integritátiistratuluiepitelial,opacitátii sitrasparenteicorneei. Numárulcelulelorendoteliale seefectueazácuajutorulmicroscopuluicucontrast de fazá inversatá la care corneea se amplaseazá in ,,Vas pentruenumárarea celulelor endoteliale ale corneei" (figura 5) [7], care este umplut cu mediu de culturá Tissue ,,C". Corneea se scufundá in acest vas cu concavitatea in jos si sub microscopul cu contrast de fazá inversatá fiind usor cuantificatá media celulelor endoteliale.

IÍ-— .. —ri. K

1

j

y >

/ \

Figura5. Dispozitivpentruconservarea si examinarea celulelorendoteliale alecorneei,BrevetMD1311

Sursa:Cociug,A MacagonovaO., Nacu V.:1311MD Device for corneal preservation and examination of endothelial cells ofthecornea.BOPI,nr. 2/2019, p.51.

Stocarea corneelor in diverse medii de cultura cu marirea viabilitatii celulare mai mare de 30 de zile,ramäne una dinproblemele nerezolvate päna in prezent.

Actualmente, se cunosc dispozitive care inde-plinesc functia similara a globului ocular ce mentin

7

4

ARTICOLE ORIGINALE

suprafata superioarä a corneei in mediu bogat cu C02 ce induce proliferarea celulelor epiteliale si pästrarea viabilitätii celulelor endoteliale. Aceste dispozitive sunt bioreactoarele, ce prezintä un sis-tem complex automatizat care schimbä permanent mediile de nutritie ale celulelor corneei. Unul din bioreactoare este proiectat in SolidWorl« Systemes Soli Works Corp, Waltham,SUA). Coroamele bioreactorului sunt frezate din otel inoxidabil, iar corpul din polisulfonä, prin 3D ppe^^r^.ieeteei^lul pentru tipärirea 3D este un polimer biocompatibil acrilat-ba sed (Universitatea Tehnicä München, Germania) (schema 1). S-a stabilit cä schimbarea mediu-lui de culturä, autoclavarea si pregätirea suprafetei materialelor sunt factori importanti care influenteazä viabilitatea celularä. Poli (eteretercetonä) si titan-6Al-4V s-au dovedit a fi cele mai potrivite materiale pentru utilizarea intr-un sistem de bioreactoare pentru cornee.

A| ^ioreactor

septum

lid

f IM LI ÍTD r

cofriaa

Schema 1. Cultura dinamica a corneei native.

A) O cornee a fost fixatá tntr-un bioreactor um lizând un fixatorpersonalizat. Sistemulbioreactor combinat din douácircuiteseparate. Circuito 1 cu pompaPlafurnizatmediucátrepartea endotelialá a corneei; în circuitul 2, pompa P2 a livrat mediu în partea epitelialá a corneei pentru a ¡mita liahidul lacrimal. Senzorul PI a másurat presiunea intraoculará.

Acest bioreactor este implicat doar tnstudiu stiintific, dreptmaterial biologic fiind ochii de porciná careaucaractere similare tlupâ mârime s structurastraturilor corneei cu cele umane.

Ochii au fost transferati direct în mediu DMEM (Invitrogen, Darmstadt, Germania) cu 10% aer U^tol de vitel (Lonza, Colog ne, Germania) si 1% Peniciliná / Streptomiciná(PAA, Coe lbe, Germunia).

Corneea amplasatá cu fata concavá pe suprafata coroanei(foto 1.) se fixeazá ermetiutn iete sapeafata

convexá permite a forma o presiune ridicatá similará cu cea in camera anterioará a globului ocular, iar suprafata convexá formeazá camerá care contine C02 si picáturi similare cu continutul lacrimei (brevet pentrupicátur ile de ochi (US8648057 B2) ce contine concentratie sporitá de calciu avind efect pozitiv asu-pra epiteliale.íncorpul e¡oreactorului sunt

diverpemedii do culíurá cel mai potrivit fiind mediu biocrom 1 (MerckBiochrom GmbH, Berlin, Germania). Aceastá combinaíinOe reediu oferá conditii optime de mediu pentru epiteliu si endoteliu.

