CC BY
36
ЖВАЧНЫЕ
Результаты исследований
Размножение ВИК в трансфидиро ванной плазмидой рВ1У127 диплоидной культуре ЛЭК сопровождалось образованием синцития и очагов морфологически измененных или поврежденных клеток (рисунок). Вирус-специфические изменения появлялись примерно через 3 дня после заражения клеток и рач-вивались с увеличением срока инкубации инфицированных культур. В ПЦР при исследовании ДНК, выделенной из транс-фицированной плазмидой культуры клеток, выявили ВПК.
Зараженная культура клеток обычно выдерживала не более трех пассажей, поскольку клетки разрушались по мере развития ЦОД. Впоследствии инфицированную ВПК культуру клеток использовали при постановке ПЦР в качестве положительного контроля.
Результаты исследования проб ДНК, выделенных из крови и мышечной ткани КРС, представлены в таблицах 1 и 2. ВИК обнаружили в 15,83% проб крови КРС из хозяйств Ставропольского края. В пробах крови животных из Вологодской области его не нашли. Средняя частота обнаружения ВЛК в обследованных хозяйствах обоих регионов составила 32 %.
1. Результаты выявления ВИК и ВЛК у КРС Ставропольского края и Вологодской области методом ПЦР
Регион Обследовано Признано Признано
животных. инфициро- инфициро-
гол. ванными ванными
ВИК, гол/% ВЛК, гол/%
Ставропольс- 120 19/15,83 32/26,6
кий край
Вологодская 30 0/0 16/53,3
область
Итого 150 19/12,6 48/32
2. Результаты исследования в ПЦР импортной говядины на наличие провирусной ДНК ВИК
Страна Количество тестированных партий мяса Частота обнаружения ВИК, партии /%
Аргентина 12 0/0
Бразилия 34 3/8,8
Парагвай 4 2/50
Украина 5 3/60
Франция 4 2/50
Италия 5 2/40
Итого 64 12/18,75
В результате секвенирования продуктов ПЦР обнаружили большее количество нуклеотидных замен в области гена ро1 штаммов ВИК, циркулирующих в скотоводческих хозяйствах России, по сравнению с нуклеотидной последовательностью референтного штамма ВИК К-29.
Обсуждение
Посредством трансфекции плазмиды рВ1У127, содержа-шей полный геном ВИК, получили культуру клеток, продуцирующую этот ретровирус. Инфекция ВИК проявлялась в культуре клеток специфическим для этого агента ЦПД. Применение зараженной ВИК культуры клеток в качестве положительного контроля при постановке ПЦР позволило подтвердить специфичность показаний теста.
Установленная нами частота обнаружения ВИК в крови КРС из хозяйств Ставропольского края соответствует данным литературы о широте распространения этой инфекции в других странах.
По результатам исследований проб говядины нельзя судить о широте распространении ВИК в скотоводческих хозяйствах стран, из которых ее импортировали. Однако дан-
ный опыт подтверждает возможность применения ПЦР для тестирования мяса КРС на наличие ВИК.
Выявлено большое количество нуклеотидных замен в гене pol референтного штамма ВПК и штаммов этого агента, циркулирующих в обследованных хозяйствах. Анализ информации о нуклеотидных заменах позволит создать более точную диагностическую тест-систему и избежать ложноот-рицательных результатов при проведении ПЦР.
Создание диагностической тест-системы ПЦР в реальном времени для одновременной детекции нровнру-сов ВИК и ВЛК станет предметом наших дальнейших исследований.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Колотвин В.В., Капитонов А.В., Гриненко Н.Ф. и соавт. Выявление вируса иммунодефицита крупного рогатого скота в Московской области. РВЖ сельскохозяйственные животные, 2006, 2, 18—20.
2. van Regentmortel М.Н., Fauquet С.М., Bishop D.H.L. et al. Virus Taxonomy Classification and Nomenclature of Virus. Acad Press, San-Diego, 2000.
V.G. Burba, D.S. Megrabyan, V.V. Kolotvin. V.F. Grinenko, A.D. Altstein, A.F. Valikhov. The application of PCR to reveal BIV in blood and meat samples of cattle.
