CC BY
52
6 698578828 Выявление вируса
иммунодефицита крупного рогатого скота в Московской области
В.В. Колотвин1, A.B. Капитонов 1, Н.Ф. Гриненко2, JI.M. Пискарева2, Г.В. Пашвыкина2, Г.О. Шайхаев3, А.Д. Альтштейн2, А.Ф. Валихов1
'Московский государственный университет прикладной биотехнологии (г. Москва)
2Институт биологии гена РАН (г. Москва)
3Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (г. Москва)
Ключевые слова: вирус иммунодефицита КРС, вирус лейкоза КРС, ретровирусы
Сокращения: ВИК — вирус иммунодефицита КРС; ВПК — вирус лейкоза КРС; КРС — крупный рогатый скот; пн — пары нуклеотидов; ПЦР — полимеразная цепная реакция
Введение
Известно 4 ретровируса КРС: спумавирус КРС (род Spumavirus) [11], ВЛК (род Deltaretrovirus) и 2 филогенетически близких агента из рода Lentivirus — ВИК и вирус болезни Джембрана [2].
ВИК впервые выделили в США от дойной коровы с пер-систентным лимфоцитозом, сопровождавшимся прогрессирующей слабостью и истощением [12|. Агент (изолят R-29) индуцировал образование синцития в культуре клеток и структурно был сходен с вирусом мэди-висны. Экспериментальная инфекция изолята R-29 у телят имела персистент-ный характер и сопровождалась умеренным лимфоцитозом и увеличением лимфатических узлов [12|.
С помощью серологических тестов и ПЦР инфекцию ВИК диагностировали во многих странах мира. В большинстве случаев уровень инфицированное™ этим агентом не превышает 12%. Например, в Канаде инфекцию выявили у 5,5% [4], в Германии — у 6,6 % [7], во Франции — у 4 % [9], в Нидерландах — у 1,4 % [5], в Италии — у 2,5% [1], в Бразилии — у 11,7 % [6], в Японии — у 11 % обследованных животных [10). Одно из немногих исключений — Южная Корея, где данный показатель оказался равен 33 % [3|. Сообщалось также о том, что в США в отдельных стадах КРС, неблагополучных по хроническим болезням, распространение ВИК превышает 50 % [8].
Нами предпринята попытка создания тест-системы ПЦР для обнаружения ВИК. Работа включала получение адекватных позитивного и негативного контролей, подбор специфичных олигонуклеотидных праймеров, обладающих сродством к определенным участкам провируса ВИК, оптимизацию процесса амплификации по температурному и временному профилю реакции, а также апробацию разработанной тест-системы в лабораторных условиях (на плазмиде с клонированной провирусной ДНК агента и ДНК, выделенной из инфицированной им культуры клеток) и в 3 хозяйствах Московской области. Полевые испытания тест-системы представляли особый интерес, поскольку ранее инфекцию ВИК в нашей стране не регистрировали.
Материалы и методы
Вирус и клетки. Линию диплоидных клеток FBL получили из легкого эмбриона коровы. Ее хранили в заморожен-
ном виде при -196 °С. Клетки культивировали в среде DM ЕМ с 10% эмбриональной сыворотки коровы. Посредством их трансфицирования плазмидой pBIV127\ содержащей полный провирус агента, получили инфицированную ВИК линию клеток FBL-BIV.
Подбор праймеров для ПЦР. Проанализировав базы данных EMBL, GenBank и DDBJ собрали всю известную информацию о нуклеотидных последовательностях генома и отдельных генов ВИК. С помощью пакета программ GeneBee осуществили множественное выравнивание геномов выбранных изолятов. Обнаружение высококонсервативных участков в генах gag и pol ВИК позволило подобрать специфические праймеры. С помощью программы Oligo подвергли термодинамическому анализу праймеры и ампликоны.
ПЦР. Для выделения ДНК из культуры инфицированных клеток и лейкоцитов КРС использовали наборы для универсальной подготовки проб ДНК «Diatom ®DNA Prep 200» (Изоген, Москва), а для обнаружения провируса ВЛК в ПЦР — диагностический набор «GenePak ® DNA PCR test» компании «Изоген» (Москва). Выделенную ДНК тестировали в ПЦР с двумя парами праймеров: gag 1 — gag 2 и pol 1 — pol 2. Праймеры, полученные на синтезаторе ASM-102 (Биоссет, Новосибирск) и очищенные посредством электрофореза в ПААГ, приготовила фирма Синтол (Россия). ПЦР проводили в стандартных пластиковых пробирках объемом 0,5 мл (Sarstedt, Германия) на амплификаторе Терцик (ДНК-технология, Россия) при следующих параметрах: начальная инкубация 95 °С, 2 мин; денатурация — 95 °С, 20 с; отжиг — 58 "С, 20 с; синтез — 74 °С, 40 с; 45 циклов. Для визуализации ампликонов Юмкл ПЦР-продукта разделяли электрофорезом в 2 % агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Результаты регистрировали с помощью фотодокументирующей системы Vitran.
