CC BY
236
негативно сказывалось на качестве получаемых субстратов. Часто они оказывались нестерильными, но еще обиднее было то, что добиться с их помощью роста клеток с трудом добытых на мясокомбинате хороидных сплетений никак не удавалось.
Попытки заменить сгусток термическим прикреплением фрагментов ткани к стеклу, а также диспергированием хороидных сплетений растворами трипсина разной концентрации и их смесями с версеном не дали ожидаемого результата. Трипсин и его смесь с версеном быстро диспергировали ткань, но выход жизнеспособных клеток был крайне низким. Поэтому предпринимались многочисленные попытки замены этих реагентов другими средствами. Работа могла затянуться на многие годы или от идеи вырастить культуру хороидного сплетения пришлось бы вообще отказаться, если бы под руку не попался флакончик с химотрипсином. Этот препарат выпускают преимущественно для лечения гнойных процессов. Поскольку химотрип-син готовят из поджелудочной железы скота, то в его состав помимо альфа-химотрппсина входит некоторое количество трипсина. Содержимое флакона химотрипсина (0,05 г) раство-
Спонсор рубрики
Ключевые слова: вакцинация, вирус, инфекционный бронхит кур, профилактика
Сокращения: ВИБК — вирус инфекционного бронхита кур; ИБК — инфекционный бронхит кур
Возбудитель
Первые вспышки ИБК описали американские исследователи А.Ф. Шалк и М.К. Хаун в 1931 г. [11.] Через 5 лет их соотечественники О. В. Шалм и Дж.Р. Бич изолировали от больных цыплят коронавирус (ВИБК). Этот агент совместно с ко-ронавирусами индюшек и фазанов и группами 1, 2 и 4 корона-вирусов млекопитающих (последняя ответственна за острый респираторный синдром человека SARS) в настоящее время включены в группу 3 коронавирусов (род Coronavirus, сем. Coronaviridae, отряд Nidovirales [5]. Геном коронавирусов представлен несегментированной одноцепочечной РНК.
ВИБК широко распространен по всему миру и поражает кур всех возрастных групп. Птица других видов к нему невосприимчива. Вирус передается преимущественно воздушно-капельным путем при прямом контакте птиц или механически через контаминированные им предметы.
Патогенез и симптоматика
Проникая через респираторный тракт или органы пищеварения, ВИБК после короткого инкубационного периода (в большинстве случаев — 1...3 дн, реже — до 10 дн) вызывает респираторный синдром. Обычно эта острая контагиозная болезнь охватывает всех восприимчивых птиц стада в течение 5...7дн. Быстрота распространения болезни, заболеваемость и летальность зависят от возраста птицы. Наиболее восприимчивы цыплята в первый месяц жизни. У них появляются насморк, слезотечение, затрудненное и хриплое дыхание, кашель, опухают подглазничные синусы. На фоне симптомов поражения органов дыхания они теряют аппетит, становятся сонливыми, малоподвижными и слабыми. Летальность достигает 25 %.
У птиц других возрастных групп инфекция протекает легче и даже может носить бессимптомный характер, однако
рили в 200 мл среды Игла MEM. Полученный раствор добавили к промытым и измельченным глазными ножницами хоро-идным сплетениям. Уже через 2...3 мин ткань начала набухать. Еще через 1...2 мин заменили диспергирующий раствор на среду Игла MEM. Достаточно было З0...40-секундного встряхивания флакона, чтобы добиться практически полного диспергирования ткани. Результаты подсчета концентрации живых клеток в суспензии оказались неожиданно высокими — суспензии клеток от одного сплетения хватило на выращивание культуры в матрасе объемом 100 мл. Первичная культура клеток выросла в течение 13... 15 дн. Ее серийное пассирование закономерно сопровождалось снижением срока, необходимого для формирования монослоя. На уровне 3...5 пассажей он составлял 5...7 дн при коэффициенте пересева 1: 3. Метод давал стабильные результаты, и мы им пользовались на протяжении многих лет для поддержания в лабораторных условиях изоля-тов вируса висны-мэди.
B.F. Shuliak. About choroid plexus cell culture.
она сопровождается поражением не только респираторного тракта, но и яйцевода. Это становится причиной значительного снижения яичной продуктивности, приобретения яйцами неправильной формы, а также утончения и депигментации их скорлупы. Многие переболевшие куры продолжают нести деформированные яйца, а их яичная продуктивность в полной мере не восстанавливается.
В последние годы накапливается все больше наблюдений о проявлении ВИБК нефропатогенности: индукции воспаления почек, уремии и образования мочевых камней. Такая форма инфекции характеризуется высоким уровнем смертности [6|.