УДК 635.21:581.143.6
О культуре клеток хороидного
сплетения овец
Б.Ф. Шуляк, РВЖ СХЖ (г. Москва)
Культивирование тканей и клеток на протяжении длительного времени считали искусством. Такое представление не стало анахронизмом и в наши дни, когда накоплен огромный опыт, доступны разнообразные питательные среды, культуральные матрасы и другие необходимые приспособления. Статья Г.Д. Сидельникова и соавт. напомнила мне о способе выращивания культуры клеток хороидного сплетения овец, которая по чувствительности к другому лентивирусу жвачных (вирусу висны-мэди) превосходит все остальные. Ею сейчас пользуются нечасто, что обусловлено сложностью выращивания и отсутствием достаточного количества сырья — масса хороидного сплетения, извлеченного из обоих боковых желудочков головного мозга взрослой овцы не превышает 0,3 г.
До настоящего времени культуру этой тканн выращивают методом, предложенным исландскими исследователями в 1930-х годах мшгувшего столетия. Схематично его технология сводится к следующему. Стерильно извлеченные из боковых желудочков головного мозга сплетения промывают в растворе Хенкса, измельчают и помещают полученные фрагменты в пробирки, куда предварительно внесено по капле смеси сгустка плазмы крови кур и экстракта куриных эмбрионов. Эта смесь быстро образует желеобразный сгусток, который удерживает эксплантаты на поверхности стекла. Со временем вокруг таких островков «переживающей» ткани разрастаются клетки, которые субкультивпруют обычным способом.
Пишу эту заметку с надеждой, что она будет полезна, а отнюдь не из-за того, что причисляю себя к мастерам «культу-рального дела». Напротив, в начале 1980-х годов мне на протяжении полутора лет не удавалось вырастить культуру исландским методом. Плазму крови кур и экстракт куриных эмбрионов приходилось готовить самостоятельно, что, безусловно,
ПТИЦА
негативно сказывалось на качестве получаемых субстратов. Часто они оказывались нестерильными, но еще обиднее было то, что добиться с их помощью роста клеток с трудом добытых на мясокомбинате хороидных сплетений никак не удавалось.
Попытки заменить сгусток термическим прикреплением фрагментов ткани к стеклу, а также диспергированием хороидных сплетений растворами трипсина разной концентрации и их смесями с версеном не дали ожидаемого результата. Трипсин и его смесь с версеном быстро диспергировали ткань, но выход жизнеспособных клеток был крайне низким. Поэтому предпринимались многочисленные попытки замены этих реагентов другими средствами. Работа могла затянуться на многие годы или от идеи вырастить культуру хороидного сплетения пришлось бы вообще отказаться, если бы под руку не попался флакончик с химотрипсином. Этот препарат выпускают преимущественно для лечения гнойных процессов. Поскольку химотрип-син готовят из поджелудочной железы скота, то в его состав помимо альфа-химотрппсина входит некоторое количество трипсина. Содержимое флакона химотрипсина (0,05 г) раство-
Спонсор рубрики
Ключевые слова: вакцинация, вирус, инфекционный бронхит кур, профилактика
Сокращения: ВИБК — вирус инфекционного бронхита кур; ИБК — инфекционный бронхит кур
Возбудитель
Первые вспышки ИБК описали американские исследователи А.Ф. Шалк и М.К. Хаун в 1931 г. [11.] Через 5 лет их соотечественники О. В. Шалм и Дж.Р. Бич изолировали от больных цыплят коронавирус (ВИБК). Этот агент совместно с ко-ронавирусами индюшек и фазанов и группами 1, 2 и 4 корона-вирусов млекопитающих (последняя ответственна за острый респираторный синдром человека SARS) в настоящее время включены в группу 3 коронавирусов (род Coronavirus, сем. Coronaviridae, отряд Nidovirales [5]. Геном коронавирусов представлен несегментированной одноцепочечной РНК.
ВИБК широко распространен по всему миру и поражает кур всех возрастных групп. Птица других видов к нему невосприимчива. Вирус передается преимущественно воздушно-капельным путем при прямом контакте птиц или механически через контаминированные им предметы.