Результаты
Выбранная стратегия создания праймеров для обнаружения провируса ВИК была основана на компьютерном анализе максимально возможного количества нуклеотидных последовательностей или фрагментов гена ВИК для снижения вероятности ложноотрицательных результатов ПЦР. При разработке наборов праймеров проанализировали разные локусы генома ВИК — гены gag, pol и env, фрагменты которых могут быть маркерами его провируса. На основании компьютерного анализа подобрали две пары праймеров: gag 1 (5'-GTCTTCCCACATCCGTAACATCTCCT-3') и gag 2 (5'-CCCCAGGTCCCATCAACATTCATCAG-3') для обнаружения фрагмента гена gag (382 пн); pol 1 (5'-
1 Ппазмида получена из коллекции NIH (США).
CCAGGAATTAAGGAATGTGAACACTTAACT-З') и pol 2 (5'-CATCCTTGTGGTAGAACATTCCACTG-3') для детекции фрагмента гена pol (167 пн).
Методику постановки ПЦР отрабатывали с использованием плазмиды pBIV127 и ДНК из клеток FBL (отрицательный контроль), а также клеток FBL-BIV (положительный контроль). Одна из типичных электрофореграмм продуктов ПЦР с праймерами gag 1 — gag 2 и pol 1 — pol 2 приведена на рисунке 1. На них обнаружили ампликоны ожидаемого размера в плазмиде pBIV127 и в ДНК из клеток FBL-BIV. Проверка чувствительности метода показала, что обе пары прай-меров способны выявлять около 1000 копий матрицы в 1 мл крови. Чувствительность и специфичность реакции оказались достаточными для обследования животных на наличие ДНК-провируса ВПК.
Те же 250 проб ДНК исследовали в ПЦР с праймерами, предназначенными для выявления ВЛК (таблица). Как видно из таблицы, во всех трех хозяйствах циркулируют оба рет-ровируса. Часть животных была инфицирована одним из этих агентов, в ряде случаев имела место смешанная инфекция, остальной скот не был ими заражен. В двух хозяйствах уровень инфицированное™ животных ВИК достигал 44 и 67 %, в третьем хозяйстве ировирус ВИК обнаружили только у 11 % обследованных животных. В целом из 250 исследованных проб положительный результат на наличие ВИК дали 100 (40 %), что в 1,5 раза ниже уровня инфицированное™ тех же животных вирусом лейкоза КРС (63,5 %).
Уровень инфицированности ВИК и ВЛК скота в трех хозяйствах Московской области (по данным ПЦР)
Рис. 1. Результаты исследования в ПЦР плазмиды pBIV127 и ДНК клеток FBL-BIV, хронически зараженных ВИК. Обозначения: 1 — маркер молекулярной массы; 2 — отрицательный контроль амплификации (Н20); 3 — ДНК, выделенная из неин-фицированной культуры клеток FBL с праймерами gag 1 — gag 2; 4 — ДНК, выделенная из инфицированной культуры клеток FBL с праймерами gag 1 — gag 2; 5 — плазмидная ДНК, содержащая клонированную провирусную ДНК ВИК с праймерами gag 1 — gag 2; 6 — отрицательный контроль амплификации (Н20); 7 — ДНК, выделенная из неинфицированной культуры клеток FBL с праймерами pol 1 — pol 2; 8 — ДНК, выделенная из инфицированной культуры клеток FBL с праймерами pol 1 — pol 2; 9 — плазмидная ДНК, содержащая клонированную провирусную ДНК ВИК с праймерами pol 1 — pol 2
Из цельной крови 250 голов КРС из трех хозяйств Московской области выделили пробы ДНК. На рисунке 2 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР проб ДНК, полученных из крови 16 животных, с парой праймеров gag 1 — gag 2. Четко видны положительные и отрицательные результаты реакции. При исследовании тех же образцов ДНК с парой подобранных праймеров pol 1 — pol 2 во всех случаях результат был отрицательным (данные не показаны).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
11 12 13 14 15 16 17 18 382 П.И.