Foto 1. Masa de fixareacorneiîn bioreactor.

Un alt bioreactorcare sOudeazScorneea esse elaborat în Franta, Quantel Medical Laboratory (figura 8.), si permite studierea celor trei straturi, presiunii din interiorul camerei anterioare a globului ocular si de(erminarea compoziäiei biochimice la umflarea straturilor dupä scufundarea corneei în disetsc mediï.

Sa d erermmetcä c oetrelel fo rmei,tcaosearentei si grosimii corneei necesitä o pompä endotelialä, inte-b^^l^a^^bttOtCf lt,în apenial ceàonetioni ftun sc,eontit nue între cele mai superficiale celule si presiunea intra-ocularä uorrbuiä iPiO). Aeeuseä presiune de umflare (SP) (60 mm Hg la oameni si porcine) este contrabalansatä d c bl O (15 o 5 mm Hg), ca reîmp i nge constan t toprefaea cornee i pc^sO±ioaee ênaintasi Ce seOueulcoastanU dc apä prin pompa endotelialä. Aceastä pompä contro-leazä presiunea de imbibitie (IP), iar echilibrul poate fi rezumat prin ecuatia IP = IOP - SP [8]. Dupä decesul C onaSorciui ti ce at5t mai mult dupä excizia corneei, pierderea IOP si pierderea gradatä concomitentä a funct|e) nie pomfeceee nde^äel^^lä expl|cu zmflauaa rapi-aëacore u ei.Mci mult, conservarea celulelor epiteliale ale corneei sia celulelor stem epiteliale limbale necesitä on media da culdurä teecitic, expunere inrermieentä la aer [9], si eventual stres dupä sectionarea corneei cu in etrementele ch irurgicale [10].

Bioreactorul aplica principiile camerelor de perfuzie descrise anterior si ale camerelor artificiale anterioare, [11-17], (foto 2). A fost conceput pentru a mentine un mediu inchis steril care sä permita depozitarea pe termen lung. Corneea este strans fixatä la baza bioreactorului, folosind janta scleralä pentru a separacamerele epite liale si endoteliale; fiecare camerä este conectatä la un stetmna cJteticct decontrol al mediuluidecultusá.O pjmnafc^ ftenmto1-ticá este c^ctn^r^trlat^íá un senzor (de presmne si un tnalizatmr retnnoiesta coacinuu mediuldd culcurá (MC) le e racá cJ^ tt|riOa^ miuut, eretnd mace^n eiece> o presiune cu 20 mm Hg mai mare decat preniunea atmotteriaC tn camara andoUelialá. M(C peatru comee c ontine 2% ser fetal de vitel (CorneaMax; Eurobio, Les Ulis, Franta). Camera epitelialä este conectatä la o pompä peristalticä controlatä de un microanalizator, altarn.nd expanesea liUu1 taaer01 imersiunea intr-un MC (denumit in continuare„ridicare de aer"). Acest btoreacCoríBR) are doaá feeestre tranmparunte, <de fieca re parte a corn ne i, cu perrmtecontroM optie Cm timpul euperimenUalar. Bir afoer conenput peetuu e fi competibilcusistemelsdn ^m^cj^^nis^ oftalnsolo-niceactuale, cuna as Ui lampa cu fantá,c¡ctemele Ce tomogratin mu cotrenta ofDl^i^a(OCT) si microscopia speculará.Aistemul com plet, cu exceptia panourilor sale de ccnSrol, a fost filas at intr-un incubator uscat cu c%cet2 la310C.

Foto 2. Structura generala al bioreactorului în incubator cu CO2.