Кроме того, существуют энтеротропные штаммы ВИБК, вызывающие у птиц воспаление желудка (чаще его секреторного отдела) [12. Следует также отметить, что многие вакцинные и полевые штаммы агента не индуцируют развития поражений органов пищеварения, но способны длительно персистировать в лимфатических узлах дистального отдела кишечника и выделяться с фекалиями во внешнюю среду [ 1].
При осмотре трупов птиц, павших от респираторной формы ИБК, отмечают опухание подглазничных синусов, скопление слизи на гиперемированной слизистой оболочке носа и трахеи, катарально-фибринозное воспаление бронхов и воздухоносных мешков. В дистальной части трахеи и бронхах в ряде случаев находят желтоватые казеозные пробки, а вокруг крупных бронхов — небольшие участки пневмонии. Гистологическими методами выявляют отек и диффузную клеточную инфильтрацию слизистой оболочки и подслизистого слоя трахеи. Клеточная инфильтрация возникает и в яйцеводе, но здесь она носит очаговый характер. Толщина эпителиальной выстилки яйцевода, напротив, снижается, многие клетки становятся кубовидными, а их реснички укорачиваются.
Диагностика
Сходство клинических признаков и патоморфологичес-ких изменений, развивающихся при респираторной форме ИБК и ряде других болезней птиц (болезни Ньюкасла, инфекционного ларинготрахеита, гриппа, респираторного ми-коплазмоза и др.) затрудняет постановку диагноза на основании результатов клинического обследования поголовья не-
УДК 619:578. 834,11-616.98:636.52/58
Инфекционный бронхит птиц
Б.П. Экви, РВЖ СХЖ
РВЖ СХЖ №2-2009
31
благополучных ферм. В свете того, что инфекция также может поражать другие системы органов, возможность ее диагностики клиническими методами затрудняется в еще большей мере. Поэтому основу диагностики ИБК составляет комплекс лабораторных исследований, направленный на изоляцию возбудителя болезни из патологического материала или обнаружение его генома в последнем, а также выявление у птицы сероконверсии к ВИБК. Широкое применение вакцин против ИБК обеспечивает снижение экономических потерь, наносимых этой болезнью, но создает дополнительные трудности для диагностики ИБК, что обусловлено наличием антител у привитой и зараженной полевыми вирулентными штаммами птицы, а также вследствие персистенции вакцинных штаммов в организме привитой птицы, которые легко принять за патогенные.
Обнаружить ВИБК в патологическом материале можно посредством изоляции агента на куриных эмбрионах или цыплятах. С этой целью тестируют при респираторной форме болезни пробы гортани, трахеи и легких, взятые в первую неделю после заражения птицы, а при других формах инфекции — почки, дистальную часть кишечника, желудок. Патологический материал доставляют в лабораторию в охлажденном или замороженном виде. Для постановки биопробы пользуются 9... 11-дневными куриными эмбрионами или 10...20-дневными цыплятами. Заражение первых проводят введением суспензии патологического материала в алланто-исную полость, а цыплятам ее инокулируют интратрахеаль-но. При наличии в тестируемом материале вирулентного штамма ВИБК респираторные признаки болезни появляются уже через 18...48 ч и в последующем прогрессируют. Первые пассажи полевых штаммов ВИБК на куриных эмбрионах часто протекают бессимптомно или сопровождаются только замедлением роста эмбрионов и в ряде случаев дистрофией перьевых фолликулов. Поэтому на этой модели проводят до 6... 10 серийных пассажей, используя для заражения аллангоисную жидкость ранее зараженных эмбрионов. При наличии ВИБК с каждым пассажем растет число павших и отстающих в росте эмбрионов. Для подтверждения этиологической роли в этом ВИБК обычно пользуются реакциями нейтрализации и иммунофлюоресценции. Последний из упомянутых тестов позволяет обнаруживать ВИБК в аллан-тоисной и амниотической жидкости куриных эмбрионов уже через 5...20 ч после их заражения. Для серотипирования выделенных изолятов ВИБК применяют реакции нейтрализации и ингибиции гемагглютинации., а в последнее время — обратнотранскриптазную ПЦР, позволяющую дифференцировать изоляты агента по Б-антигену.
Профилактика
Антигенная структура штаммов ВИБК весьма изменчива, и в настоящее время нет общепризнанной системы их классификации. Регулярное появление новых вариантов вируса затрудняет проведение специфической профилактики болезни, поскольку вакцины могут не создавать надежной защиты от штаммов агента, относящихся к другим серотипам. Это диктует необходимость мониторинга серотиповой принадлежности циркулирующих в каждом конкретном регионе штаммов ВИБК. Их серотипируют в реакциях ингибиции гемагглютинации |2] и нейтрализации, которую проводят на куриных эмбрионах |8|, цыплятах |7] и в культуре клеток [9].