№ хозяйства Число обследованных животных Положительная реакция, %
ВИК ВЛК
1 100 11 72
2 100 67 86
3 50 44 38
Итого 250 40 63,5
Рис. 2. Результаты исследования ДНК проб крови КРС в ПЦР с использованием праймеров gag 1 и gag 2.
Обозначения: 1 — отрицательный контроль амплификации (Н20); 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 —ДНК, выделенная из крови животных; 18 — положительный контроль (плазмида pBIV127, содержащая клонированную ДНК-провируса ВИК)
Следует отметить, что ДНК-провируса ВИК обнаруживали в пробах только с помощью праймеров gag 1 — gag 2, тогда как результат ПЦР с праймерами pol 1 - pol 2 всегда был отрицательным.
Заключение
Нами разработана тест-система ПЦР для идентификации ДНК-провируса ВИК в пробах крови КРС. Сконструированные видоспецифичные праймеры (gag 1 - gag 2, pol 1 — pol 2) согласно компьютерному анализу баз данных EMBL, GenBank и DDBJ обладали 100%-й гомологией с соответствующими фрагментами генов gag и pol прототипного штамма R-29 ВИК. Результаты тес-тарования плазмиды, содержащей полный геном ВИК, и культуры клеток, инфицированной этам агентом, подтвердили высокую чувствительность и специфичность обеих пар праймеров. С помощью сконструированной тест-системы ПЦР впервые удалось обнаружить ВИК в России. В трех обследованных скотоводческих хозяйствах Московской облаете уровень инфицированное™ этим ретровирусом колебался от 11 до 67 % (в среднем составлял 40 %). Это значительно выше, чем в большинстве других стран, где проводили подобные исследования.
В обследованных нами хозяйствах помимо ВИК циркулировал ВЛК.
Все пробы ДНК животных, признанные положительными в ПЦР с праймерами gag 1 — gag 2, дали отрицательные результаты с праймерами pol 1 — pol 2. Это означает, что ВИК, распространенный в обследованных хозяйствах, отдичается по гену pol от известных изолятов этого агента (в т.ч. R-29), нуклеотидную последовательность которых учитывали при подборе соответствующих праймеров. Структура соответствующего участка гена pol штаммов ВИК, циркулирующих на территории России, станет предметом дальнейшего исследования. Также предполагается изучить распространение данного ретровируса в хозяйствах различных регионов нашей страны, корреляцию распространенности ВЛК и ВИК, а также связь инфекции последнего с различными патологиями КРС.
Благодарности. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 05-04-08170 ОФИа. Авторы благодарят д-ра Е.А. Комарову (Кливленд, США) за помощь в подготовке к проведению этого исследования.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Cavirani S., Donofrio G., Chiocco G. et al. Seroprevalence to bovine immunodeficiency virus and lack of association with leukocyte counts in Italian dairy cattle. Prev Vet Med, 1998, 1, 37(1—4), 147—157.
РВЖ СХЖ №2-2006
19
2. Chadwick B.J., Coelen B.J., Sammeis L.M. et al Genomic sequence analysis identities Jembrana disease virus as a new bovine lentivirus. J Gen Virol, 1995, 76, 1, 189—192.
3. Cho K.O., Meas S., Park N.Y. et al.. Seroprevalence of bovine immunodeficiency virus in dairy and beef cattle herds in Korea. J Vet Med Sei, 1999, 61,5, 549—551.
4. Jacobs R.M., Pollar F.L., McNab W.B. et al. A serological survey of bovine syncytial virus in Ontario: associations with bovine leukemia and immunodeficiency-like viruses, production records, and management practices. Can J Vet Res,1995, 59, 4, 271—278.
5. Horzinek M., Keldermans L., Stuurmans L. et al. Bovine immunodeficiency virus: immunochemical characterization and serological survey. J Gen Virol, 1991, 72, 12, 2923—2928.
6. Meas S„ Ruas J., Farias N.A. et al. Seroprevalence and molecular evidence for the presence of bovine immunodeficiency virus in Brazilian cattle, J Vet Res, 2002, 50, 1, 9—16.
7. Muluneh A. Seroprevalence of bovine immunodeficiency-virus (BIV) antibodies in the cattle population in Germany. Zbl Veterinarmed В., 1994, 41, 10, 679—684.
8. Nash J.W.. Hanson L.A., St Cyr Coats K. Bovine immunodeficiency virus in stud bull semen. Am J Vet Res, 1995, 56, 6, 760—763.
9. Polack В., Schwartz I., Berthelemy M. et al. Serologic evidence for bovine immunodeficiency virus infection in France. Vet Microbiol, 1996, 48,1—2,165—173.