Rezultate si discutii

Dispozitivele si instrumentariul folosit in prelevárile si procesarea corneei este si va fi una din necesitáti folosite de Banca de ochi. Progresul tehnologic si informational tinde a moderniza toate tipurile de dispozitive ce induce la sporirea calitátii corneei ce oferá o stocare ex vivo mai indelungatá cu pástrarea viabilitátii straturilor corneei la nivel epitelial, stromal si endotelial mai aproape de norma fiziologicá. Multe studii aratá cá aceste dispozitive direct sau indirect influenteazá activitatea celulelor. Cele mai aproape de parametrii globului ocular ale

omului sunt corneele de porciná cu vârsta de 6 luni, ce au aceleasi márimi si structuri celulare. O deose-bire este doar structura arhitectonicá a stromei care este mai bogatá în fibre reticulare la om ce configu-reazá forma globului ocular [19]. La porcine, ele sunt mai mici datoritá reticulárii neenzimatice legate de v ârstc^, ce afecteazá fibrilele de colagen stromal [20]. Doar la mentinerea în medii de culturá cu hidratarea s tratur ilor ele revin la forma normalá. în plus, umfla-r eaco rneei începe imediat dupá sectionarea sclerei (+ 70 pm în prezentul studiu), sugerând cá micsorarea tibrelor elastice de colagen tensionate natural joacá un toi tn cresterea grosimii.

Corneele porcine sunt stocate timp de 7 zile în Bâ cu 20 mm Hg în camera endotel ¡al ä. Aici se face reînnoirea continuá a mediului de culturá si ridicarea aerului epitelial pástránd parametrii apropiati de cei air (tornee i postmortem pentru fiecare dintre cele trristraturi: epitelial, stromal si endotelial.

Corneele de porciná disponibile de la abatoare uu în medie 6 luni si sunt mult mai putin rigide decât t orneele umane [18] dupá excizia corneo-scleralá. C orneea porciná îsi pierde forma, spre deosebire de <a orneea umaná.

Ed e mul stromal masiv observat în BR numai cu c rrtEt fárá iris creeazá o cale de ¡ntrare anormalá pentru apá atunci când IOP este restabilit. în special, acest fenomen nu a fost observat în OC(corneea opticá), deoarece lipsea un gradient de presiune. Dimpotrivá, când se pástreazá anatomia unghiului iridocorneal, presiunea restabilitá în BR compensea-zá partial SP si astfel limiteazá semnificativ umflarea stromalá. Tumefierea corneei este, de asemenea, limitatá de integritatea barierei epiteliale datorate jonctiunilor strânse în celulele epiteliale cele mai superficiale. Corneele stocate râmân astfel subtiri fárá adáugarea de macromolecule, utilizate în mod obisnuit de báncile de ochi în OC conventionale, pentru a creste osmolaritatea medie. Acest rezultat poate avea aplicatii pentru Báncile de ochi, deoarece mediile de dezintegrare hiperosmolare folosite în timpul stocárii corneei pot fi toxice pentru endote-liu [21, 22]. în plus, reducerea pliurilor endoteliale legate de edemul corneean este probabil sá reducá pierderile epiteliului cornean (EC), având în vedere relatia dintre pliurile endoteliale si apoptoza EC [23, 24]. în plus, reînnoirea continuá a MC în BR ar putea nmbunátáti, de asemenea, supravietuirea EC.

în plus, sistemul de ridicare a aerului din camera epitelialá ar putea induce o tensiune de forfecare asupra limbusului care ar putea fi implicatá în regla-rea celulelor stem epiteliale. Diferentierea celulelor epiteliale este mtr-adevár influentatá de prezenta celulelor endoteliale [25]. Au fost raportate cazuri

ARTIcOLE ORIGINALE

de deficientá a celulelor stem limbale secundare unei disfunctii endoteliale severe, ceea ce sustine si ipoteza interactiunilor endoteliu-epiteliu [26].