Анализ генома штаммов ВИБК показал, что большая часть эпитопов, индуцирующих образование нейтрализующих антител, локализуется в гене, кодирующем вирусный протеин, а точнее в его Б1-субъединице [10]. Анализ этого участка генома в настоящее время лежит в основе генотипи-рования ВИБК. В обратнотранскринтазной ПЦР с помощью специфических праймеров удается дифференцировать ряд серотипов возбудителя (Массачусетс, Коннектикут, Аркан-
зас, Калифорния. ,[М К и ВЕ/072/92), что обеспечивает возможность мониторинга инфекции и быстрого принятия решения о том, какой именно вакциной следует пользоваться в сложившейся эпизоотической ситуации. Важна такая информация и для разработки новых вакцин. В этом отношении весьма перспективны исследования, направленные на изучение возможности защиты кур от ИБК с помощью вакцин из коронавирусов индюшек и фазанов, поскольку их генетическое сходство с ВИБК достигает 90 % [3, 4].
Для серологической диагностики ИБК длительно пользовались реакциями нейтрализации, диффузионной преципитации в агаровом геле и ингибиции гемагглютинации. В них исследуют сыворотку крови больных и павших птиц (в последнем случае кровь берут из сердца). В настоящее время стали доступными наборы реагентов для иммуноферментного анализа. Упомянутые тесты различаются специфичностью, чувствительностью, трудоемкостью и стоимостью необходимых для их проведения реактивов. Например, реакция иммунодиффу-зии недостаточно чувствительна, а реакция нейтрализации слишком дорога для того, чтобы выполнять роль метода рутинной диагностики инфекции. Для этого больше подходят иммуноферментый анализ и реакция ингибиции гемагглютинации. Регулярное проведение серологического обследования птицы (особенно растущих цыплят) обеспечивает мониторинг благополучия хозяйств по ИБК, а также позволяет оценивать эффективность вакцинации.
Специфическую профилактику ИБК осуществляют живыми аттенуированными и масляно-адъювантными убитыми вакцинами. Для аттенуации штаммов ВИБК пользуются различными приемами, в т. ч. адаптацией к куриным эмбрионам н термической обработкой. Живые вакцины индуцируют более выраженный местный иммунитет в респираторном тракте по сравнению с убитыми. Кроме того, они способны защитить от большего количества антигенных вариантов полевых штаммов ВИБК. Однако это не означает, что всегда следует отдавать предпочтение живым вакцинам — бывают ситуации, когда инактивированные препараты, приготовленные из местных изолятов, лучше защищают птицу, чем живые вакцины со значительно более широким спектром действия. Риск реверсии вирулентности аттенуированными штаммами также служит сдерживающим фактором для неоправданно частого применения живых вакцин, хотя опыт иммунизации ими птицы па протяжении многих десятков лет свидетельствует о том, что такая опасность не слишком велика (особенно если эту процедуру проводят посредством распыления вакцин в виде спрея или их добавления в питьевую воду, что помимо всего прочего наименее трудоемко). У 5... 10% цыплят через несколько дней после иммунизации живой вакциной может возникать кратковременная и спонтанно проходящая реакция, проявляющаяся угнетением, легкими ринитом и конъюнктивитом.
Наиболее часто вакцины (как живые, так и инактивированные) против ИБК готовят из штаммов, относящихся к се-ротипу Массачусетс. Это не случайно, поскольку во многих странах мира (в т. ч. России) этот серотип ВИБК наиболее распространен. Включение в состав вакщш штаммов нескольких серотипов ВИБК значительно расширяет спектр защиты птицы такими препаратами. Кроме того, существует ряд отечественных и зарубежных вакцин, в состав которых помимо ВИБК входят и другие компоненты, такие как инактивированные вирусы болезней Ньюкасла и Гамборо, синдрома снижения яйценоскости'76, реовируса птиц. Примером, который хорошо иллюстрирует комбинацию обоих подходов к конструированию вакцин для птиц, служит вакцина Р1Ю-РОиьта\'ЫВ+1В МШЛЧ+ЕОБ [ассоциированная поли-штаммная вакцина (НБ+ИБК мульги+ССЯ) для защиты от вариантных штаммов инфекционного бронхита кур, болезни Ньюкасла и синдрома снижения яйценоскости'76] — первый