Патогенез и симптоматика
Проникая через респираторный тракт или органы пищеварения, ВИБК после короткого инкубационного периода (в большинстве случаев — 1...3 дн, реже — до 10 дн) вызывает респираторный синдром. Обычно эта острая контагиозная болезнь охватывает всех восприимчивых птиц стада в течение 5...7дн. Быстрота распространения болезни, заболеваемость и летальность зависят от возраста птицы. Наиболее восприимчивы цыплята в первый месяц жизни. У них появляются насморк, слезотечение, затрудненное и хриплое дыхание, кашель, опухают подглазничные синусы. На фоне симптомов поражения органов дыхания они теряют аппетит, становятся сонливыми, малоподвижными и слабыми. Летальность достигает 25 %.
У птиц других возрастных групп инфекция протекает легче и даже может носить бессимптомный характер, однако
рили в 200 мл среды Игла MEM. Полученный раствор добавили к промытым и измельченным глазными ножницами хоро-идным сплетениям. Уже через 2...3 мин ткань начала набухать. Еще через 1...2 мин заменили диспергирующий раствор на среду Игла MEM. Достаточно было З0...40-секундного встряхивания флакона, чтобы добиться практически полного диспергирования ткани. Результаты подсчета концентрации живых клеток в суспензии оказались неожиданно высокими — суспензии клеток от одного сплетения хватило на выращивание культуры в матрасе объемом 100 мл. Первичная культура клеток выросла в течение 13... 15 дн. Ее серийное пассирование закономерно сопровождалось снижением срока, необходимого для формирования монослоя. На уровне 3...5 пассажей он составлял 5...7 дн при коэффициенте пересева 1: 3. Метод давал стабильные результаты, и мы им пользовались на протяжении многих лет для поддержания в лабораторных условиях изоля-тов вируса висны-мэди.
B.F. Shuliak. About choroid plexus cell culture.
она сопровождается поражением не только респираторного тракта, но и яйцевода. Это становится причиной значительного снижения яичной продуктивности, приобретения яйцами неправильной формы, а также утончения и депигментации их скорлупы. Многие переболевшие куры продолжают нести деформированные яйца, а их яичная продуктивность в полной мере не восстанавливается.
В последние годы накапливается все больше наблюдений о проявлении ВИБК нефропатогенности: индукции воспаления почек, уремии и образования мочевых камней. Такая форма инфекции характеризуется высоким уровнем смертности [6|.
Кроме того, существуют энтеротропные штаммы ВИБК, вызывающие у птиц воспаление желудка (чаще его секреторного отдела) [12. Следует также отметить, что многие вакцинные и полевые штаммы агента не индуцируют развития поражений органов пищеварения, но способны длительно персистировать в лимфатических узлах дистального отдела кишечника и выделяться с фекалиями во внешнюю среду [ 1].
При осмотре трупов птиц, павших от респираторной формы ИБК, отмечают опухание подглазничных синусов, скопление слизи на гиперемированной слизистой оболочке носа и трахеи, катарально-фибринозное воспаление бронхов и воздухоносных мешков. В дистальной части трахеи и бронхах в ряде случаев находят желтоватые казеозные пробки, а вокруг крупных бронхов — небольшие участки пневмонии. Гистологическими методами выявляют отек и диффузную клеточную инфильтрацию слизистой оболочки и подслизистого слоя трахеи. Клеточная инфильтрация возникает и в яйцеводе, но здесь она носит очаговый характер. Толщина эпителиальной выстилки яйцевода, напротив, снижается, многие клетки становятся кубовидными, а их реснички укорачиваются.
Диагностика
Сходство клинических признаков и патоморфологичес-ких изменений, развивающихся при респираторной форме ИБК и ряде других болезней птиц (болезни Ньюкасла, инфекционного ларинготрахеита, гриппа, респираторного ми-коплазмоза и др.) затрудняет постановку диагноза на основании результатов клинического обследования поголовья не-
УДК 619:578. 834,11-616.98:636.52/58
Инфекционный бронхит птиц
Б.П. Экви, РВЖ СХЖ
РВЖ СХЖ №2-2009
31