în plus, prezentul studiu aratá cá BR este o plat-formá experimentalá inovatoare. Permite stocarea corneei În conditii sterile, dar si vizualizarea directá a tesuturilor prin ferestre transparente, fárá a Între-rupe experimentul. Másurátorile optice endotelial si evaluarea transparentei pot fi astfel realizate in situ. Presiunea În interiorul camerei endoteliale poate fi ajustatá dacá este necesar, iar mediul care scaldá endoteliul si epiteliul poate fi diferit si poate avea debituri reglabile separat, ca În prezentul studiu. în plus, probele mediului pot fi colectate cu usurintá În diferite puncte ale circuitului pentru analize spe-cifice.

Prin restabilirea unui mediu fiziologic apropiat corneei (IOP, flux, ridicare epitelialá a aerului, MC specificá pentru fiecare parte), aceastá versiune BR pástreazá corneele porcine timp de 1 sáptái^-ná În conditii care nu au fost atinse anterior, cu o supravietuire EC excelentá, grosime redusá, formá Întretinerea si integritatea epiteliului si limbusului. Desi este mcá În curs de dezvoltare, acest model ar putea fi folosit pentru experimentele preclinice. Cercetárile sunt În curs pentru a prelungi durata de depozitare si pentru a crea un test patognomonic de vindecare a leziunilor corneene.

ConcIuzii

Dispozitivele folosite la etapele de prelevare cÎt si la cele de procesare prezintá unul din elementele de bazá care faciliteazá si garanteazá calitatea mor-fologicá a corneei.

Folosirea vasului pentru conservarea cornei si calcularea celulelor endoteliale ale corneei permite pástrarea sterilitátii corneei pmá la etapa de trans-plantare.

Bioreactoarele sunt dispozitive moderne ce mentin corneea În mediu apropiat de cel fiziologic, necesar pentru keratoplastie transfixiantá si lamelará.

Modernizarea bioreactoarelor este una din cáile principale de a conserva viabilitatea celulelor endoteliale timp mai Îndelungat.

Actualmente nu existá nici o metodá sau dis-pozitiv care ar pástra corneele mai mult de 30 zile cu un numár mai mare de 2000 celule endoteliale viabile la mm2.

Mediile de culturá utilizate În báncile de ochi au fost dezvoltate acum mai bine de 30 de ani si ar trebui revizuite pentru a beneficia de progresul În biologia celulará si fiziologie.

Bibliografie

1. Resnikoff D., Pascolini D., Etyaale i., Kocur R., Parara-jasegaram G.P., Pokharel S.P., Mariotti B. Global data on visual impairment in the year 2002. World Health Organization. 2004, 82, 844.

2. Armitage W. interventions implemented to Reduce the Risk of Transmission of Bacteria by Transfusion in the English National Blood Service. J. Transfus. Med. Hemoth. 2011, 38, 143.

3. Roeck T., Hofmann J., Thaler S., Bramkamp M., Bartz-Schmidt K. U.,Yoeruek E., Rock D., Organ transplantation scandal influencing corneal donation rate. Arch. Clin. Exp. 2016, 254, 135.

4. Cociug, A., Macagonova, O., Cusnir, V. Jr., Cusnir, V., and Nacu, V. Evaluation of the endothelial cell regenerative proprieties of the cornea in the culture media. results and prospects. 4th international Conference on Nanotechnologies and Biomedical Engineering Proceedings of iCNBME-2019, September 18-21, 2019, 601-605.

5. Cociug, A., Olga, Macagonova, O., Nacu, V.: Patent. (MD) 1048. Device for cutting of the cornea. BOPi, nr. 6/2016, p.34.

6. Cociug, A., Olga, Macagonova, O., Nacu, V.: Patent number 1504 MD. Cornea fixation device. BOPi, nr. 2/2021, p.52.

7. Cociug, A., Olga, M., Nacu, V.: 1311 MD Device for corneal preservation and examination of endothelial cells of the cornea. BOPi, nr. 2/2019, p. 51.