10. Usui Т., Meas S., Konnai S. et al. Seroprevalence of bovine immunode-
ficiency virus and bovine leukemia virus in dairy and beef cattle in Hokkaido. J Vet Med Sei, 2003, 65, 2, 287—289.
11. van Regenmortel M.H., FauquetC.M., Bishop D.H.L. et al. (Eds) Virus Taxonomy Classification and Nomenclature of Virus, Acad Press, San-Diego, 2000, 381—384.
12. van der Maaten M.J, Boothe A.D, Seger C.L. Isolation of a virus from cattle with persistent lymphocytosis. J Natl. Cancer Inst, 1972, 49, 6, 1649—1657.
SUMMARY
V.V. Kolotvin, A.V. Kapitonov, N.F. Grinenko, L.M. Piska-reva, G.V. Pashvykina, G.O. Shaihaev, A.D. Altstein, A.F. Va-likhov. Discovery of Bovine Immunodeficiency virus infec-tion in Moscow region.
First in Russia screening of cattle blood was carried out to detect bovine immunodeficiency infection. Polymerase chain reaction with selected pair primers to the gag gene was used and the infection was detected at three different farms (11, 44 and 67% of positive animals). High level of bovine leukemia virus infection (72, 38 and 38 %, correspondingly) was found in the same farms. Bovine immunodeficiency virus, detected in the study, was different from reference isolate R-29 by the pol gene.
iK 6 9 6 6 9931 Подтверждение предотвращения вертикальной передачи Neospora caninum у крупного рогатого скота посредством трансплантации эмбрионов
Дж.К. Лендманн, Tick Fever Research Centre, Queensland (Австралия) Д. Джиллелла, Embryo Transfer Services of Queensland (Австралия) П.Дж. О'Донохью, M.P. МакГован, University of Queensland (Австралия)
Ключевые слова: крупный рогатый скот, неоспороз, простейшие
Сокращения: КРС — крупный рогатый скот; Эм — эмбрионы); N.0. — N. саптит
N.0. впервые изолировали в 1988 г. [5]. Это простейшее оказалось важным этиологическим агентом аборта коров [4]. Экономическое значение неоспороза связано не только с абортами, но также со снижением молочной и мясной продуктивности у инфицированного КРС [3, 9].
Заражение КРС происходит горизонтальным путем через окончательного хозяина, роль которого выполняет преимущественно собака, или внутриутробно. Около 80 % приплода инвазированных М.с. коров рождается зараженными; они, в свою очередь, вертикально передают паразита потомству. Такой цикл повторяется в ряде поколений животных [6]. Недавно установили, что вакцинация КРС не исключает возможность внутриутробного заражения плодов М.с. 11]. До настоящего времени был известен единственный метод предотвращения вертикального распространения инвазии в стадах КРС — недопущение использования в племенных целях телочек, рожденных зараженными матерями. Однако такой подход ведет к потере большого количества генетически ценных животных. В условиях эксперимента трансплантация неинвазированным реципиентам Эм, полученных от зараженных М.с. матерей, не сопровождалась вертикальным рас-
пространением паразита [2|. В этом опыте канадские исследователи воспользовались процедурой, рекомендованной Международным обществом трансплантации Эм. Она предусматривает промывание Эм 5 раз раствором без сыворотки, 2 раза 0,25%-м раствором трипсина, приготовленным на сбалансированном солевом растворе Хенкса, и 5 раз раствором без сыворотки.
Мы провели аналогичный эксперимент, но Эм промывали более простым принятым в Австралии способом. Корову-донора голштино-фризской породы взяли из стада, принадлежавшего Квинсландскому университету. На этой ферме находилось 186 коров, из которых у 24 % в реакции непрямой иммунофлюоресценции [7] выявили антитела к М.с. в титре 1 :200. Все серопозитивные животные (за исключением двух) относились к 4 материнским линиям. Поскольку серо-негативных животных этих линий в стаде не было, то уровень вертикальной передачи Мс. составлял 100 %. Корова-донор Эм ранее родила 3 телок, которые со временем стали серопо-зитивными к М.с., и 1 раз абортировала на пятом месяце стельности. У плода обнаружили типичный для неоспороза негнойный энцефалит.
Из того же стада выбрали 4 коровы-реципиента Эм, сыворотка которых дала отрицательную реакцию в разведении I : 100 на наличие антител к М.с. Эструс у донора и реципиентов Эм синхронизировали введением во влагалище капсулы эстрадиола и интравагинального средства для контролируемого высвобождения прогестерона С1Г)К"(Сепе11с8, Австралия). СЛОЯ" удалили через 9 дней. На 8-й день коровам-ре-