8. Bryant, M.R., McDonnell, P.J. A triphasic analysis of corneal swelling and hydration control. J Biomech Eng. 1998; 120: 370-381.

9. Massie, i., Levis, H.J., Daniels, J.T. Response of human limbal epithelial cells to wounding on 3D RAFT tissue equivalents: effect of airlifting and human limbal fibroblasts. Exp Eye Res. 2014; 127: 196-205.

10. Kang, Y.G., Shin, J.W., Park, S.H., et al. Effects of flow-induced shear stress on limbal epithelial stem cell growth and enrichment. PLoS One. 2014; 9: e93023.

11. Piehl, M., Gilotti, A., Donovan, A., DeGeorge, G., Cer-ven, D. Novel cultured porcine corneal irritancy assay with reversibility endpoint. Toxicol in Vitro. 2010; 24: 231-239.

12. Dikstein, S., Maurice, D.M. The metabolic basis to the fluid pump in the cornea. J Physiol. 1972; 221: 29-41.

13. Hull, D., Green, K., Boyd, M., Wynn, H. Corneal endothelium bicarbonate transport and the effect of carbonic anhydrase inhibitors on endothelial permeability and fluxes and corneal thickness. invest Ophthalmol Vis Sci. 1977; 16: 883-892.

14. Brunette, i., Nelson, L.R., Bourne, W.M. A system for long-term corneal perfusion. invest Ophthalmol Vis Sci. 1989; 30: 1813-1822.

15. Tanelian, D.L., Bisla, K. A new in vitro corneal preparation to study epithelial wound healing. invest Oph-thalmol Vis Sci. 1992; 33: 3024-3028.

16. Thiel, M.A., Morlet, N., Schulz, D., et al. A simple corneal perfusion chamber for drug penetration and toxicity studies. Br J Ophthalmol. 2001; 85: 450-453.

17. Zhao, B., Cooper, L.J., Brahma, A., et al. Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation. invest Ophthalmol Vis Sci. 2006; 47: 2840-2846.

18. Elsheikh, A., Alhasso, D., Rama, P. Biomechanical properties of human and porcine corneas. Exp Eye Res. 2008; 86: 783-790.

19. Hatami-Marbini, H., Etebu, E., Rahimi, A. Swelling pressure and hydration behavior of porcine corneal stroma. Curr Eye Res. 2013; 38: 1124-1132.

20. Elsheikh, A., Wang, D., Brown, M., et al. Assessment of corneal biomechanical properties and their variation with age. Curr Eye Res. 2007; 32: 11-19.

21. Borderie, V.M., Baudrimont, M., Lopez, M., Carvajal, S., Laroche, L. Evaluation of the deswelling period in dextran-containing medium after corneal organ culture. Cornea. 1997; 16: 215-223.

22. Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyo-tat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and deswelling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005; 46: 816-822.

23. Albon, J., Tullo, A.B., Aktar, S., Boulton, M.E. Apoptosis in the endothelium of human corneas for transplantation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000; 41: 2887-2893.

24. Gain, P., Thuret, G., Chiquet, C., et al. Value of two mortality assessment techniques for organ cultured corneal endothelium: trypan blue versus TUNEL technique. Br J Ophthalmol. 2002; 86: 306-310.

25. Pai, V.C., Glasgow, B.J. MUC16 as a sensitive and specific marker for epithelial downgrowth. Arch Ophthalmol. 2010; 128: 1407-1412.

26. Uchino, Y., Goto, E., Takano, Y., et al. Long-standing bullous keratopathy is associated with peripheral conjunctivalization and limbal deficiency. Ophthalmology. 2006; 113: 1098-1101.

Adrian Cociug, dr. st. med., as. univ., medic Banca de tesuturi umane, tel.:+373 79741902 e-mail: [email protected]

Aplicat pentru publicare: 05.02.2022 Acceptat spre publicare: 18.04.2022